Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема криптобиоза - скрытой жизни или состояния «физиологического покоя» имеет общебиологическое значение в связи с широким распространением этого феномена в природе. В таком состоянии находятся споры грибов, низших растений и прокариот, почки растений, насекомые в диапаузе, животные в спячке [Ушатинская, 1990]. Актуальность этой проблемы связана с необходимостью изучения явлений скрытой жизни и длительного существования в экстремальных условиях для сохранения биоразнообразия на Земле, освоения Космоса и территорий с неблагоприятными условиями, борьбы с патогенными грибами, использования спор в биотехнологии и разработки методов их хранения.
Индукторами спорогенеза являются многие факторы (истощение питательных веществ, снижение влажности, изменение температурных условий и др.), которые вызывают торможение жизненной активности [Феофилова, 2003]. В онтогенезе грибов спору рассматривают как конечную точку цикла, т.е. как ключевую структуру, обеспечивающую сохранение жизни во времени и пространстве [Sussman, 1976; Osherov, May, 2001]. Для этого необходима устойчивость к абиотическим факторам, среди которых наиболее опасным является тепловой шок.
Верхний предел витальной зоны, который определяется тепловой коагуляцией белков, довольно узок, тогда как нижняя граница более широка в связи с тем, что холод не разрушает органических соединений. В вегетативных клетках грибов адаптация к температурным колебаниям в зоне толерантности осуществляется имеющимися регуляторными механизмами. Однако, когда воздействие отличается от оптимальной температуры на 8-12 С, что называется тепловым шоком [Lindquist, 1986], происходит индукция особой защитной системы. Такая система включает: синтез белков теплового шока, аккумуляцию трегалозы, детоксикацию активных форм кислорода, структуризацию и перераспределение воды в компартментах цитозоля, изменение состава мембран и поддержание внутриклеточного рН [Piper, 1993]. В результате организм переходит в другое дискретное стационарное состояние метаболизма, называемое стрессом [Веселова и др., 1993], характерным признаком которого является термоустойчивость.
Ранее трегалозу считали лишь одним из запасных углеводов, но по современным представлениям этому соединению присущи следующие функции: (а) резервного углевода (б) протектора мембран при разнообразных типах стресса: тепловом, окислительном, осмотическом, действии тяжелых металлов, лекарств, метаболических ингибиторов; (в) регулятора процесса гликолиза, концентрации глюкозы и АТФ в клетке; (г) транспортируемой формы углеводов в мицелии [Thevelein, 1996; Arguelles, 2000]; (д) шапероноподобного соединения, участвующего в стабилизации и фолдинге белков [Singer, Lindquist, 1998; Sampedro, Uride, 2004]; антиоксиданта [Oku et.al., 2003].
В связи с участием трегалозы в защите мембран от теплового шока воз-
липидного
ным коле-
никает вопрос о роли фосфолипидов г основных кшшуншШв J бислоя. Известно, что в зоне толерантное! и вдатаг^^у^^gMneparypi
о»
баниям осуществляется путем изменения состава мембранных липидов и (или) их жирных кислот [Sinensky, 1974; Hazel, 1995]. Происходят ли подобные изменения в составе липидов в условиях ТШ, учитывая резкое торможение жизнедеятельности, или достаточно термопротекторного действия трегалозы - оставалось неясным. Такое исследование состава углеводов цитозоля и липидов грибов в условиях теплового шока может содействовать пониманию биохимических механизмов термоустойчивости не только вегетативных, но и покоящихся клеток, так как известно, что трегалоза в значительном количестве накапливается в спорах грибов [Thevelein, 1996]. Кроме того, разнообразный состав внутриклеточных углеводов грибов, включающий и сахароспирты, позволяет предположить их участие в адаптации к температурному шоку.
Новое понимание функций углеводов определило идею данной работы -изучение различных состояний покоя спор с позиций биохимической адаптации к тепловому шоку. Кроме того, это может способствовать более глубокому пониманию природы клеток с различными типами покоя и процессов, происходящих в них при хранении и прорастании, что представляет большую ценность не только для фундаментальной науки, но и для создания биотехнологий, использующих споры грибов.
Целью настоящей работы являлось изучение состава растворимых углеводов и липидов в вегетативных клетках мицелиальных грибов в условиях температурного шока и в спорах с различными типами покоя. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить состав углеводов цитозоля и липидов в условиях температурного шока в вегетативных клетках грибов, относящихся к различным отделам Fungi.
-
Провести сравнительное исследование состава углеводов цитозоля и липидов в спорах с экзогенным и эндогенным типами покоя.
-
Выявить отличия в ответе экзогенно покоящихся спор грибов на температурный шок по сравнению с вегетативными клетками.
-
Изучить изменения в составе углеводов цитозоля при хранении спор грибов с различными типами покоя.
-
Исследовать состав углеводов и липидов в процессе прорастания экзогенно покоящихся спор.
-
Использовать результаты фундаментальных исследований в разработке биотехнологий получения лекарственных средств из мицелиальных грибов.
Научная новизна работы. На примере изученных грибов впервые доказано, что защита мембран вегетативных клеток грибов от теплового шока осуществляется, в основном, с помощью мембраностабилизирующих соединений, к которым относятся стерины и углеводы (трегалоза, сахароза и инозит), а не путем изменения фосфолипидного состава. Механизм адаптации вегетативных клеток грибов (Ascomycota, Basidiomycota) к холодовому шоку включает аккумуляцию полиолов. Впервые обнаружено, что жизнеспособность плодовых тел базидиальных грибов в природных условиях слабых отрицательных темпера-
тур связана не только с увеличением доли полиненасыщенных жирных кислот в фосфолипидах, но с высоким уровнем этих полиолов. Впервые установлено, что у базидиальных грибов механизм индукции плодообразования Холодовым шоком включает накопление полиолов - арабита и глицерина.
С позиций биохимической адаптации, независимо от типа покоя, в защите спор от тепловых воздействий сочетаются две стратегии защиты - от теплового шока (высокий уровень трегалозы) и от тепловых модуляций в зоне толерантности (большое количество фосфатидилхолина). Впервые установлено, что основным отличительным критерием типа покоя является степень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов: если она высокая, как в вегетативных клетках, то споры находятся в состоянии экзогенного покоя, если низкая - то в эндогенном покое. Новым фактом является установление биохимического ответа экзогенно покоящихся спор на температурный шок. Выявлена прямая корреляция между термостабильностью и количеством трегалозы в спорах. Впервые показано, что при хранении экзогенно покоящихся спор поддерживается определенный уровень термопротекторных углеводов цитозоля, тогда как в спорах с эндогенным покоем количество трегалозы уменьшается, что сопровождается снижением их всхожести. Установлено, что от количества трегалозы в экзогенно покоящихся клетках зависит длительность I фазы прорастания.
Практическая значимость и реализация результатов работы. Проведенные фундаментальные исследования дают теоретические предпосылки для разработки новых подходов к созданию биотехнологий получения лекарственных средств на основе мицелиальных грибов. Один из таких подходов - «воспитание» спорового посевного материала в процессе спорогенеза, позволяющее получить споры с определенным химическим составом, что влияет не только на процессы хранения и прорастания, но и на синтез биологически активных веществ, в частности каротиноидов.
Разработаны способы подготовки спорового посевного материала с новыми свойствами для биотехнологии. Предложены биохимические критерии оценки жизнеспособности спорового посевного материала на примере конидий A. niger - продуцента лимонной кислоты.
Автор был ответственным исполнителем в проектах, возглавляемых профессором Е.П. Феофиловой, по разработке лекарственных средств из мицелиальных грибов. На основе мукорового гриба В. trispora. нами созданы два лекарственных средства - Микоран (совместно с Институтом хирургии им А.В. Вишневского РАМН) и Миколикопин (совместно с РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН). Разработан опытно-промышленный регламент, проведены токсикологические и клинические испытания, получены временные фармакопейные статьи на субстанцию и ранозаживляющий препарат Микоран. Активным началом препарата являются полиаминосахариды хитин и хитозан. Препарат Микоран разрешен к применению в медицинской практике приказом Минздрава РФ № 368 от 1996 г. и включен в Фармакопею РФ. Разработана биотехнология получения ликопина из гриба. На основе ликопина и других биологически активных соединений гриба создано адаптогенное средство Миколикопин с противораковым эффектом, установлены его радиопротекторные, антимутагенные
и иммуномодулирующие свойства, создана лекарственная форма в виде желатиновых капсул. В испытаниях на модели рака простаты у крыс показан лечебный эффект Миколикопина, что открывает перспективы его использования в профилактике и лекарственной терапии заболеваний простаты.
Предложены два новых метода исследования: экспресс-метод определения ликопина и Р-каротина в смеси и способ определения степени деацети-лирования хитина в полисахаридных комплексах грибов.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены доложены и обсуждены на: IV-th Int. Mycological Congress (Regensburg, Germany, 1990), XV-th Int. Symposium of yeasts (Riga. 1991), Vl-th Int. Fungal Spore Conference, (Kon-stanz, Germany, 1996), VI Международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана" (Москва, 2001), Конференции «Физиология и биохимия культивируемых грибов» (Саратов. 2002), I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003), VII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана (Санкт-Петербург-Репино, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 63 научные работы, в том числе 42 экспериментальные статьи, 4 обзора, 9 тезисов конференций, 2 авторских свидетельства и 6 патентов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования в 3 главах, обсуждения и выводов, изложена на 300 страницах машинописного текста, содержит 69 рисунков и 45 таблиц. Список литературы включает 341 работу, в том числе 274 на английском языке.
![Адреналинзависимая регуляция экспрессии белков теплового шока 70 кДа в лимфоидных клетках [Электронный ресурс]](/i/i/4357/199767.png "Адреналинзависимая регуляция экспрессии белков теплового шока 70 кДа в лимфоидных клетках [Электронный ресурс] Мурашко Дмитрий Александрович")