Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
Этиопатогенез генитальной формы герпесвирусной инфекции и некробактериоза крупного рогатого скота 11
Средства и методы лабораторной диагностики герпесвирусной инфекции и некробактериоза крупного рогатого скота 22
Особенности иммунитета при герпесвирусной инфекции и некробактериозе крупного рогатого скота. Средства и методы их специфической профилактики 27
Собственные исследования 42
Материалы и методы исследования 42
Результаты исследований 56
Особенности клинико-эпизоотологического проявления инфекционного баланопостита откормочных бычков смешанной этиологии 56
Выделение и изучение биологических свойств этиологических агентов, вызывающих инфекционный баланопостит откормочных бычков 61
Лабораторный регламент технологии изготовления вакцины 64
Изучение иммуногеннои активности ассоциированной инактивированной вакцины против инфекционного баланопостита откормочных бычков на лабораторных
. Изучение иммуногенной активности и эффективности ассоциированной инактивированнои вакцины против инфекционного баланопостита на откормочных бычках 81
Обсуждение результатов исследований 88
Выводы 99
Практические предложения 101
Список литературы 102
Приложения 134
- Средства и методы лабораторной диагностики герпесвирусной инфекции и некробактериоза крупного рогатого скота
- Особенности клинико-эпизоотологического проявления инфекционного баланопостита откормочных бычков смешанной этиологии
- Лабораторный регламент технологии изготовления вакцины
- Изучение иммуногенной активности и эффективности ассоциированной инактивированнои вакцины против инфекционного баланопостита на откормочных бычках
Введение к работе
"ЇЙІі" h
1.1. Актуальность темы. Основными задачами ветеринарной медици
ны и агробиологической промышленности являются обеспечение ветеринар
ной службы страны препаратами для профилактики, диагностики и терапии
болезней животных, расширение номенклатуры и объемов производства ле
карственных средств, создание современных производств по выпуску им
портозамещающих и конкурентоспособных на мировом рынке ветеринарных
биопрепаратов против инфекционных болезней животных [Непоклонов Е.А.,
2003].
Значительный экономический ущерб в ряде скотоводческих откормочных хозяйств Среднего Поволжья наносит инфекционный баланопостит, первичной этиологией которого является герпесвирус типа 1 крупного рогатого скота [Straub О.С., 1978; Андреев Е.В., 1979; Гаффаров Х.З., 1986], который осложняется разнотипной условно-патогенной микрофлорой. Гени-тальная форма болезни у коров и телок проявляется как инфекционный пустулезный вульвовагинит, у быков - в форме инфекционного баланопостита [Крюков Н.Н., 1970,1980].
В настоящее время эта инфекция диагностируется практически повсеместно [Закутский Н.И., 2000; Мищенко В.А., 2000; Нефедченко А.В., 2002].
Для специфической профилактики герпесвирусных инфекций крупного рогатого скота за рубежом и у нас в стране применяют живые и инактивиро-ванные вакцины, выпускаемые в виде монокомпонентных, ассоциированных и комбинированных препаратов. Однако эффективность их применения сильно варьирует в зависимости как от свойств биопрепарата, так и от состава осложняющей условно-патогенной микрофлоры.
Как свидетельствуют литературные данные [Коннов Н.М., Гаффаров Х.З., Равилов А.З. и др. 1980; Jensen R., Mackey D., 1977], закономерное выделение из биоматериалов больных баланопоститом бычков, наряду с гер-песвирусом типа 1, анаэробных бактерий, идентифицированных как F. necrophorum, позволяет говорить о нем как о постоянном сопутствующем осложняющем факторе этого заболевания.
В этой связи представляется весьма актуальной разработка ассоциированной вакцины против инфекционного баланопостита откормочных бычков на основе антигенов герпесвируса типа 1 и бактерий рода F. necrophorum, которая обеспечивала бы более эффективную защиту животных. Кроме того, введение в состав вакцины бактерий F. necrophorum, обладающих способностью вызывать гнойно-некротические поражения кожи, слизистых оболочек и подлежащих тканей, в конечном итоге приводящие к гибели животного, будет способствовать снижению частоты проявления этой патологии.
1.2. Цель и задачи исследований. Разработка ассоциированной инак-
тивированной вакцины против инфекционного баланопостита откормочных
бычков на основе антигенов герпесвируса типа-1 крупного рогатого скота и
РОС НАЦИОНАЛЬНА»
ІГСШ-
БИБЛИОТЕКА С.Г О»
бактерий F. necrophorum. Для достижения данной цели решали следующие задачи:
-
Изучить клинико-эпизоотологическис особенности проявления инфекционного баланопостита откормочных бычков в регионе Среднего Поволжья;
-
Выделить и изучить биологические свойства возбудителей инфекционного баланопостита откормочных бычков;
-
На основании результатов изучения этиопатогенеза и биологических свойств выделенных возбудителей инфекционного баланопостита бычков на откормочных площадках разработать технологию изготовления средства специфической профилактики, обеспечивающего эпизоотологическое благополучие скотоводческих хозяйств по данной инфекции;
-
Изучить иммунобиологические свойства вакцины, депонированной на основе гидроокисиалюминия и масляного адъюванта, провести оценку эффективности ассоциированной вакцины против инфекционного баланопостита откормочных бычков смешанной этиологии в лабораторных условиях;
-
Испытать профилактическую эффективность изготовленной вакцины в условиях хозяйств, стационарно неблагополучных по инфекционному баланопоститу смешанной этиологии;
-
Разработать нормативно-техническую документацию на ассоциированную вакцину против инфекционного баланопостита откормочных бычков смешанной этиологии.
13. Научная новизна работы. Впервые на основании клинико-эпизоотологических и лабораторных исследований показан смешанный характер течения и особенности проявления инфекционного баланопостита откормочных бычков этиологически обуславливаемого герпесвирусом типа 1 и бактериями рода F. necrophorum. Определен наиболее значимый в этиопато-генезе болезни возбудитель - бактерии F. necrophorum и изучены их основные биологические свойства.
Обоснованы технологические параметры изготовления ассоциированной вакцины против инфекционного баланопостита откормочных бычков на основе антигенов герпесвируса типа 1 и бактерий рода F. necrophorum.
Изучена динамика формирования иммунитета после одно- и двукратной вакцинации и подтверждена иммуногенная активность инактивирован-ной ассоциированной вакцины против инфекционного баланопостита откормочных бычков в лабораторных и производственных условиях.
1.4. Практическая ценность. Результаты исследований явились основанием для составления научно-технической документации:
- Временной инструкции по изготовлению и контролю «Ассоциированной вакцины против инфекционного баланопостита откормочных бычков, инактивированной эмульсионной»; jVfH * * ' to .
5.
Технических условий на «Ассоциированную вакцину против инфекционного баланопостита откормочных бычков, инактивированную эмульсионную»;
Временного наставления по применению "Ассоциированной вакцины против инфекционного баланопостита откормочных бычков, инактивирован-ной эмульсионной".
Нормативно-техническая документация одобрена Научно-методическим советом ВНИВИ (г. Казань) и утверждена Главным управлением ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан.
1.5. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:
научной конференции, посвященной 130-летию Казанской
государственной академии ветеринарной медицины, Казань, 2003 г;
международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, Ульяновск, 2003 г.;
международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ, Владимир, 2003 г.;
Всероссийской научно-практической конференции, КГАВМ, 2004 г.
1.6. Публикация результатов исследований. По теме диссертации
опубликовано 4 работы.
1.7. Основные положения, выдвигаемые на защиту:
научное обоснование целесообразности создания ассоциированной вакцины с учетом смешанного характера проявления инфекционного баланопостита откормочных бычков, обуславливаемого возбудителями вирусной и бактериальной природы;
лабораторный регламент технологии изготовления, контроля и применения ассоциированной вакцины;
результаты изучения иммуногенных свойств ассоциированной инактивированной вакцины против инфекционного баланопостита откормочных бычков в лабораторных и производственных условиях.
1.8. Объем и структура диссертационной работы. Диссертация из
ложена на 134 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор
литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных ис
следований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы,
практические предложения, библиографический список использованной ли
тературы (289 источников, в том числе 110 иностранных) и приложения. Ра
бота иллюстрирована 11 таблицами, 2 графиками и 2 рисунками.
Средства и методы лабораторной диагностики герпесвирусной инфекции и некробактериоза крупного рогатого скота
Лабораторные исследования по диагностике герпесвирусной инфекции включают в себя: а) выделение вируса из патологического материала в культуре клеток и его идентификацию в реакции вируснейтрализации (РВН) или реакции иммунной флуоресценции (РИФ); б) обнаружение антигенов ж вируса ИРТ в патологическом материале с помощью РИФ и ИФА; в) обнаружение специфических антител к вирусу в сыворотке крови больных и переболевших животных в РВН или РИГА (ретроспективная диагностика) (Иванов Г.А. и др., 1972; Егорова A.M. и др. 1991; Сюрин В.Н., 1991, 1998; Гончарова Л. В. и др., 1993). Официальные методы лабораторной диагностики ИРТ крупного рогатого скота установлены ГОСТом 25755-91. Метод выделения вируса заключается в выявлении цитопатического действия (ЦПД) вируса в культуре клеток с его последующей идентификацией. В качестве патологического материала от больных животных берут смывы со слизистых оболочек носовой полости, глаз, влагалища, препуция, а также пробы спермы. От вынужденно убитых и павших - кусочки носовой перегородки, трахеи, гортани, лёгких, селезенки, средостенные лимфоузлы. От абортированных плодов берут кусочки паренхиматозных органов и плаценты. Для выделения вируса могут быть использованы клетки первично трипсинизированной почки эмбриона коровы или овцы, почки теленка или овцы, тестикул бычка и их субкультуры, а также перевиваемые линии клеток ПТ-80, ПТ, МДБК, ТР, ПЭК. При этом проводят 3 последовательных пассажа вируса с интервалом 5-6 суток. Проба считается отрицательной, если в третьем пассаже не обнаруживается ЦПД вируса. ЦПД вируса в культуре клеток устанавливается по наличию округленных клеток, носящего в начале очаговый или диффузный характер с последующим отделением их от стекла. Индикацию вируса ИРТ проводят также по обнаружению специфических телец-включений, локализованных в ядрах клеток эпителия пораженных слизистых оболочек носовой полости, вульвы, влагалища и конъюнктивы. Они также обнаруживаются в окрашенной гематоксилином-эозином культуре клеток через 18-20 часов после заражения (Трофимов И.Т., Митрофанов П.М., Гаффаров Х.З., 1967; Сюрин В.Н., 1991, 1998;Wagner К. et al, 1982). Идентифицируют вирус с помощью реакции вируснейтрализации (РВН) в культуре клеток. Сущность метода заключается в нейтрализующем действии антител специфической гипериммунной сыворотки, подавляющей способность вируса вызывать ЦПД в культуре клеток. Для оценки результатов реакции вычисляют титр типируемого вируса в присутствии отрицательной и специфической сыворотки по методу Рида и Менча или Кербера, выражаемый в ТЦД 5 О/см3. Разность в титрах вируса с отрицательной и специфической сыворотками не менее чем на 2 логарифма свидетельствует о принадлежности возбудителя к вирусу бычьего герпеса типа 1. При разности от 1 до 2 логарифмов реакцию читают сомнительной, и ее необходимо повторить. При разности менее 1 реакцию считают отрицательной (СюринВ.Н., 1998). С целью экспресс-диагностики ИРТ применяют метод индикации вируса в патологическом материале с помощью радиоактивного Р32-ДНК-зонда, способного гибридизироваться (связываться) с комплементарным участком ДНК вируса ИРТ. Результаты учитывают по радиоавтографу на рентгеновской пленке. В настоящее время разработаны также новые более перспективные тест-системы на основе нерадиоактивных, меченных биотином ДНК-зондов (Глотов А.Г., 1997, 1999), Преимуществом данного метода является возможность оперативной диагностики заболевания при его острых вспышках, а также выявления латентной инфекции. Применение метода молекулярной гибридизации позволяет выявить ДНК вируса у животных независимо от сроков начала заболевания, его формы и из любого патологического материала, в том числе спермы быков-производителей (Глотов А.Г., 1996, 1999). Кроме РВН в культуре клеток для серологической идентификации вируса ИРТ применяются также методы ИФА, РИФ, РТГА (Гаффаров Х.З., 1983; Равилов А.З., Гаффаров Х.З., Гумеров В.Г., 2000; Нефедченко А.В., 2002). Широкое применение нашли также методы обнаружения антител в сыворотке крови больных и переболевших животных: РВН, РНГА, РДП, РТГА, ИФА, ИФА с использованием монАТ, аллергическая проба (Васильев А.В., 1980; Кузнецов Д.П. и др., 1990; Матковская С.Г., 1991; Гончарова Л.В. и др., 1993; Кузнецова СВ., Самуйленко А.Я. и др., 1995; Равилов А.З. и др., 1996; Гумеров ВТ., 2001; Bolton D.C. et al., 1981). Данные методы используются для серодиагностики и ретроспективной диагностики ИРТ КРС, определения уровня колостральных антител в сыворотках крови телят, определения оптимального времени первой вакцинации, контроля результатов вакцинации и определения уровня колостральных антител. Определение уровня антител к вирусу ИРТ с целью определения оптимального времени вакцинации, контроль результатов вакцинации и постановка предварительного диагноза являются одними из самых важных задач серологической диагностики данного заболевания. В настоящее время для решения этих задач наиболее часто используется реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), которая является относительно простым и надежным методом определения уровня специфических антител к вирусу ИРТ (Гончарова Л.В., Фукс П.П. и др., 1993; Равилов А.З., Гумеров В.Г., Галиуллин А.К., 1995).
В последние годы также успешно применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА), который является более дорогим и трудоемким, однако гораздо чувствительнее и надежнее, чем РНГА (Кузнецов Д.П. и др., 1990; Гумеров ВТ., 2001).
Некробактериоз диагностируют клинически на основании типичных признаков и поражений. При вспышке заболевания одновременно начинают хромать многие животные. Поражается одна или несколько конечностей животного, что сопровождается хромотой и опуханием. Межкопытцевая ткань опухает и омертвляется. Для установленной степени поражения копытец необходимо их тщательно зачистить и осмотреть. При хроническом течение некробактериоза артриты и экзостозы диагностируют с помощью рентгенографии. (Какоулин Т.Е. и др., 1997).
Болезненное мочеиспускание, опухание и покраснение препуция с вывернутой наружу слизистой являются важными клиническими признаками генитальной формы некробактериоза - некротического постита (Дженсен Р., Маккей Д., 1977).
Выявление обширного некроза путем тщательной пальпации или исследования препуцианальнои полости расширителем подтверждают диагноз (Ярцев В., Берников П., 1980).
Для лабораторного исследования берут материал на границе пораженной ткани. Из отобранных тканей делают мазки-отпечатки и окрашивают по Грамму, Муромцеву, Романовскому-Гимза или синькой Леф флера.
Высевы из патологического материала делают на среду Китта-Тароцци, амино-кровин-желточно-сывороточный (АКЖСА) или сывороточно-глюкозный агар (СТА). Одновременно с этим суспензией патологического материала заражают белых мышей или кроликов. На среде Китта-Тароцци рост появляется через 18-24 часа в виде помутнения с газообразованием. Ыа агаровых средах - через 48-72 час; на АКЖСА - в виде с серовато-белых врастающих колоний диаметром 1-2 мм, с зоной гемолиза эритроцитов; на СГА - в виде мелких росинчатых колоний, едва различимых на фоне среды.
Особенности клинико-эпизоотологического проявления инфекционного баланопостита откормочных бычков смешанной этиологии
В 2001-2003 годы нами были проведены эпизоотологические обследования 10 неблагополучных по инфекционному баланопоститу бычков хозяйств Республик Татарстан и Марий — Эл.
Инфекционный баланогіостит в обследованных хозяйствах регистрировали у откормочных бычков 6-20-месячного возраста. Клинически заболевание проявлялось воспалением, отеком, некрозом и вывертыванием препуция у быков, которые откармливались на площадке 100 и более дней. В отдельных случаях регистрировали заболевание у животных только что поступивших на откорм. Наиболее высокая частота заболевания приходилась на весенние и осенние месяцы и совпадала с периодом дождей и появлением грязи в загонах.
Так, в отделении "Алга" ОПХ им. Ленина Тюлячинского района Республики Татарстан в 1998-2002 гг., где содержались бычки на откорме 6-20 месячного возраста в количестве 600-800 голов, ежегодно наблюдался инфекционный баланопостит на фоне циркуляции среди поголовья герпесвируса типа 1 крупного рогатого скота. Частота заболевания колебалась от единичных случаев до 35% животных. Летальность пораженных животных не превышала ,1-5%.
Выяснилось, что быстрому перезаражению поголовья бычков, которые откармливались на площадке 100 и более дней, способствала безвыгульная технология выращивания и откорма, содержание в летне-осенние месяцы на плохо дренированных откормочных площадках, размещенных в низинах, а зимой - в помещениях, построенных из железобетонных конструкций, в условиях высокой влажности, зановоженности и большой скученности на ограниченной площади. Кроме того, при высокой половой активности бычков отмечался частичный травматизм половых органов, и тем самым создавались благоприятные условия для возникновения герпесвирусного баланопостита, осложненного бактериями рода Fusabacterium necrophorum. Заболевание принимало характер энзоотии и протекало в более тяжелой форме вследствие периодического вливания неиммунного поголовья, причиняя значительный экономический ущерб хозяйству. Бактерии этого рода, как известно, широко распространенны и повсеместно встречаются в навозе на откормочных площадках, обитают в пищеварительном тракте, на коже конечностей и туловища крупного рогатого скота. При попадании на поврежденные ткани они становятся патогенными и вызывают обширный некроз. При тщательном клиническом осмотре больных бычков было установлено, что первичный воспалительный процесс локализовался в препуции, где наблюдали отек и гиперемию слизистой оболочки. Затем на поверхности слизистой появлялись мелкие, а иногда довольно крупные (величиной с горох) бесцветные и розовые пузырьки, содержимое которых мутнело и они превращались в пустулы. После разрыва стенок пустул образовывались эрозии слизистой оболочки. На 3-5 день болезнь приобретала злокачественное течение. Патологический процесс с препуция распространялся вперед до мечевидного хряща и назад до лонного сращения тазовых костей, поражая подкожную клетчатку и мышцы брюшной стенки. Наступало флегмонозное воспаление, которое быстро распространялось по подкожной клетчатке. В начальных стадиях температура тела временно повышалась на один-два градуса. Отек и некротический процесс распространялся на большую часть слизистой как снаружи, так и изнутри. Мочеиспускание болезненное и осуществлялось с перерывами. При отсутствии лечения некроз охватывал весь препуциальный мешок и переходил на окружающую кожу живота. Рис. 1. Клиническое проявление инфекционного баланопостита у откормочного бычка Пораженные ткани издавали неприятный запах. Воспалительный процесс быстро прогрессировал и животные погибали на 2-4 день после начала флегмонозного воспаления, если своевременно не проводился курс этиотропного лечения. Продолжительность болезни колебалась от 5 до 7 дней. При генерализации инфекции признаки заболевания продолжались от 2-х до 3-х недель. При патологоанатомическом вскрытии павших животных обнаруживали изъязвления и участки некроза на слизистой оболочке головки полового члена и препуция. Некротическая масса была компактная и гомогенная. Межуточная ткань слизистой оболочки была разрыхленной, отечной и в инфильтрате преобладали сегментоядерные и эозинофильные лейкоциты. Кожа в радиусе 12-15 см вокруг отверстия препуциального мешка сильно утолщалась, а в диаметре 1,5-2,0 см некротизировалась. Подкожная клетчатка в области живота, начиная от мечевидного хряща до лонного сращения тазовых костей, и соединительно-тканная основа препуциального мешка были студневидно-отечны, желтоватого цвета. Отек подкожной клетчатки особенно сильно был выражен в области препуция, где скопление отечной жидкости приводило к утолщению ее в десятки раз. Отек распространялся на соединительно-тканную оболочку наружных паховых лимфатических узлов. Из внутренних органов изменения отмечались лишь в мочевом пузыре, слизистая оболочка которого была утолщена и отечна. С целью выяснения этиологии баланопостита в лабораториях вирусологии и биотехнологии ВНИВИ были проведены серологические, вирусологические и бактериологические исследования.
Исследованием 80 проб сывороток крови, взятых однократно от больных и переболевших животных, ;были выявлены нейтрализующие антитела в титре 1:4-1:8 и гемагглютинирующие антитела в титре 1:16-1:64 к антигену вируса инфекционного ринотрахеита.
При исследовании этих же сывороток крови в РНИФ были выявлены антитела против F. necrophorum в титрах 1:80-1:160.
При микроскопии мазков-отпечатков патологического материала обнаруживали грамотрицательные нитевидные палочки и нити с характерной зернистостью, морфологически типичные для возбудителя некробактериоза.
Все это свидетельствует о том, что в данном хозяйстве имеет место смешанная инфекция, вызванная на первом этапе вирусом инфекционного ринотрахеита и осложненная в дальнейшем - F. necrophorum.
Аналогичное заболевание с признаками поражения наружных половых органов наблюдали среди 60 откормочных бычков 8-12 месячного возраста в СПК им. Нариманова Лаишевского района РТ.
Заболевание у бычков характеризовалось отечностью и гиперемией слизистой оболочки головки пениса и препуция. У некоторых животных на слизистой оболочке обнаруживали участки, покрытые дифтероидными пленками фибрина. На поверхности слизистой отмечали появление мелких пузырьков, которые затем превращались- в пустулы. После разрыва стенок пустул образовывались эрозии слизистой оболочки.
У больных животных в области препуциального мешка появлялась тестоватой консистенции болезненная припухлость.
В осложненных случаях кожа вокруг отверстия препуциального мешка подвергалась изъязвлению, нагноению и некрозу. Животные постоянно переступали конечностями и стремились то правой, то левой задней ногой достать область препуция. Из препуциального мешка постоянно выделялись капельки мутной жидкости, содержащие отторгнутые клетки эпителия и хлопья гноя. У животных регистрировали повышение температуры тела до 41С.
Лабораторный регламент технологии изготовления вакцины
Результаты клинико-эпизоотологических, вирусологических и бактериологических исследований свидетельствуют о вирусно-бактериальной этиологии инфекционного баланопостита откормочных бычков в обследованных хозяйствах.
В связи с этим возникла необходимость создания средства для специфической профилактики инфекционного баланопостита на основе антигенов герпесвируса крупного рогатого скота типа 1 и бактерий Fusobacterium necrophorum.
С целью изготовления ассоциированной вакцины наработку биомассы герпесвируса крупного рогатого скота (штамм "ТКА-ВИЭВ-В2") проводили в перевиваемой культуре клеток трахеи эмбриона коровы (линия TR), выращенной в роллерных трехлитровых бутылях на комбинированной ростовой среде, состоящей из среды 199 - 10%, ГЛА - 40%, среды Игла МЭМ - 40% и сыворотки крови крупного рогатого скота - 10%. Культуру выращивали в течение 3-4 суток при посевной концентрации 140-150 тыс. клеток в 1 см среды. Ростовую среду сливали, вносили поддерживающую среду (среда 199 - 20%, ГЛА - 40% и среда Игла МЭМ - 40%) в количестве 350-370 см , в которую предварительно вносили вирус из расчета 10 см на 500 см среды, 3%-ный раствор глутамина - 5 см и антибиотики (стрептомицин и пенициллин по 100 ЕД/мл). Бутыли инкубировали в роллерной установке при 37-38С в течение 2-3-х дней. Сбор культуральной жидкости производили путем 3-х кратного замораживания и размораживания в период выраженного цитопатического эффекта - максимального накопления вируса. В полученную вирусную суспензию с целью инактивации вируса добавляли формалин с содержанием активного формальдегида 37-38% из расчета 0,5 см на 100 см суспензии, перемешивали и оставляли на 24-36 ч при комнатной температуре, после чего проверяли на бактериальную и грибковую контаминацию. Контроль полноты инактивации герпесвируса крупного рогатого скота проводили путем 3-х последовательных пассажей пробы инактивированной вирусной суспензии, используемой для изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против инфекционного баланопостита крупного рогатого скота, на перевиваемой культуре клеток трахеи эмбриона коровы (линия TR) с интервалом 5-6 суток. Вирусную суспензию считали инактивированной, если в третьем пассаже не обнаруживали цитопатическое действие вируса. Для изготовления вакцины использовали полевой штамм бактерий F.necrophorum "Л-2", выделенный из материала от больного баланопоститом быка в возрасте 18 месяцев, принадлежащего ОПХ им. Ленина Тюлячинского района Республики Татарстан. Штамм "Л-2", выращенный на среде Китта 66 Тароцци, представляет собой неподвижный, споронеобразующий, не имеющий капсул, грамотрицательный микроорганизм. Изолят продуцирует индол, превращает треонин и лактат в пропионат, образует сероводород, ферментирует глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, галактозу; не ферментирует адонит, дульцит, глицерин, инулин, сорбит, эритрит; патогенен для белых мышей и кроликов. При введении суточной бульонной культуры подкожно в область основания уха в объеме 1,0 см3, у кроликов на месте введения образовывается язва с некротическим распадом тканей. Животные гибли на 7-13 сутки с некротическими изменениями в месте введения и паренхиматозных органах. У белых мышей, зараженных суточной бульонной культурой подкожно в область спины в дозе 0,5 см , на месте инъекции развивался некроз кожи и подкожной клетчатки, поражались печень и почки. Гибель мышей наступала через 5-8 дней после заражения. Для выращивания Fusobacterium necrophorum в производственных целях использовали питательную среду на основе ФМПГ следующего состава: Ферментативно маточно-плацентарныЙ гидролизат 25-30% Дистиллированная вода 67-70% Хлористый натрий 0,5% Двузамещеный фосфат калия 0,2% Вазелиновое масло 0,4% Восемнадцати часовую культуру фузобактерий, штамм «Л-2», полученную в пробирках со средой Китта-Тароцци, пересевали в 1-2 литровые колбы с питательной средой на основе ФМПГ. Посевы инкубировали в термостате при 37С. Через 18 часов культивирования проверяли на чистоту роста культур окраской мазков по Граму. Полученный инокулят, типичный по морфологии для культуры фузобактерий некроза, использовали для засева в реактор, куда вносили через специальный кран с соблюдением правил асептики из расчета 3-4 литра расплодки на каждые 100 литров среды. Культуру выращивали при 37 С периодически перемешивая, а рост ее контролировали визуально (через смотровой люк), микроскопией мазков, замером оптической плотности и рН суспензии через каждый час культивирования. При необходимости проводили подщелачивание среды 20%-ным раствором натрия гидроокиси и подпитку растущей культуры стерильным 40%-ным раствором глюкозы. Культивирование останавливали, когда оптическая плотность суспензии на ФЭК-56 достигала значения 1,8-2,0. После окончания культивирования бактериальную суспензию передавливали в реактор-инактиватор, в который вносили формалин (с содержанием формальдегида не менее 36%) до 0,3% к общему объему бактериальной суспензии. Полноту инактивации контролировали высевами на питательные среды - МПА, МПБ, Китта-Тароцци и Сабуро. Инактивированную бакмассу концентрировали в промышленной центрифуге "ОТР-104" с соблюдением условий стерильности. Биологически активные антигенные компоненты из бактерий .и культуральной (надосадочной) жидкости извлекали раздельно по специальной методике, разработанной в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института.
Изучение иммуногенной активности и эффективности ассоциированной инактивированнои вакцины против инфекционного баланопостита на откормочных бычках
Проведенные нами опыты по изучению иммуногенности двух вариантов (ГОА и эмульсионной) ассоциированной вакцины против инфекционного баланопостита на кроликах показали, что биопрепараты обладают высокой антигенной активностью. Учитывая вышеизложенное, перед нами были поставлены следующие задачи: определить оптимальную иммунизирующую дозу вакцины и изучить ее профилактическую эффективность в одном неблагополучном по инфекционному баланопоститу бычков хозяйстве Лаишевского района РТ.
В опыте были использованы 36 откормочных бычков 8-10 месячного возраста. Животных разделили на 9 групп по 4 головы в каждой, из которых 1-8 группы были вакцинированы, а 9 группа была интактной.
Бычков с 1-3 групп вакцинировали 2-кратно ГОА вакциной в дозах 2,0; 5,0 и 8,0 см3 соответственно. Животных с 4-6 групп вакцинировали двукратно с интервалом 14 дней эмульсионной вакциной в дозах 1,0; 2,0 и 4,0 см соответственно.
Седьмую контрольную группу бычков вакцинировали коммерческой инактивированной вакциной против ИРТ крупного рогатого скота и восьмую контрольную группу животных - иммунизировали полиштаммовой формол эмульсионной вакциной против некробактериоза крупного рогатого скота, согласно наставлений по их применению. Животных девятой группы в количестве 4-х голов не вакцинировали ни одним из выше указанных биопрепаратов. Динамику накопления специфических антител к вирусу инфекционного ринотрахеита определяли в РНГА, а к возбудителю некробактериоза в РНИФ. Результаты клинических наблюдений за вакцинированными бычками показали, что ни у одного из них не наблюдалось повышение температуры тела после введения препаратов. Однако следует отметить, что при использовании масляной вакцины у животных привитых в дозе 4,0 см3 обнаруживали припухлость в месте инъекции, а в некоторых случаях образование абсцессов. Результаты серологических исследований крови представлены в таблице 10. Результаты показывают, что до вакцинации у откормочных бычков всех групп выявились антитела в титрах ниже диагностического уровня (1:4 — 2,0 log2 в РНГА к вирусу ИРТ и 1:20 - 3,0 log2 к F. necrophorum в РНИФ). Через 14 дней после первой вакцинации ГО А вакциной титры антител (М+т, п=4) у животных первой группы составили: к вирусу ИРТ 3,9+0,21 log2 и к F.necrophorum 4,7±0Д5 log2; титры антител у второй и третьей группы бычков были почти на одном уровне и составили соответственно: к вирусу ИРТ 4,2+0,14 log2 и 4,4+0,2 log2, а к F.necrophorum 5,2±0,24 log2 и 5Д±0Д8 log2, у животных из контрольных седьмой и восьмой групп были выявлены антитела к вирусу ИРТ в титре 2,7+0,22 log2 и к F.necrophorum 4,9+0,29 log2; титры антител у девятой контрольной (не вакцинированной) группы бычков составили: к вирусу ИРТ 1,8±0,11 log2, а к F.necrophorum 3,0+0,09 log2. При исследовании сывороток крови у животных вакцинированных эмульсионной вакциной на 14 день после первого введения препарата были выявлены антитела в титрах: у четвертой группы бычков к вирусу ИРТ 3,3±0Д8 log2, к возбудителю некробактериоза 3,7±0,26 log2; титры антител у пятой и шестой группы животных были на одном уровне и составил: к вирусу ИРТ 3,7+0,32 log2 и к F.necrophorum 4,3+0,27 log2. Максимальное накопление поствакцинальных антител у откормочных бычков вакцинированных как ГОА вакциной, так и эмульсионной происходит к 2 месяцам после повторного введения биопрепаратов. При этом титры антител у животных 1-ой группы составили: к вирусу ИРТ 5,93+0,24 log2 и к F.necrophorum 6,86±0,18 log2; титры антител у бычков 2-оЙ и 3-ей группы существенно не отличались и к вирусу ИРТ они были на уровне 6;32±0,27 log2 и 6,59+0,19 log2 соответственно, а к возбудителю некробактериоза 7,49±0,12 log2 и 7,67±0,26 log2 соответственно. Титры антител у животных 4-ой группы, вакцинированных эмульсионной вакциной, составили: к вирусу ИРТ 6,14±0,22 log2 и к F.necrophorum 7,31+0,34 log2; титры антител у бычков 5-ой и 6-ой группы были почти одинаковы и составили: к вирусу ИРТ 6,88+0,24 log2 и 6,97±0,18 log2, а к F.necrophorum 7,75±0,18 log2 и 7,78±0,21 log2 соответственно. Титры антител у животных 7 ой и 8-ой групп вакцинированные коммерческими вакцинами, составили: к вирусу ИРТ 6,83±0,18 log2 и к F.necrophorum 7,34+0,18 log2; титры антител у 9-ой контрольной (не вакцинированной) группы бычков к вирусу ИРТ и F.necrophorum практически не изменились и колебались в пределах диагностического уровня.
При исследовании сывороток крови у животных после шести месяцев (срок наблюдения) с начала вакцинации регистрировали значительное снижение (на 1,6-2,0 log2) антител к вирусу ИРТ и к возбудителю некробактериоза у бычков иммунизированных ГО А вакциной, а у животных вакцинированных эмульсионным вариантом препарата изменения этих показателей были незначительными (0,3-0,6 log2).
