Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .13
1.1. Эффекторные белки и биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila 13
1.1.1. Биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila .15
1.1.2. Эффекторные белки L. pneumophila 18
1.2. Использование Saccharomyces cerevisiae как модели для изучения механизмов вирулентности легионелл и других патогенных микроорганизмов .24
1.3. Гликозилтрансферазы .30
1.4. Lgt – семейство цитотоксичных глюкозилтрансфераз L. pneumophila 33
1.5. Заключение .39
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1. Материалы 41
2.1.1. Реактивы для синтеза и модификации ДНК .42
2.1.2. Общелабораторные реагенты 42
2.1.3. Питательные среды и вещества 44
2.1.4. Олигонуклеотиды...45
2.1.5. Радиоактивные материалы...45
2.1.6. Лабораторное оборудование 45
2.2. Методы .47
2.2.1. Культивирование микроорганизмов .47
2.2.2. Выделение ДНК 47
2.2.3. Постановка ПЦР 47
2.2.4. Молекулярное клонирование фрагментов ДНК 53
2.2.5. Трансформация 57
2.2.6. Создание делеционных штаммов S. cerevisiae 58
2.2.7.Определение токсического фенотипа у дрожжей титрационным методом 62
2.2.8. Экспрессия рекомбинантных белков .62
2.2.9. Выделение фактора элонгации 1A из клеток S. cerevisiae .64
2.2.10. Экстракция белков из клеток S. cerevisiae 65
2.2.11. Получение поликлональных антител 65
2.2.12. Электрофорез в SDS полиакриламидном геле .66
2.2.13. Иммуноблоттинг .66
2.2.14. In vitro трансляция в системе S. cerevisiae 68
2.2.15. Определение ГТФазной активности 68
2.2.16. Реакция глюкозилирования 69
2.2.17. Статистическая обработка результатов 71
Глава 3. Результаты исследований 72
3.1. Глюкозилирующая активность Lgt1 в отношении нативного и обработанного трипсином белка EF1A S. cerevisiae 72
3.2. Субстратные свойства укороченных молекул фактора элонгации 1A 76
3.3. Идентификация нового субстрата фермента Lgt1 – белка Hbs1 85
3.4. Подавление белкового синтеза ферментом Lgt1 и его мутантными формами в системе S. cerevisiae .89
3.5. Создание коллекций штаммов S. cerevisiae, содержащих мутантные варианты фактора элонгации 97
3.6. Токсическое действие Lgt1 в генетически-сконструированных штаммах S. cerevisiae 100
3.7. Заключение .106
Глава 4. Обсуждение результатов .108
Выводы .119
Список использованной литературы 120
- Биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila
- Использование Saccharomyces cerevisiae как модели для изучения механизмов вирулентности легионелл и других патогенных микроорганизмов
- Реактивы для синтеза и модификации ДНК
- Субстратные свойства укороченных молекул фактора элонгации 1A
Введение к работе
Актуальность работы. Возбудителем тяжелого респираторного заболевания человека – легионеллезной инфекции, является грамотрицательная бактерия рода легионелла (Fields B., Benson R., et al., 2002). К настоящему времени известно 56 видов и 70 серогрупп легионелл, примерно половина, из которых патогенна для человека, но именно L. pneumophila серогруппы 1 является инфекционным агентом в 90% случаев заболевания легионеллезом в мире. L. pneumophila является вторым этиологическим агентом острой пневмонии, после Streptococcus pneumonia, и несмотря на удовлетворительные методы лечения легионеллеза, заболевание имеет высокий уровень смертности, который варьирует от 7 до 24% ( J., ., et al., 2013). Именно этот вид играет ведущую роль в этиологии пневмоний, имеет высокое медико-социальное значение и занимает приоритетное место в исследованиях, направленных на изучение вирулентности легионелл.
Легионеллы – факультативные внутриклеточные паразиты, которые активно размножаются в макрофагах, что приводит к разрушению последних и выходу большого количества бактерий во внеклеточную среду для заражения новых клеток. Многократное повторение цикла заражения клеток хозяина обуславливает накопление возбудителя в высокой концентрации и развитие острого воспалительного процесса. Совокупность факторов патогенности определяет характер взаимодействия бактерии с фагоцитирующей клеткой. Способность L. pneumophila формировать в клетке-мишени «репликативную вакуоль», в которой происходит размножение бактерии, и регулировать клеточные процессы, обусловлены наличием специализированной системы секреции IV типа Dot/Icm ( G., H., 1998; J. P., H. L., et al., 1998). Транспортная система L. pneumophila Dot/Icm представляет собой крупный мультибелковый комплекс, который кодируется 24 генами группы dot/icm ( G., J., et al., 1999). Патогенная бактерия продуцирует и доставляет в эукариотические клетки посредством данной системы секреции около 300 эффекторных белков (Segal G., 2013; Zhu W., Banga S., et al., 2011). Эти молекулы обладают высокоспециализированной биохимической активностью и воздействуют на различные клеточные процессы (везикулярный транспорт, метаболизм фосфолипидов, апоптоз, синтез белка и др.), за счет чего бактерия способна как создавать удобную нишу для пролиферации внутри эукариотической клетки, так и убивать ее. Определение функций эффекторов, поиск их мишеней и изучение взаимодействия с мишенью приводит к пониманию их роли в развитии инфекции, вызванной патогеном.
Первый эффекторный белок L. pneumophila, обладающий глюкозилирующей активностью, был выделен из штамма Philadelphia-1 и назван Lgt1 (Legionella glucosyltransferase 1) (Belyi Y., Popoff M., et al., 2003). Биоинформатический анализ геномов известных штаммов L. pneumophila, направленный на поиск новых глюкозилирующих эффекторов, показал, что патоген продуцирует и доставляет в клетку хозяина целое семейство гомологичных глюкозилирующих эффекторов, которые образуют три группы: Lgt1, Lgt2 и Lgt3 (Belyi Y., Tabakova I., et al., 2008). Доставку в клетку-мишень всех представителей глюкозилтрансфераз Lgt осуществляет система секреции L. pneumophila Dot/Icm (de Felipe K., Glover R., et al., 2008; Hurtado-Guerrero R., ., et al., 2010).
Определение кристаллической структуры фермента Lgt1 значительно способствовало характеристике механизма действия глюкозилтрансферазы, дало возможность выделить три структурных домена белка и отнести Lgt1 к глюкозилтрансферазам типа А (Hurdato-Guerrero R., ., et al., 2010; Lu W., Du J., et al., 2010). Как было показано, синтез ферментов клетками L. pneumophila подвержен строгому контролю (Belyi Y., Tabakova I., et al., 2008). Все глюкозилтрансферазы L. pneumophila модифицируют эукариотический фактор элонгации 1А и имеют единый сайт глюкозилирования – остаток серина в положении 53 (Belyi Y., Niggeweg R., et al., 2006). Эукариотический фактор элонгации 1А является одним из самых распространенных белков в клетке и неотъемлемым компонентом аппарата трансляции. Помимо своей основной роли в процессе синтеза белков, фактор элонгации участвует и во многих других жизненно важных клеточных процессах (Mateyak M., Kinzy T., 2010). Как было показано, в системе in vitro глюкозилтрансферазы Lgt ингибируют трансляцию, а интоксикация клеток млекопитающих ферментами приводит к цитотоксическому эффекту (Belyi Y., Niggeweg R., et al., 2006). В какой мере эти нарушения связаны с модификацией фактора элонгации 1А, остается неясным.
Таким образом, предшествующие исследования, проведенные в первую очередь совместно в лаборатории молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ и Университете Альберта-Людвига (Фрайбург, Германия), привели к значительному прогрессу в понимании различных аспектов функционирования глюкозилирующих эффекторов легионелл. В то же время работы, посвященные изучению субстратной специфичности Lgt и детальной характеристике фактора элонгации 1А как мишени L. pneumophila не проводились. Это послужило основанием для проведения настоящей диссертационной работы.
Цель диссертационной работы: выявление и характеристика мишени глюкозилтрансферазы Lgt1 L. pneumophila, модификация которой приводит к гибели эукариотических клеток.
В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:
осуществить анализ структуры эукариотического фактора элонгации 1А как субстрата, модифицируемого глюкозилтрансферазой Lgt1 L.pneumophila;
с применением компьютерных алгоритмов провести поиск новых потенциальных мишеней для глюкозилтрансферазы Lgt1 L. pneumophila и оценить уровень их субстратной активности в реакции глюкозилирования;
разработать модель для изучения токсического действия Lgt1 с использованием эукариотических микроорганизмов S. cerevisiae;
установить роль обнаруженных субстратов глюкозилирования в цитотоксическом эффекте Lgt1 на дрожжевой модели.
Научная новизна работы. Впервые показана особенность субстратной специфичности глюкозилирующего эффекторного белка L. pneumophila, заключающаяся в модификации фрагмента белка eEF1A, состоящего из 10 аминокислотных остатков – 50-GKGSFKYAWV-59. Впервые обнаружена новая мишень фермента Lgt1 – эукариотический белок Hbs1. Впервые была разработана модельная система дрожжей S. cerevisiae для изучения молекулярных механизмов интоксикации эукариотических клеток глюкозилтрансферазой Lgt1 L. pneumophila, а также других ингибиторов белкового синтеза бактериальной природы. С использованием данной модели было установлено, что глюкозилирование именно эукариотического фактора элонгации 1А является основным процессом, приводящим к цитотоксическому эффекту. Впервые показано, что аминокислотные остатки, входящие в распознаваемую Lgt1 область фактора элонгации 1А (фенилаланин-54, тирозин-56 и триптофан-58), необходимы как для нормального функционирования эукариотического фактора элонгации, так и для глюкозилирования белковой мишени ферментом легионелл.
Практическое значение работы. Разработана живая система на основе организма S. cerevisiae, позволяющая выявлять новые токсические факторы бактериальной природы, а также моделировать их взаимодействие с соответствующими эукариотическими субстратами in vivo. Разработанная модель может быть использована для поиска новых лечебных (антидотных) препаратов в отношении возбудителей опасных инфекционных заболеваний человека, а также токсинов. Выявление пептида – фрагмента фактора элонгации 1А, – может послужить основой для разработки аналога данного пептида, низкомолекулярного структурного ингибитора реакции глюкозилирования для подавления токсического эффекта Lgt на клетки млекопитающих. По результатам работы подготовлены Методические рекомендации «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 25 января 2013 г., протокол № 23.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Субстратами эффекторной глюкозилтрансферазы Lgt1 являются два эукариотических белка - фактор элонгации 1А eEF1A и Hbs1 - компоненты аппарата трансляции.
-
Участком узнавания и моноглюкозилирования ферментом Lgt1 возбудителя легионеллеза является декапептид с последовательностью GK(G/S)SFKYAWV.
-
Глюкозилирование эукариотического фактора элонгации 1А является основным процессом, приводящим к гибели клеток дрожжей под действием Lgt1. Аминокислотные остатки фактора элонгации 1А F54, Y56 и W58 являются необходимыми не только для узнавания ферментом белковой мишени, но и для выполнения основной функции eEF1A в клетке.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), 8-й международной конференции по легионеллезной инфекции (Мельбурн, Австралия, 2013).
Апробация работы состоялась 12.12.2013 на научной конференции отдела бактериальных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 научные статьи в издательствах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 128 источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 29 рисунками.
Биология внутриклеточного паразитизма L. pneumophila
L. pneumophila - это грамотрицательная подвижная палочковидная бактерия рода Legionella. Бактерия обитает в теплых пресных водоемах и является внутриклеточным паразитом некоторых простейших, например, амебы (Rowbotham T., 1980). L. pneumophila патогенна для человека и вызывает острую инфекционную пневмонию – легионеллез. Заболевание развивается после попадания в организм человека контаминированной воды из систем кондиционирования воздуха, водопроводной системы, а также при непосредственном попадании амебы, содержащей легионеллу (Muder R., Yu V., et al., 1986). Благодаря способности бактерии проникать и расти в клетках разных видов простейших, легионелла способна успешно инфицировать и размножаться в альвеолярных макрофагах человека (Isberg R., O Connor T., et al., 2009).
Движущей силой проникновения Legionella в хозяйскую клетку является естественный клеточный фагоцитоз. В результате фагоцитоза образуется вакуоль, содержащая Legionella. Чтобы избежать деградации вакуоли и создать удобную нишу для пролиферации бактерии, вакуоль претерпевает ряд изменений, превращаясь в органеллу похожую на везикулы ЭР (Рис. 1) (Hubber A., Roy C., 2010).
Созревание вакуоли, содержащей легионеллу (L. pneumophila-containing vacuoles (LCVs)), проходит за счет ее слияния с мембранными компонентами секреторного аппарата клетки-хозяина (Kagan J., Roy C., 2002). Через несколько минут после проникновения бактерии в клетку, вакуоль LCV притягивает к себе митохондрии и сливается с везикулами ЭР, на что указывает наличие на ней специфических для ЭР белков. В результате мембрана вакуоли LCV истончается и становится более похожей на мембрану везикул ЭР, чем на плазматическую мембрану (Tilney L., Harb O., et al., 2001). Через несколько часов после фагоцитоза, мембрана вакуоли LCV полностью состоит из мембранных компонентов шероховатого ЭР. Затем происходит инициация репликации бактерии внутри вакуоли, в которой поддерживается нейтральный pH (Wieland H., Goetz F., et al., 2004). Питательная среда вакуоли достаточно бедная, но содержит необходимое количество аминокислот и нутриентов для эффективного деления и размножения бактерии. В результате образуется вакуоль, содержащая множество клеток бактерий, которая ассоциирована с рибосомами и содержимое ее не подвергается закислению (Newton H. J., Ang D.K., et al., 2010).
Важнейшим шагом в развитии инфекции является способность внутриклеточного патогена покидать клетку хозяина после остановки его репликации для заражения новых клеток. Существуют факты, которые подтверждают наличие регуляции выхода легионеллы из инфицированной клетки (Newton H. J., Ang D.K., et al., 2010). Возможно, активация цитолизинов играет роль в формировании пор в мембране клетки и ее последующем лизисе. Бактерия способна использовать различные механизмы выхода из инфицированных клеток, в зависимости от природы организма хозяина и окружающих условий (Hubber A., Roy C., 2010).
Способность бактерии, заключенной во внутриклеточную вакуоль, регулировать клеточные процессы клетки-хозяина обусловлена наличием специфической системы. В случае L. pneumophila этой системой является система секреции IV типа (Dot/Icm система), которая представляет собой крупный мультибелковый комплекс (Segal G., Shuman H., 1998; Vogel J. P., Andrews H. L., et al., 1998; Segal G., Russo J., et al., 1999). Для эффективного формирования репликативной вакуоли и успешного внутриклеточного размножения L. pneumophila использует около 27 генов группы dot/icm (defect in organelle trafficking/ intracellular multiplication) (Vogel J. P., Andrews H. L., et al., 1998). Мутации в генах группы dot/icm приводят к неправильной сборке везикул ЭР на вакуоли. Большинство предполагаемых продуктов генов dot/icm гомологичны компонентам бактериального конъюгативного аппарата передачи ДНК (Komano T., Yoshida T., et al., 2000). При участии системы Dot/Icm L. pneumophila способна передавать генетический материал в другие бактериальные клетки, что указывает на возможность этой системы переносить макромолекулы в клетки-мишени. И действительно, система секреции Dot/Icm транспортирует в клетку хозяина более 270 эффекторных белков, включая белки, схожие с эукариотическими и способные участвовать в различных клеточных процессах (Newton H. J., Ang D.K., et al., 2010).
Использование Saccharomyces cerevisiae как модели для изучения механизмов вирулентности легионелл и других патогенных микроорганизмов
Изучение бактериальных эффекторов является важной задачей фундаментальной биологии и клинической медицины. Проблема исследования факторов вирулентности состоит с одной стороны, в сложности изучения генетики патогенов, а с другой, в необходимости изучения двух участников процесса: патогена и организма хозяина. К тому же, предсказание биохимической функции эффектора с помощью биоинформационного анализа не всегда является результативным, так как эффекторы редко проявляют гомологию с уже известными белками (Curak J., Rohde J., et al., 2009). Решением этой проблемы становится использование альтернативного «хозяина» - модельного объекта (Valdivia R. H., 2004).
За последнее время модельные организмы, используемые в качестве суррогатного хозяина, дали возможность получить новые данные о функциях, локализации и мишенях бактериальных эффекторов (Alegado R. A., Campbell M. C., et al., 2003; Botham C. M., Wandler A. M., et al., 2008). Модельными объектами могут служить как прокариотические, так и эукариотические организмы. При изучении патогенных бактерий могут быть использованы такие многоклеточные организмы, как Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster, которые восприимчивы ко многим инфекциям и способны имитировать некоторые этапы инфекционного процесса. Другой группой модельных объектов могут быть одноклеточные системы такие, как Dictyostelium и Acanthamoeba spp., удобные для изучения взаимодействия патогена с одной индивидуальной клеткой. Все более и более популярной моделью изучения отдельных факторов вирулентности становятся пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Valdivia R. H., 2004). Этот организм является удобной и популярной моделью для исследования таких бактериальных патогенов, как: S. flexneri, P. aeruginosa, Y. pestis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, L. pneumophila и S. enterica (Siggers K.A., Lesser C. F., 2008). Дрожжи S. cerevisiae обладают большим количеством преимуществ: их легко культивировать в лабораторных условиях, они легко поддаются генетическим манипуляциям, и уже более 50 лет дрожжи используют, как модельную систему для изучения эукариотических клеточных процессов (Siggers K.A., Lesser C. F., 2008). Многие биохимические процессы достаточно консервативны в дрожжах и клетках высших эукариот. К их числу относятся: метаболизм ДНК, запрограммированная клеточная смерть, контроль клеточного цикла, динамика цитоскелета и везикулярный транспорт. Так как именно эти молекулярные процессы часто являются мишенью действия бактериальных эффекторов, то дрожжевая система может быть использована для моделирования инфекции человека (Valdivia R. H., 2004). Показано, что только одна патогенная бактерия - Agrobacterium tumefaciens, способна направленно доставлять эффекторные молекулы в клетки дрожжей с помощью системы секреции IV типа (Piers K. L., Heath J. D., et al., 1996). Следовательно, в дрожжевой системе факторы вирулентности должны быть синтезированы de novo, что позволяет изучать такие патогены, которые сложно выращивать и с которыми трудно проводить генетические манипуляции. Синтез эффекторных белков в клетках дрожжей может приводить к различным проявлениям фенотипа, что в свою очередь, приводит к появлению гипотез о функциях и роли бактериальных белков в патогенезе (Siggers K.A., Lesser C. F., 2008).
S. cerevisiae - это первый эукариотический организм, чей геном был полностью секвенирован (Goffeau A., Barrell B. G., et al., 1996), и к настоящему времени появились данные о функциях продуктов более 75% генов из 6200 известных (Siggers K.A., Lesser C. F., 2008). Для S. cerevisiae существует детальная генетическая карта, которая описывает все известные взаимодействия генов, полная база данных о взаимодействии между белками и о внутриклеточной локализации всех известных белков дрожжей. В связи с этим к системе дрожжей применимы многие культуральные и молекулярно-генетические методы. Подавление роста дрожжей Изменение фенотипа дрожжевых клеток и подавление роста культуры при экспрессии бактериальных белков служит специфическим и чувствительным методом идентификации эффекторных белков. Для такой гетерологичной экспрессии используют специальные дрожжевые плазмиды. Существует несколько способов выявления нарушения роста дрожжевых клеток. Самый простой, и распространенный способ заключается в нанесении разведений исследуемой культуры дрожжей на твердую среду с индуктором (Lesser C. F., Miller S. I., 2001; Sisko J. L., Spaeth K., et al., 2006). Другой способ состоит в измерении оптической плотности суспензии при росте культуры дрожжей в жидкой среде с индуктором (Slagowski N. L., Kramer R. W., et al., 2008). Также подавление роста S. cerevisiae может быть зафиксировано с использованием красителей, которые определяют уровень аэробного дыхания дрожжей (Sisko J. L., Spaeth K., et al., 2006). Несмотря на все преимущества метода, он имеет ряд ограничений. Во-первых, возникает сложность при изучении эффекторов, которые подвергаются посттрансляционной модификации со стороны бактерии. Следовательно, при их синтезе de novo в клетках дрожжей, они могут быть нефункциональны. Во-вторых, экспрессия факторов вирулентности ингибирует рост дрожжей только при наличии мишени, которая гомологична мишени данного эффектора в клетках млекопитающих (Siggers K.A., Lesser C. F., 2008). В-третьих, существует вероятность выявления токсического действия со стороны бактериальных белков, которые участвуют в метаболизме микроба и влияют на клеточные процессы, которые консервативны в клетках дрожжей и бактерий (Campodonico E. M., Chesnel L., et al., 2005).
Реактивы для синтеза и модификации ДНК
Изопропил--D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) (Sigma, Италия); ампициллин (AppliChem, Германия); канамицин (AppliChem, Германия); генетицин (Invitrogen, США); D-глюкоза (Panreac, Испания); D-галактоза (Fluka, Германия); агар-агар (AppliChem, Германия); L-лейцин (Sigma, Италия), L-триптофан (Sigma, Италия), L-гистидин (Sigma, Италия), урацил (Sigma, Италия), аденин (Sigma, Италия); дрожжевой экстракт (Difco, США); бакто-пептон (Difco, США); ацетат калия KAc (Panreac, Испания); ацетат лития LiAc (Panreac, Испания); хлорид калия KCl (Panreac, Испания); хлорид магния МgCl2 (Panreac, Испания); хлорид марганца MnCl2 (Panreac, Испания); дигидрофосфат натрия (Panreac, Испания); 5-фтороротовая кислота (Fermentas, Литва); хлорид натрия NaCl (Panreac, Испания);Tris (Trizma base, Sigma, Италия); ЭДТА динатриевая соль (Serva, Герания); додецилсульфат натрия (SDS) (Sigma, Италия); глицерин (Fluka, Германия); трицин; глицин (GE Healthcare, Германия); бромфеноловый синий (Panreac, Испания); - меркаптоэтанол (Serva, Германия); фенилметилсульфонил фторид (PMSF, Sigma, Италия); дитиотреитол ДТТ (Fermentas, Литва); HEPES (AppliChem, Германия); ГДФ (Sigma, Италия); АТФ (Sigma, Италия); коэнзим А; люциферин (Promega, США); метанол; этанол; ацетон; гидроксид натрия NaOH (Panreac, Испания); фосфоенолпируват (Sigma, Италия); пируваткиназа (Sigma, Италия); сорбит (Sigma, Италия); мочевина (Panreac, Испания); трихлоруксусная кислота (ТХУ, AppliChem, Германия); бромистый этидий (Applichem, Германия); вода ASC (Panreac, Испания); полиэтиленгликоль PEG 4000 (Fluka, Германия); зимолиаза (AMS Biotechnology, Англия); имидазол (Panreac, Испания); восстановленный глутатион ( AppliChem, Германия); уксусная кислота; кумасси бриллиантовый голубой G-250 (Serva, Германия); бис-акриламид (AppliChem, Германия); персульфат аммония (AppliChem, Германия); N,N,N ,N тетраметилэтилендиамин (TEMED, Serva, Германия); Tween-20 (Bio-Rad, США); агароза (Sigma, Италия); сорбент Glutation – Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Германия); сорбент Nickel - Sepharose Fast Flow ( GE Healthcare, Германия); краситель Ponceau S (Carl Roth, Германия); сухое обезжиренное молоко (Carl Roth, Германия). Таблица 4. Буферные растворы, используемые в работе
Питательные среды, используемые при работе с дрожжевой системой S. cerevisiae: обогащенная глюкозой среда YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы), минимальная среда SD (0,67% дрожжевой среды с азотистыми основаниями и без аминокислот (Difco, США), 2% глюкозы), минимальная среда SGal (0,67% дрожжевой среды с азотистыми основаниями и без аминокислот, 2% галактозы). При приготовлении твердой среды добавляли 2% агара. Для тетрадного анализа использовали следующие среды: преспоруляционная среда (0,8% дрожжевого экстракта, 0,3% пептона, 10% глюкозы, 2% агара) и споруляционная среда (1% ацетата калия, 0,1% пептона, 0,05% глюкозы, 2% агара).
Для приготовления среды с 5-фтороротовой кислотой к 75 мл раствора, состоящего из 1,05 г минимальной среды SD, 3 г глюкозы, 0,15 г 5-фтороротовой кислоты, 7,5 мг урацила, добавляли 75 мл 4% агара. Добавки к среде S. cerevisiae: L-лейцин 40 мг/мл, L-триптофан 40 мг/мл, L-гистидин 40 мг/мл, урацил 2мг/мл, аденин 5 мг/мл (Sigma, Италия). Среды, глюкозу и галактозу стерилизовали автоклавированием при температуре 121С, давлении 2 атмосферы в течение 20 мин. Добавки стерилизовали с помощью мембранных фильтров. 2.1.4. Олигонуклеотиды
В ходе данного исследования использовалось следующее оборудование: камера для постановки электрофореза в агарозном геле «Bio-Rad» (США), амплификатор «Eppendorf» (Германия), ламинарный шкаф «Biocom» (Россия), камера для постановки электрофореза в полиакриламидном геле «Bio-Rad» (США), прибор для переноса белков «GE Healthcare» (Германия), спектрофотометры NanoVue Plus «GE Healthcare» (Германия), магнитная мешалка, шуттель-аппарат, холодильник на -70 «Sanyo» (Япония), холодильники «Sanyo» (Япония) и «Атлант» (Россия), термостаты «Eppendorf» (Германия) и «ДНК-технология» (Россия), центрифуги «Hermle, Jouan» (Германия), центрифуга с охлаждением «Hermle» (Германия), трансиллюминатор «Vilber lourmat» (Франция), фотокамера для съемки гелей «Vilber Lourmat» (Франция), фотокамера для детекции белка при постановки Вестерн-блот анализа «GE Healthcare» (Германия), УЗ прибор «Labsonic, Sartorius» (Германия), аквадистиллятор, автоклав «Tuttnauer» (Израиль), сухожарный шкаф, шейкер UNIMAX 1010«Heidolph» (Германия), термостаты на 30 и 37 градусов «New Brunswick Scientific», генератор льда «Scotman», водяная баня «Thermo scientific» (Германия), персональный компьютер, электропоратор «Eppendorf» (Германия), шейкер «Rotamax 120, Heidolph» (Германия), хроматографическая система FPLC AKTA«GE Healthcare» (Германия), колонка HisTrap HP (GE Healthcare, Германия), нитроцеллюлозная мембрана «Whatman» (Англия), оборудование для сушки геля «Bio-Rad Gel Dryer» (США), микроманипулятор для диссекции (Singen, Англия), световой микроскоп «Ломо микмед-1» (Россия), ДНК-амплификатор Sprint thermocycler (Hybaid, Россия), гомогенизатор высокого давления French Press (Heinemann, Германия), сканер для радиоактивных гелей Storm 820 «Molecular Dynamics» (Австриия), люминометр «Lumat LB 9507» (Германия); СО2 инкубатор, хемилюминисцентный детектор «Fujifilm» (Германия), автоматические микропипетки «Eppendorf» (Германия).
Используемые в работе штаммы E. coli выращивали на агаризованной или жидкой среде Luria-Bertani (LB) (Difco, США) в течение ночи при температуре 37С с добавлением селективного антибиотика. Среду стерилизовали автоклавированием при температуре 121С, в течение 20 мин. Затем, когда среда остывала, добавляли селективный антибиотик. В жидкой среде культивирование проводили на шуттель – аппарате при 200 оборотах платформы в 1 мин (“стандартные условия”).
Используемые в работе штаммы S. cerevisiae выращивали на агаризованной среде YPD, SD, SGal в течение 2-3 дней при температуре 30 оС. Культивирование исследуемых штаммов в жидкой среде YPD, SD, SGal проводили в течение ночи при температуре 30 оС. В зависимости от штамма S. cerevisiae при культивировании добавляли соответствующий маркер (гистидин, аденин, лейцин, триптофан, урацил или генетицин G418).
Выделение плазмидной ДНК из E. coli проводили набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Выделение ДНК из штаммов S. cerevisiae проводили набором Yeast DNA Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, США). 2.2.3. Постановка ПЦР
Метод ПЦР использовали для амплификации гена eef1a, в качестве матрицы использовали плазмиду с данным геном (Табл. 3), предоставленную доктором Кнудсен С.Р. (университет Орхус, Дания). Для амплификации COOH-укороченных вариантов гена eef1a в качестве матрицы использовали плазмиду р266. Для амплификации NH2- укороченных вариантов гена eef1a в качестве матрицы использовали плазмиду р331. Для переклонирования двух укороченных фрагментов гена eef1a из плазмиды pET28a в pGEX-4T2 их амплифицировали со следующих матриц: р356, р357. Для амплификации гена lgt1 в качестве матрицы для ПЦР использовалась бактериальная геномная ДНК L.pneumophila, выделенная феноловым методом (Sambrook J., Fritsch E.F. et al., 1989).
Субстратные свойства укороченных молекул фактора элонгации 1A
На основании полученных данных о возможности фрагмента фактора элонгации 1А служить эффективным субстратом для глюкозилтрансферазы Lgt1, было принято решение проанализировать субстратную активность делетированных вариантов фактора. Для амплификации и клонирования цельного гена eef1a и его фрагментов были синтезированы праймеры для ПЦР (табл. 5, см. Материалы и методы), а в качестве матрицы в реакции использовали плазмиду, содержащую цельный ген eef1a, и которая была любезно предоставлена нам доктором Кнудсен С.Р., Дания. Для обеспечения эффективной экспрессии гена eef1a, его клонировали в плазмиду серии pET28a .
Серия плазмид pET28 является наиболее распространенной для клонирования и экспрессии рекомбинантных белков в системе E. coli. Данная плазмида позволяет клонировать исследуемый ген в одной рамке считывания с полигистидиновой последовательностью (6хHis), которая позволяет выделять белок методом металл-аффинной хроматографии. При этом полигистидиновые последовательности взаимодействуют с ионами никеля или кобальта, иммобилизованными на хелатирующих сорбентах. Транскрипция клонированного гена находится под контролем лактозного промотора бактериофага T7, что позволяет регулировать продукцию рекомбинантного белка.
Полученная плазмида рET28-eef1a (p266) служила матрицей для создания плазмидных конструкций, кодирующих делетированные варианты белка eEF1А. В результате были получены плазмиды pET28-38 кД, pET28-29 кД, pET28-19 кД, pET28-10 кД, pET28-7 кД и pET28-5 кД (р328, р329, р330, р331, p356, p357) (табл. 7, см. Материалы и методы), которые кодировали фрагменты белка eEF1А с молекулярными массами: 38 кД, 29 кД, 19 кД, 10 кД, 7 кД и 5 кД соответственно. При этом фрагмент белка с молекулярным весом 29 кД соответствует I домену фактора элонгации 1А, который является G- доменом.
Полученные плазмиды были использованы для продукции соответствующих пептидов в экспрессирующей системе E.coli. Выделенные в чистом виде рекомбинантный белок eEF1A и его фрагменты были протестированы в реакции глюкозилирования в присутствии меченой УДФ-[14C] глюкозы. Как показано на рисунке 9, все полученные фрагменты служат субстратом для глюкозилтрансферазы Lgt1. Как оказалось, структурная организация I домена eEF1A не играет роли в модификации аминокислотного остатка серина в положении 53, так как даже пептид с молекулярным весом 7 кД, который представляет последовательность аминокислот в белке eEF1A в положении 29-73, эффективно глюкозилируется.
Субстратная специфичность фрагментов белка eEF1A. На рисунке представлен авторадиографический анализ реакции глюкозилирования ферментом Lgt1 фрагментов eEF1A в присутствии УДФ-[14С] глюкозы. На рисунке указан молекулярный вес каждого фрагмента и схематически изображена трехмерная структура каждого из них. Небольшими черными стрелками указано положение акцептора глюкозы – аминокислотного остатка серина 53.
Полученные данные находятся в соответствии с результатами исследований по частичному протеолизу дрожжевого фактора элонгации 1А, в которых фрагмент белка с молекулярным весом около 6,5 кД эффективно глюкозилировался ферментом Lgt1. На следующем этапе было решено проверить, может ли пептид с молекулярным весом менее 7 кД служить субстратом для Lgt1. С этой целью последовательности, кодирующие пептиды с молекулярным весом 7 кД и 5 кД, были переклонированы в плазмиду pGEX-4T, с образованием гибридных конструкций pGEX-7кД и pGEX-5кД (р402 и р403).
Особенность плазмид серии pGEX-4T состоит в возможности клонировать необходимые последовательности в одной рамке считывания с геном фермента глютатион S-трансферазы (GST). Это позволяет осуществлять очистку гибридных белков в один этап с использованием иммобилизованного на сефарозе восстановленного глютатиона за счет аффинного взаимодействия с ним глютатион S-трансферазы. Для получения гибридных плазмид, которые кодируют пептиды, состоящие из 10 аминокислотных остатков и менее, были использованы синтетические олигонуклеотиды (табл. 5, см. Материалы и методы). Комплементарные последовательности нуклеотидов образовывали двухцепочечные фрагменты ДНК, которые клонировали в плазмиду pGEX-4T. В результате была получена серия плазмид: pGEX-10a.о., pGEX-9a.о.-C, pGEX-9a.о.-N, pGEX-8a.о., pGEX-7a.о.-N, pGEX-6a.о.-N, pGEX-5a.о.-N, pGEX-8a.о., pGEX-7a.о., pGEX-6a.о., (p434, p485, p452, p453, p454, p457, p458, p455, p456, p459) (табл. 7, см. Материалы и методы). В числе этих плазмид те, которые кодируют пептиды, состоящие из 10, 9, 8, 7, 6 и даже 5 аминокислотных остатков, при этом все содержат аминокислоту серин, по которой происходит моно-О-глюкозилирование белка eEF1A. При этом генетические конструкции созданы таким образом, чтобы соответствующие рекомбинантные пептиды имели делеции аминокислот в полученных фрагментах как с СООН- концевой (“pGEX-Xa.о.-C”), так и с NH2- концевой (“pGEX-Xa.о.-N”) области пептида.
Полученные плазмиды были использованы для продукции рекомбинантных пептидов с последовательностью глютатион S-трансферазы в экспрессирующей системе E.coli. Хроматографическое выделение полученных рекомбинантных конструкций осуществляли с использованием сорбента Glutation – Sepharose Fast Flow согласно рекомендациям к использованию. Выделенные в чистом виде пептиды белка eEF1A были протестированы в реакции глюкозилирования ферментом Lgt1 в присутствии меченой УДФ-[14C] глюкозы. В табл. 9 представлены данные об эффективности модификации коротких пептидов- субстратов в реакции глюкозилирования. Как оказалось, уменьшение размера субстрата глюкозилтр ансферазы Lgt1 до 10 аминокислотных остатков не понижает эффективность реакции. Более того, модификация определенного декапептида 50GKGSFKYAWV59 происходит с большей эффективностью, чем фрагментов с весом 7 кД (45 а/к) и 5 кД (24 а/к). На основании этих данных уровень глюкозилирования декапептида был принят за максимум (100%) для сравнения с другими пептидами. Дальнейшее уменьшение размера пептида, менее 10 а/к, приводило к снижению способности фрагмента служить субстратом в реакции (табл. 9). При этом эффективность глюкозилирования субстратов зависела от определенных аминокислот декапептида. При делеции одного аминокислотного остатка валина в положении 59 в СООН - концевой области декапептида уровень модификации понижался примерно в 6 раз. Дальнейшее последовательное удаление аминокислотных остатков с СООН – концевой части пептида приводила к резкому снижению или отсутствию способности пептидов служить субстратом для Lgt1. При этом делеция аминокислотных остатков в NH2- концевой области декапептида меньше влияла на свойства субстрата. Так, отсутствие аминокислотного остатка глицина в положении 50 понижала уровень модификации только в два раза, и даже гексапептид 53-SFKYAW-58, в котором отсутствуют три аминокислоты в NH2- концевой области декапептида, все еще может выступать субстратом для глюкозилтрансферазы.
Интересная способность пептида фактора элонгации 1А, состоящего из 10 аминокислотных остатков, служить предпочтительным субстратом для Lgt1, чем более крупные пептиды, стало поводом для сравнения эффективности глюкозилирования следующих субстратов: полноразмерного дрожжевого eEF1A, рекомбинантного G- домена фактора элонгации млекопитающих, фрагмента eEF1A с молекулярным весом 5 кД с GST-последовательностью и декапептида 50-GKGSFKYAWV-59 с GST-последовательностью. Как показано на рис. 10, фермент Lgt1 модифицирует декапептид в 10 раз эффективнее, чем фрагмент весом 5 кД, и в 20 раз эффективнее, чем полноразмерный дрожжевой белок и рекомбинантный G-домен белка eEF1A млекопитающих.
