Введение к работе
Актуальность работы. Легионелла является грам - отрицательной бактерией, вызывающей острую тяжелую пневмонию – болезнь легионеров (B. S. Fields, R. F. Benson et al., 2002). Всего известно более 50 видов легионелл, для 22 из них доказана роль в инфекционной патологии человека. Более чем в 90% случаев заболевания основной возбудитель - Legionella pneumophila. Другие легионеллы - L. longbeachae, L. Bozemanii, L. dumoffii и L. micdadei - являются следующими по значимости этиологическими агентами легионеллеза, составляющие менее 10% легионеллезных инфекций в Европе и в США (Muder R.R., Yu V.L., 2002). В России вспышка легионеллезной пневмонии была зафиксирована на Среднем Урале в июле 2007 года в Верхней Пышме.
С инфицированным аэрозолем легионеллы попадают в легкие, где и происходит их контакт с клетками–мишенями. Бактерии активно размножаются в макрофагах, моноцитах крови и эпителиальных клетках, что приводит к накоплению возбудителя в высокой концентрации и развитию острого воспалительного процесса. Вслед за проникновением в клетку в составе фагосомы легионеллы индуцируют ряд нарушений процессов фагоцитоза такие, как подавление закисления содержимого фагосомы, предотвращение слияния фагосом и лизосом и формируют так называемые «репликативные вакуоли», где и происходит активное размножение возбудителя (Bozue J. A., Johnson W., 1996; T., T. et al., 2011; Horwitz M. A., 1983; Summersgill J. T., Raff M. J. et al. 1988). В завершении внутриклеточного цикла эукариотические клетки гибнут в результате индукции апоптоза или некроза, а микроорганизмы выходят во внеклеточную среду и вновь инфицируют фагоциты.
Сложный механизм взаимодействия легионелл с эукариотическими клетками говорит о вовлечении в процесс специализированных молекул, продуцируемых бактериями и направленных на определенные эукариотические мишени. Были выделены и охарактеризованы многочисленные факторы, которые потенциально могут участвовать в процессах взаимодействия бактерий и хозяина (низкомолекулярный цитотоксин, жгутики, белок теплового шока Hsp60, цитолизин – металлопротеиназа, фосфолипазы, фосфокиназы (Dowling J. N., Saha A. K. et al., 1992). Однако на сегодняшний день нет информации об эукариотических субстратах этих факторов, а данные об их участии в патогенезе инфекции противоречивы.
Значительный прогресс в исследовании механизмов патогенности легионелл был достигнут с использованием различных генетических подходов. В результате была показана важная роль нескольких генетических локусов и продуктов конкретных генов во внутриклеточной биологии возбудителя. К подобным продуктам относились белок Mip, PilD и система белковой секреции II типа, аргинин - зависимый транслокационный аппарат, жгутики IV типа, продукты локусов lvh, enh, mil, pmi и mak (., ., et al., 1995). Однако наиболее полно изучена система секреции IVB типа, известная как Dot/Icm (Aragon V., S. Kurtz A. et al., 2000; ., . et al., 1994). Этот секреторный комплекс участвует в биогенезе репликативных фагосом путем транспорта в клетку-мишень многочисленных белков-эффекторов, нарушающих нормальный эндосомальный путь в эукариотических клетках.
К группе новых факторов патогенности легионелл относится глюкозилтрансфераза Lgt1 – бактериальный фермент, модифицирующий фактор элонгации 1А и вызывающий гибель эукариотических клеток путем блокирования синтеза белка. Данный токсический фактор был впервые обнаружен и охарактеризован в лаборатории молекулярных основ патогенности ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Belyi I., Popoff M. R. et al., 2003). Предварительные данные говорили о возможности существования у легионелл и иных белков со сходной ферментативной активностью. Это послужило основанием для проведения настоящей диссертационной работы.
Цель диссертационной работы: идентификация и молекулярная характеристика новых глюкозилирующих ферментов L. pneumophila.
В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:
провести в базе данных секвенированных геномов легионелл поиск нуклеотидных последовательностей, предположительно кодирующих глюкозилирующие токсины;
клонировать, экспрессировать гены и получить рекомбинантные, очищенные, растворимые и биохимически активные глюкозилирующие ферменты;
исследовать биохимические и цитотоксические свойства полученных рекомбинантных белков легионелл;
исследовать продукцию глюкозилтрансфераз при росте Legionella pneumophila на питательных средах и в амебах.
Научная новизна работы. Впервые была обнаружена и охарактеризована группа глюкозилирующих эффекторных белков у возбудителя болезни легионеров, обладающих ферментативной активностью и блокирующих синтез белка, а также цитотоксической активностью на эукариотические клетки. Наряду с уже описанным ранее ферментом Lgt1 к этой группе относились вещества Lgt2 и Lgt3. Показано, что субстратом глюкозилирующих белков легионелл являлся эукариотический фактор элонгации 1А (eEF1A), компонент аппарата трансляции эукариотических клеток. Участком модификации eEF1A служил аминокислотный остаток серин в положении 53, глюкозилирование которого сопровождалось остановкой белкового синтеза и гибелью клеток млекопитающих. С использованием метода ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) впервые показано, что присоединение остатка глюкозы к серину-53 под действием фермента легионелл происходит с сохранением -конфигурации гликозидной связи, что позволяет отнести Lgt1 к семейству “Retaining glucosyltransferases” GT88 (). Впервые установлено, что продукция Lgt1 и Lgt2 осуществляется преимущественно в стационарной фазе роста микробной популяции, тогда как Lgt3 синтезируется в начальной фазе, предшествующей экспоненциальному росту культуры.
Практическое значение работы. Установлено, что гены, кодирующие белки Lgt1, Lgt2 и Lgt3, обнаруживались у представителей наиболее патогенного для человека вида – L. pneumophila. Эти результаты говорят о возможности использования данных белков и кодирующих их нуклеотидных последовательностей в качестве видоспецифических маркеров для индикации наиболее значимого в инфекционной патологии человека вида легионелл - L. pneumophila.
По результатам работы подготовлены Методические рекомендации «Способ выявления высоковирулентных штаммов легионелл», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 22 ноября 2012 г., протокол № 22 и «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные Советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России 25 января 2013 г., протокол № 23.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Показано, что белки, кодируемые 11 рамками считывания, обнаруженными среди пяти секвенированных геномов штаммов L. pneumophila, высокогомологичны глюкозилтрансферазе Lgt1 и образуют три семейства: Lgt1, Lgt2 и Lgt3.
2. Впервые показано, что глюкозилтрансферазы Lgt2 и Lgt3 L. pneumophila обладают глюкозилирующей активностью и блокируют белковый синтез путем модификации эукариотического фактора элонгации 1А в положении серин–53.
3. Впервые выявлено, что синтез ферментов клетками L. pneumophila подвержен строгому контролю. Глюкозилтрансферазы Lgt1 и Lgt2 вырабатываются бактериями в поздней стационарной фазе их роста in vitro в жидкой питательной среде и на поздней стадии взаимодействия с амебами in vivo в отличие от Lgt3, который определяется в культурах на ранней стадии роста in vitro и на ранних этапах взаимодействия с эукариотическими клетками.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Международной заочно – практической конференции «Современные вопросы науки и образования – XXI век» (Тамбов, 2012), на Международной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012), на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012), на Международной заочно – практической конференции «Биология, Химия, Физика: вопросы и тенденции развития» (Новосибирск, 2012).
Апробация работы состоялась 11.06.2013 на научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела бактериальных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 научные статьи в зарубежных изданиях, рекомендованных ВАК, а также опубликовано 4 тезисов.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 159 источников. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 28 рисунками.
