Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы:
2.1. Формирование ассоциаций живых существ во внешней среде и организме животных. Их общебиологическое значение 11 -53
2.2. Значение ассоциации микроорганизмов в норме и патологии сельскохозяйственных животных и человека 54-88
2.3. Средства и методы борьбы с микробными ассоциациями, вызывающими патологические процессы в организме животных 89-105
2.4. Проблемы иммунопрофилактики инфекционных болезней конечностей сельскохозяйственных животных 106-135
2.5. Заключение 136-148
3. Собственные исследования
3.1. Материалы и методы исследований 149-153
3.2. Результаты исследований
3.2.1. Некоторые вопросы эпизоотологии некробактериоза крупного рогатого скота, некробактериоза и копытной гнили овец в различных зонах Российской Федерации 154-173
3.2.2. Выделение и идентификация патогенных и условно-патогенных микроорганизмов из поражённых конечностей при некробактериозе крупного рогатого скота, некробактериозе и копытной гнили овец 174-184
3.2.3. Изучение биологических свойств выделенных культур. Отбор штаммов для конструирования ассоциированных вакцин 185-241
3.2.4. Экспериментальное подтверждение полимикробной этиологии болезней конечностей крупного и мелкого рогатого скота на лабораторных животных и овцах 242-248
3.2.5. Определение оптимальных соотношений антигенов в ассоциированных вакцинах. Изучение конкуренции антигенов в организме животных, привитых ассоциированными вакцинами 249-255
3.2.6. Испытания опытных образцов ассоциированных вакцин против инфекционных заболеваний конечностей крупного рогатого скота и овец в неблагополучных хозяйствах.
3.2.7. Разработка методов контроля ассоциированных вакцин 280-288
3.2.8. Изучение некоторых параметров иммунитета при применении ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон» 289-322
3.2.9. Промышленная технология изготовления ассоциированных вакцин «Нековак» и «Овикон» 323-337
3.2.10. Испытания эффективности ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон» в производственных условиях. Разработка системы мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями конечностей крупного и мелкого рогатого скота 338-353
3.2.11. Обсуждение полученных результатов 354-381
4. Выводы 382-384
5. Практические предложения 3 85
6. Список литературы 386-430
7. Приложения 431 -470
- Значение ассоциации микроорганизмов в норме и патологии сельскохозяйственных животных и человека
- Проблемы иммунопрофилактики инфекционных болезней конечностей сельскохозяйственных животных
- Экспериментальное подтверждение полимикробной этиологии болезней конечностей крупного и мелкого рогатого скота на лабораторных животных и овцах
- Изучение некоторых параметров иммунитета при применении ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон»
Введение к работе
Актуальность темы. Эпизоотологические данные последних лет подтверждают тот факт, что инфекционные болезни конечностей крупного рогатого скота (КРС) и овец занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии этих видов животных в Российской Федерации (РФ), где наибольшее значение имеют некробактериоз и копытная гниль (Архангельский ИИ идр, 1986, Лайшев АХ и др , 1966, Walker PD et al, 1981) При болезнях конечностей пораженный орган постоянно контактирует с почвой и другими объектами окружающей среды, что приводит к его обильному обсеменению различной бактериальной флорой, к тому же одной из характерных особенностей анаэробных инфекций является одновременное ассоциативное воздействие на организм двух, трех и более видов анаэробных и аэробных микроорганизмов (Балтрашевич А К , 1979, Сидорчук А А и др , 2006, Katie RVetal,1976)
Многочисленные исследования по изучению этиологии некробакте-риоза КРС, некробакгериоза и копытной гнили овец подтверждают большую роль сопутствующей микрофлоры, которая существенно осложняет течение болезни, что подтверждается данными отечественных и зарубежных исследователей (Самоловов А А , 1988, Сидорчук А А и др , 2004, Banting A de L etal, 1978)
Так, неоднократно было установлено, что помимо основных возбу-)XWiQna\i(Fiisobaclermm necrophorum, Dichelobacter (Bacteroides) nodosus) в этнологии некробактериоза КРС, некробактериоза и копытной гнили овец определенную роль играет гнойно-раневая микрофлора Clostridium perfringens тип A, Staphylococcus aureus, Actinomyces (Corynebactenum) pyogenes и другие, которые формируют микробные ассоциации в природе и организме лсивотных, усиливая своими ферментативными системами действие основных возбудителей и тем самым увеличивая вирулентность последних в десятки раз (Сидорчук А А и др , 1996, Gorbach S L , Bartlett J S , 1974, Robeits D S , 1967) Реальным подтверждением указанных фактов явилось создание в ряде зарубежных стран ассоциированных вакцин против инфекционных болезней конечностей сельскохозяйственных животных Pietimam, Pietivac (Франция), Памавак (Югославия) В то же время, в связи с созданием крупных откормочных и молочных комплексов для КРС, закупкой и перемещением по стране большого количества племенного скота проблема некробактериоза встала особенно остро Так, по данным Караваева ТОД (1999 2003), заболеваемость некробактериозом в 1991г составила 13,5% от всех случаев инфекционной патологии у данного вида животных, а в посчедую-щие годы сохранялась устойчивая тенденция к росту заболеваемости КРС некробактериозом Результаты исследования Архангельского ИИ и др (1986), Кононова АН (2001, 2004), Самоловова А А (1993, 1997, 1998), Си-дорчукаАА идр (2002, 2003, 2006), СукееваШ С идр (1980, 1984) указывают на тот факт, что, несмотря на резкое снижение поголовья овец, некробактериоз и копытная гниль, как и раньше, являются одной из основных проблем в инфекционной патологии данного вида Так, в период с 1986 по 2003
гг ежегодная заболеваемость копытной гнилью и некробактериозом овец составляла до 190 тыс голов
Применение отечественных моновалентных вакцин против некробак-териоза КРС и копытной гнили овец не позволило полностью решить проблемы ликвидации некробактериоза и копытной гнили, хогя их использование позволяет значительно снизить заболеваемость животных В связи с вышеизложенным, конструирование вакцин против инфекционных болезней конечностей КРС (некробактериоз) и овец (некробактериоз и копытная гниль) на основе ассоциации анаэробных микроорганизмов {Fusebactenum necrophorum и Dichelobacter nodosus) и гнойно-раневой микрофлоры позволит более надежно профилактировать указанные болезни
Цель работы. Целью настоящих исследований было выяснение роли и значения ассоциаций анаэробных микроорганизмов F necrophorum и D nodosus и представителей гнойно-раневой микрофлоры в этиологии, патогенезе и профилактике инфекционных болезней конечностей КРС и овец, а также обоснование создания нового поколения средств специфической профилактики этих болезней
Задачи исследований.
-
Изучить особенности эпизоотологии некробактериоза крупного рогатого скота, некробактериоза и копытной гнили овец в различных зонах Российской Федерации и Республики Киргизия,
-
Выяснить видовой спектр микроорі анизмов при болезнях конечностей крупного рогатого скота и овец
-
Изучить биологические свойства изолятогов и провести отбор штаммов для конструирования ассоциированных вакцин,
-
Экспериментальным путем подтвердить значение ассоциаций микроорганизмов в инфекционной патологии конечностей крупного рогатого скота и овец,
-
Изучить иммунный ответ при применении ассоциированных вакцин, определить возможность конкуренции антигенов в организме животных, привитых ассоциированными вакцинами и разработать схемы их применения,
-
Разработать методы контроля и промышленную технологию изготовления ассоциированных вакцин,
-
Испытать эффективность ассоциированных вакцин в лабораторных и производственных условиях
Научная новизна. Установлены особенности эпизоотологии и клинического проявления инфекционных болезней конечностей КРС (некробактериоз) и овец (некробактериоз, копытная гниль) в различных природно-климатических зонах Российской Федерации и в Республике Киргизия Определен видовой спектр микроорганизмов при инфекционных болезнях конечностей КРС и овец Установлена и экспериментально подтверждена роль гнойно-раневой микрофлоры в ассоциации с анаэробными микроорганизмами F necrophorum и D nodosus в этиологии и патогенезе инфекционных болезней конечностей
Впервые в Российской Федерации разработаны и испытаны с положительными результатами две инактивированпые ассоциированные вакцины против некробактериоза конечностей КРС (запатентованные названия "Неко-вак", "Нековак-стимул", патент N 2098127 от 10 12 1997г) и инактивирован-ная ассоциированная вакцина против инфекционных заболеваний конечностей овец (запатентованное название "Овикон", патент N 2098128 от 10 12 1997г) Вакцины зарегистрированы Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ На препараты получены сертификаты соответствия
Разработаны методы контроля вакцин, промышленная технология их изготовления, методы оценки иммунитета у вакцинированных животных и схемы применения вакцин в неблагополучных хозяйствах, а также система мер по борьбе с некробактериозом и копытной гнилью
Теоретическая и практическая значимость работы.
Впервые в Российской Федерации разработаны и внедрены в производство инактивированные ассоциированные вакцины против некробактериоза конечностей КРС - "Нековак" и "Нековак-стимул", и инфекционных заболеваний конечностей овец - "Овикон" Серийный выпуск препаратов с 1995г налажен на Ставропольской биофабрике
Материалы разработки вошли в "Правила по профилактике и ликвидации некробактериоза животных", утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 11 07 2000 г №ВП 13 4 1313-00
Материалы диссертации вошли также в рекомендации "Диагностика, профилактика и меры борьбы при некробактериозе крупного ротатого скота" Рекомендации одобрены Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 21 02 2000 г, и в "Методические рекомендации по профилактике и борьбе с копытной гнилью овец", утвержденные РАСХН 22 марта 2004 г
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях Ученого совета ВНИИЭВ им Я Р Каваленко (1989-1991), заседаниях Ученого совета ФГУ ВГНКИ в 1992-2003 гг , заседании пленума секции паразито-ценологии АН СССР (г Витебск-,1988), на Всесоюзной научной конференции "Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов" (г Москва, 1991) на заседании Государственной межведомственной комиссии по испытанию ветбиопрепаратов при Департаменте ветеринарии МСХ и П РФ в 1993 году, на заседании научно-проблемной методической комиссии по контролю и стандартизации биопрепаратов, применяемых при бактерийных и грибковых болезнях животных (ФГУ ВГНКИ, 1995), на Всероссийской научной конференции, посвященной 70-летию факультета ветеринарной медицины Воронежского государственного аграрного университета им КД Глинки (г Воронеж, 1996), на заседании Ветфармбиокомиссии при Департаменте ветеринарии МСХ и П РФ (1997); на Международной конфереции, посвященной 30-летию Прикаспийского ЗНИВИ (г Махачкала, 1997), на методической и научной конференции МГАВМиБ ( г Москва, 2001), на Международной конференции ветеринарных специалистов по борьбе с инфекционными заболеваниями с/х животных (Республика Болгария, г Апрельцы, 2003)
Основные положения, выносимые на защиту:
- Результаты изучения особенностей эпизоотологии и клинического проявления инфекционных болезней конечностей КРС и овец в различных природно-климатических зонах Российской Федерации и Республики Киргизия
Результаты изучения видового спектра микроорганизмов при инфекционных болезнях конечностей крупного и мелкого рогатого скота и биологических свойств выделенных изолятов
Теоретическое обоснование разработки инактивированных ассоциированных вакцин против некробактериоза крупного рогатого скота "Неко-вак" и "Нековак-стимул" и против инфекционных заболеваний конечностей овец "Овикон"
Промышленная технология изготовления ассоциированных вакцин "Нековак" и "Овикон"
Практическая эффективность вакцинации крупного рогатого скота против некробактериоза и овец прошв инфекционных болезней конечностей при применении ассоциированных вакцин
Оценка некоторых факторов клеточного и гуморальною иммунитета при применении ассоциированных вакцин
Система применения ассоциированных вакцин "Нековак" и "Нековак-стимул" и «Овикон» в неблагополучных хозяйствах
Публикации По материалам диссертации опубликовано в печати 48 научных работ в различных изданиях, в которых изложены основные положения и выводы по изученным вопросам, в том числе 2 монографии ,2 патента РФ на изобретения и авторское свидетельство №1835295
Объем и структура диссертации. Диссертация написана на 430 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов введения, литературного обзора, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и содержи і 67 таблиц, 4 графика, 17 фотографий Список литературы включает 517 отечественных и зарубежных источников Приложение к диссертации в объеме 40 страниц содержит документацию, подтверждающую диссертационный материал
Значение ассоциации микроорганизмов в норме и патологии сельскохозяйственных животных и человека
Л.Пастер (451) приписал антагонистическое действие аэробных бактерий на микробов сибирской язвы потреблению кислорода аэробами. Неблагоприятное действие обычной крови на рост сибирской язвы, как предполагалось, зависит от борьбы за кислород с красными кровяными тельцами. Он рассматривал антагонизм между палочкой синего гноя и бациллами сибирской язвы как результат исчерпания пищевых веществ первой из них. Вскоре было признано, что эта проблема является более сложной и касается не только исчерпания пищевых веществ. В качестве объяснений были предложены изменения поверхностного натяжения, окислительно-восстановительного потенциала, реакции среды и осмотического давления (169-171; 311). В качестве классического примера действия реакции среды на рост других микробов можно привести подкисление молока молочнокислыми бактериями (159; 485). И.И.Мечников подчеркнул тот факт, что болгарская палочка действует антагонистически на других микробов не только путем образования молочной кислоты, но также и в результате выделения ею специальных веществ. Образование бактериями щелочных продуктов, вредно действующих на рост других микробов, также отмечалось в литературе (159; 499). Как оказалось, эти вещества являются аминосоединениями, освобождаемыми в процессе распада клеток. Многочисленные другие физические и физико-химические факторы влияют на рост микробов в искусственной среде. Следует напомнить, что существование бактерий в воде и в соляных растворах в сильнейшей степени зависит от присутствия коллоидов (515), концентрации электролитов (389), реакции среды (507) и температуры (36; 448; 449).
В связи с этим, явления антагонизма по С.В Павловичу и др. (177; 430) рассматривались, главным образом, с точки зрения действия физических факторов, в том числе электромагнитных излучений, изменений концентрации водородных ионов электропроводности, электрических зарядов и поверхностного натяжения.
Однако, в большинстве случаев антагонистическое действие может быть объяснено образованием токсических веществ. Вследствие термолабильности, чувствительности к химическим реактивам или адсорбции их на бактериальных фильтрах изолировать эти вещества было весьма трудной задачей. Многие из них оказались изоантагонистическими аутотоксинами (509; 512), тогда как другие обнаруживают способность действовать на различных бактерий. Многие из этих веществ показали себя термостабильными.
Первым признанным антибиотическим веществом была пиоцианаза (512), растворимая в спирте, эфире и хлороформе. Сходные вещества, как обнаружилось, образуются Serratia marcescens (376), P. fluorescens (434), В. mesentericus (434) и В. mycoides. В то время, как одни исследователи рассматривали пиоцианазу как протеолитическии энзим, другие считали, что она представляет собой липоид (400). В последующем были изолированы многочисленные новые вещества.Например, образуемые В. brevis грамицидин и ти-роцидин, которые являются полипептидами; цитринин и фумигатин, обладающие хиноновой природой; актиномицин, аспергилловая кислота и иоди-нин, являющиеся циклическими азотистыми соединениями; глиотоксин, содержащий серу; стрептотрицин, стрептомицин и проактиномицин, являющиеся азотистыми основаниями. Пенициллин - органическая кислота, структурная формула которой уже установлена. Некоторые микробные пигменты (пиоцианин, гемипиоцианин, продигиозин ) также изучались как бактерио-статические и фунгистатические агенты.
Образование антибиотических веществ различными микробами в сильнейшей степени зависит от реакции среды, температуры, аэрации и от наличия других микробов. До сих пор нет доказательств способности этих веществ накопляться в почвенных условиях и в воде. Неизвестно также, могут ли организмы в естественных условиях преодолевать действие антибиотических веществ (396; 509-512).
Различные микробы обладают различной силой и различным механизмом антагонизма. Иногда один организм может полностью остановить рост другого организма. Однако впоследствии рост может возобновиться, хотя он и не будет вполне нормальным. Антагонизм может стимулировать образование спор и приводить к ненормальному росту мицелия у грибов или к образованию гигантских клеток у бактерий. Уродливые изменения у Alternaria и у
Helminthosporium (456) вызываются антагонистической бактерией. Морфологические изменения, вызываемые антагонистами, состоят в изменении формы, величины и строения гиф, направления роста и т.п..
Обозревая явления антагонизма у микробов, S.A.Waksman (512) пришел к заключению, что среди бактерий споровые формы являются мощными антагонистами. Актиномицеты также проявляют сильное угнетающее действие в отношении многих видов. Фикомицеты обычно не вызывают угнетения других микробов и не угнетаются сами. Среди базидиомицетов лишь очень немногие способны действовать антагонистически. Сумчатые и несовершенные грибы резко отличаются один от другого в отношении способности создавать антибактериальные вещества; некоторые дрожжи являются мощными антагонистами. Часть водорослей, в особенности виды рода Chlorella, вырабатывает вещество (хлореллин), которое подавляет рост различных грам-положительных и грам-отрицательных бактерий (387; 456).
Проблемы иммунопрофилактики инфекционных болезней конечностей сельскохозяйственных животных
Данные последних лет подтверждают, что болезни конечностей сельскохозяйственных животных, по-прежнему, занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии этих видов в России, где наибольшее значение имеют копытная гниль и некробактериоз (3, 15, 18,20, 119, 133, 164, 203, 229, 254,502,514).
Как указывалось выше, часто эти болезни протекают одновременно, т.к. при болезниях конечностей пораженный орган постоянно контактирует с почвой и другими предметами окружающей среды, что приводит к его обильному обсеменению различной бактериальной флорой. К тому же, одной из характерных особенностей анаэробных инфекций является одновременно ассоциированное воздействие на организм двух, трех и более видов анаэробов и аэробов. По мнению ряда исследователей, решающее значение при копытной гнили овец и некробактериозе КРС (межпальцевом дерматите крупного рогатого скота) имеют не столько отдельные возбудители Dichelobacter (Bacter-oides) nodosus, Fusobacterium necrophorum, сколько ассоциация анаэробных микроорганизмов: фузобактерий, бактероидов, клостридий, спирохет, анаэробных кокков с факультативными аэробами, т.е. наблюдается явление синергизма (26, 38, 120, 123, 125, 127,130, 131, 132, 153, 221, 225, 238, 244, 251, 260, 265,276,292, 404,446, 447, 460,483, 498).
По данным большинства исследователей, D. nodosus и F. necrophorum являются главным этиологическим фактором возникновения соответственно копытной гнили, некробактериоза и заболевания, вызываемого ассоциацией указанных микроорганизмов, рассматривая другие сочлены возможной ассоциации (гнойно-раневую микрофлору) в качестве отягчающих факторов, способствующих распространению в организме двух вышеуказанных микроорганизмов (289, 315, 317, 323, 324, 335, 342-350, 405, 414, 416, 423, 424, 437, 438, 462-466,472, 477,482,493).
Как указывалось в Главе 2.2., авторы следующим образом раскрывают синергетический тип воздействия сочленов указанной ассоциации: при воздействии факторов внешней среды в мацерированную кожу свода межкопытной щели внедряется ассоциация микроорганизмов D. nodosus, A.pyogenes. Эти микроорганизмы являются эластолитиками, выделяя сильные протоли-тические ферменты, осуществляющие протеолиз окружающих тканей. Расплавленные протеины являются питательной средой и стимулятором роста для других бактерий, проникших в область первичного поражения, особенно для F.necrophorum, часто встречающегося в желудочно-кишечном тракте здоровых животных и окружающей среде. Размножение F.necrophorum вызывает сильное воспаление и тканевую деструкцию прилегающих тканей, при этом выделяется сильный экзотоксин лейкоцидин, угнетающий фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов организма животных, что, в свою очередь, облегчает размножение и распространение в тканях копыт D .nodosus и другой гнойно-раневой микрофлоры. Таким образом, данная синергетическая ассоциация микроорганизмов подавляет защитные силы организма животного и способствует тяжелому злокачественному течению копытной гнили и некробактериоза (203,357,397,463,464, 482, 483,493).
Со времени открытия возбудителя некробактериоза Р. Кохом в 1881 г. и возбудителя копытной гнили овец W. Beveridge в 1938-1941 гг., многочисленными исследователями изучался иммунитет при некробактериозе и копытной гнили и предпринимались попытки создания средств специфической профилактики указанных инфекций (324, 325).
Долгое время иммунитет при инфекционных болезнях конечностей оставался недостаточно изученным. Трудность изучения заключалась в том, что инфекционные болезни конечностей, как правило, носят местный характер, поражения чаще локализуются поверхностно в области межкопытной щели или в области венчика копыта и дистальных частей конечностей, включая суставы и связки (за исключением генерализованной формы некробактерио-за). В результате сильной воспалительной реакции, которой реагирует организм животного на воздействие сложившейся патогенетической ассоциации микроорганизмов при инфекционных болезнях конечностей, в местах локализации поражений образуется гнойно-некротический барьер, который препятствует проникновению в кровяное русло достаточного количества микробных клеток возбудителей заболеваний для выработки напряженного иммунитета. Поэтому естественное переболевание некробактериозом и копытной гнилью не вызывает у животных напряженного продолжительного иммунитета. Этим фактом, отчасти, объясняются случаи массовых рецидивов среди переболевших животных (257, 340,357-359, 460).
Вышеприведенные факты долгое время не позволяли исследователям получить объективные данные о характере иммунитета при инфекционных болезнях конечностей и перспективах создания средств их специфической профилактики.
В начале 30-х годов 20-го века и в последующие годы в СССР после выяснения этиологической роли бактерии некроза и ее ассоциаций с другими микроорганизмами в заболевании конечностей северных оленей и других видов сельскохозяйственных животных (75, 98, 99, 162, 163, 238-241) были проведены первые исследования по изучению иммунитета и созданию средств специфической профилактики. Так, Ф.И. Каган и Я.Р.Коваленко (100, 101) в опытах искусственной иммунизации при экспериментальном некробациллёзе лабораторных животных, подведя итоги, сделали следующие выводы о том, что методами вакцинации животных культурами, убитыми нагреванием формалином, антиформином, бриллиантгрюном, культурами, ослабленными длительным выдерживанием в термостате, фильтратами культуральных жидкостей, «антивирусами» и другими препаратами, исісусственного иммунитета получить не удалось. Безрезультатной оказалась также и пассивная иммунизация сывороткой от гипериммунизированных телят (115, 162-164, 241). Исследования Ф.И.Каган и Я.Р.Коваленко подтвердили ранее проведенные исследования Е. Cesari и др. (333), которые безуспешно пытались иммунизировать кроликов анатоксином бактерии некроза, инактивированным спирт-эфиром. С.Н. Муромцев и Л.С. Новикова (162) в 1935 г. после трехкратной иммунизации овец живой культурой В. necrophorum не установили образования у них иммунитета.
После этих исследований на долгие годы в научной среде возобладало мнение о невозможности создания средств специфической профилактики инфекционных болезней конечностей сельскохозяйственных животных, несмотря на отдельные успешные исследования в этой области.
Экспериментальное подтверждение полимикробной этиологии болезней конечностей крупного и мелкого рогатого скота на лабораторных животных и овцах
В засушливой зоне, где расположен совхоз «Терский», была отмечена та же зависимость уровня заболевания животных от сезона года: наибольшая (до 20,4%) - в зимне-весенний период, наименьшая (до 3,6%) - в летне-осенний период, что также связано с наличием или отсутствием предрасполагающих факторов для распространения инфекционных заболеваний конечностей овец. В условиях Ставропольского края, по нашим данным, что соответствует результатам исследования Кононова А.Н. (119-125), чаще болеют овцы, чем бараны, однако, у баранов-производителей заболевание протекает более тяжело. Среди ягнят до 3-4-х месячного возраста, даже при их совместном содержании с больными овцематками, копытная гниль регистрировалась в единичных случаях. Это связано с эластичностью копытного рога ягнят, отсутствием трещин и заломов копыт и отсюда меньшей подверженностью влияния предрасполагающих факторов внешней среды. В двух маточных отарах опхоза «Темнолесский» и одной отаре колхоза «им. Войтика», отмечено очень тяжелое клиническое проявление заболеваний конечностей овец (так называемая злокачественная форма), которое характеризовалось поражениями не только в области копытец с отслоением рогового башмака, но и наличием язв и свищей в области венчика, путового сустава, наличием гнойных тендовагинитов и бурситов. Конечности животных с такими поражениями были отечными, местная температура повышена, животные на такие конечности не опирались, держали их на весу. В этих отарах у новорожденных и ягнят до трехмесячного возраста были отмечены случаи некротических поражений слизистой оболочки ротовой полости. Очевидно, в указанных хозяйствах имело место инфекционное заболевание конечностей овец, вызываемое ассоциацией микроорганизмов, что впоследствии подтвердилось микробиологическими исследованиями патматериала и постановкой биопробы на лабораторных животных. Заболевание овец вирусной эктимой и контагиозным пустулезным стоматитом были исключены результатами исследований Краевой ветеринарной лаборатории. Кроме того, оба хозяйства были неблагополучны по некробактериозу крупного рогатого скота. У больных животных совхоза техникума «Александровский» и совхоза «Терский», заболевание имело хронические течение, поражения локализовались только в области межкопытной щели и характеризовались отеком и гиперемией кожи и окружающих тканей, наличием эрозий. Покрытых сероватым экссудатом с ихорозным запахом, повышением местной температуры и болезненностью пораженных копыт, что сопровождалось развитием синдрома хромоты. Однако случаев острого осложненного течения инфекции в этих хозяйствах не наблюдали.
Заболевание крупного рогатого скота некробактериозом в опхозе «Темнолесский», колхозе «им. Войтика», совхозе-техникуме «Александ-. ровский» и совхозе «Терский», носило стационарный характер. Заболеваемость животных была невысокой и составляла в среднем в течение года соответственно в опхозе «Темнолесский» 12,1%) (6,8-17,6%)), совхозе-техникуме «Александровский» 9,7% (7,2-12,7%), колхозе «им. Войтика» 13,2%) (8,1-16,0%). Наименьшая заболеваемость некробактериозом была у коров совхоза «Терский» в засушливой зоне Ставрополья 3,9% (1,0-7,5%)). Заболевание характеризовалось, в основном, поражением конечностей, при этом отмечали наличие язв в области пяточных частей межкопытной щели, реже абсцессы и свищи в области венчика. В отдельных случаях отмечали воспаление запястного и заплюсневого суставов, гнойные тендовагиниты и бурситы. Пораженные конечности были сильно отечными и болезненными. В покое больную конечность животные держали слегка приподнятой. При движении больных животных проявлялся синдром хромоты. Пик заболеваемости некробактериозом крупного рогатого скота в хозяйствах, находящихся в зоне умеренного увлажнения, как и пик заболеваемости у овец, наблюдался в зимне-весенний период. Минимальная заболеваемость скота наблюдалась также в летне-осенний период, что иллюстрирует таблица 7. Пики инфекционной заболеваемости конечностей овец и крупного рогатого скота в Ставропольском крае и их минимальные значения, в основном, совпадали и во многом зависели от количества осадков в указанные периоды. Нами и другими исследователями (119) подтвержден тот факт, что злокачественное течение копытной гнили у овец, вызванное ассоциацией микроорганизмов, отмечалось при выпасе отар овец на тех же пастбищах, где ранее выпасался крупный рогатый скот, пораженный некробактериозом. То есть, установлен факт передачи возбудителя некробак-териоза через пастбище от крупного рогатого скота овцам.
Подобную картину нам удалось наблюдать совместно с с.н.с. ВНИИЭВ Сидорчуком А.А. и научными сотрудниками Киргизского НПОЖ, при изучении инфекционных заболеваний конечностей овец и крупного рогатого скота в совхозах «Кызыл Суу» и «Заветы Ильича» Ке-минского района и колхозе «им. Шопокова» Сукулукского района в Киргизии. Все хозяйства располагались в Чуйской долине в зоне умеренного увлажнения и представляли собой хозяйства смешанного типа, где имелись дойные стада коров, сосредоточенные на молочно-товарных фермах, а также достаточно большие отары овец по 2,5-3,5 тысячи голов. В хозяйствах отмечалось стационарное неблагополучие крупного рогатого скота по некробактериозу, а овец по копытной гнили и некробактериозу.
Изучение некоторых параметров иммунитета при применении ассоциированных вакцин «Нековак», «Нековак-стимул» и «Овикон»
Культуральные и морфологические свойства 7 штаммов D.nodosus изучали на полужидких, жидких и плотных питательных средах. В качестве полужидких питательных сред использовали МППБ с добавлением 0.5 % глюкозы и 0.1 % агара, а также среду № 2 по прописи отдела питательных сред ФГУ ВГНКИ с добавлением 0.1 % агара. Поскольку микроорганизм D.nodosus является строгим анаэробом, так же,как и при культивировании штаммов F. necrophorum, перед началом культивирования штаммов D. nodosus проводили регенерацию питательных сред для снижения Eh и до 70-80 мВ. Показатели ph среды до культивирования устанавливали в пределах 7.4 - 7.6 ±0.1. Культивирование проводили при температуре 37 С±0.5С в течение 72 -96 часов. На вторые сутки культивирования у штаммов ПП82/90, К-8, Тм., Войтик, Кир-1 в середине столбика питательной среды образовывались вертикально расположенные штрихи длиной 2 - 4 мм, которые увеличивались в размере на 3 - 4-е сутки культивирования и сливались в серо-белые тяжи. У штаммов Ал., Кир-2 при культивировании на полужидких средах отмечали ватообразный характер роста культур возле кусочков печени на 2-4-е сутки их роста. На полужидких питательных средах штаммы D.nodosus в условиях хранения при температуре +8-+15С сохраняли свою жизнеспособность в течение трех недель. Полужидкие питательные среды использовали для поддержания жизнеспособности культур и для приготовления посевных расплодок культур D.nodosus с целью их дальнейшего культивирования на жидких питательных средах.
В качестве жидких питательных сред для культивирования штаммов D.nodosus использовали жидкую питательную среду ВИЭВ, в основе которой использовали перевар Хоттингера, печеночный экстракт, 0.5% хлористого натрия, 0.5 % глюкозы, 1 % пептона, и среду № 2 ФГУ ВГНКИ.
Выращивание культур D.nodosus на жидких питательных средах проводили при температуре 37 С±0.5 С в течение 36-48 часов. В процессе выращивания культур через барбатер и стерилизующий фильтр в среду пропускали азот 4-6 часов после засева культур, затем 1 - 2 часа с 5 - 8 часовым интервалом. В начале вторых суток отмечали появление роста культур D.nodosus, которое характеризовалось мягким равномерным помутнением среды в нижних слоях. Впоследствии помутнение среды увеличивалось и достигало своего максимума к 48 часам культивирования, при этом концентрация бактериальной массы достигала 5x10 -1x10 м.т./мл.
Во время и по окончании культивирования штаммов D.nodosus на полужидких и жидких питательных средах изучали морфологию клеток D.nodosus при окрашивании по Граму и Романовскому - Гимза, при этом значительных отличий в способности бактериальных клеток 7 исследуемых штаммов D.nodosus воспринимать окраску нами не отмечено. При окраске по Граму 36 -48 часовые культуры представляли собой грамоотри-цательные прямые или слегка изогнутые, одиночные или парные палочки с утолщенными округлыми концами. Концы палочек имели более темную окраску по сравнению с центральной частью клетки. Наряду с этим, в мазках встречались вздутые укороченные плохо прокрашиваемые клетки без утолщений на концах, что, очевидно, указывало на предлизисное состояние клеток.
Окрашивание 36-48 часовых культур 7 штаммов D.nodosus по Ро-мановскому-Гимза приводило к неравномерному прокрашиванию клеток. В мазках отмечено наличие темно-синей середины бактериальных клеток и более светлых участков перед краевыми утолщениями.
По сообщениям (18,34,35 ), лучшей питательной средой для выделения и культивирования D.nodosus являлся 3% тиамин-цистин-глутаминовый кровяной агар (ТЦГА). Учитывая этот факт в своих исследованиях при изучении культуральных и морфологических свойств 7 штаммов D.nodosus, мы использовали именно эту плотную питательную среду. Культивирование проводили при температуре 37 С±0.5 С в анаэробных условиях в течение 4-5 суток. Результаты исследований представлены в таблице 31.
Из таблицы 31 следует, что 4 штамма D.nodosus ПП 82/90, К-8, Тм., Войтик имели сосочковидную форму прозрачных колоний, шероховатую поверхность с приподнятым центром и волокнистый край. Два штамма Ал. и Кир-2 при культивировании на 3% ТЦГА образовывали круглые сероватые колонии с выпуклой гладкой поверхностью и неровным краем. Штамм Кир-1 имел отличительные особенности. Он формировал округлые прозрачные колонии, имевшие шероховатую поверхность с углублением в центре и волокнистый край.
Морфологически при окраске по Граму и Романовскому-Гимза культуры D.nodosus, выращенные на плотной питательной среде, выглядели так же, как и культуры, выращенные на жидкой питательной среде. Однако в культурах, выращенных на 3% ТЦГА, преобладали более тонкие прямые палочки с четко прокрашиваемыми утолщенными концами, так называемые, гантелевидные формы. Значительно реже в мазках культур с ТЦГА встречались вздутые лизированные формы клеток.
Биохимические свойства 7 штаммов D.nodosus изучали по их способности сбраживать сахара и многоатомные спирты, образовывать индол и сероводород, разжижать желатин, свертывать и пептонизировать лакмусовое молоко. Результаты исследований представлены в Таблице 32. Проведенные нами исследования подтвердили данные (11,15,18,38,74,256), свидетельствующие о том, что штаммы D.nodosus не обладают способностью ферментировать сахара и многоатомные спирты.
