Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Особенности проявления заболевания картофеля фитофторозом 14
1.2. Возбудитель фитофтороза 15
1.3. Факторы совместимости патогена с растительным организмом 18
1.4. Спорообразование - как инструмент генетических изменений в популяции фитофторы 20
1.5. Факторы, влияющие и изменяющие агрессивность фитофторы 24
1.6. Стратегия возбудителя фитофтороза 26
1.7. Ответные реакции растений при биотических стрессах
1.7.1. Окислительный стресс 29
1.7.2. Активные формы кислорода 29
1.7.3. Соединения и ферменты — антиоксиданты 31
1.7.4. Апоптоз или программируемая клеточная смерть 34
1.7.5. Защитные реакции растений при биотических стрессах 36
1.8. Микроэлементы 44
1.8.1. Железо 46
1.8.2. Медь 47
1.8.3. Марганец 48
1.9. Средства профилактики и борьбы с фитофторозом 49
ГЛАВА 2. Материалыи методы исследований 54
2.1. Метод наращивания агрессивности фитофторы 54
2.2. Способ приготовления брусочков картофеля и процедура их инфицирования фитофторой 55
2.3. Определение индекса агрессивности патогена 57
2.4. Определение активности каталазы и пероксидазы 57
2.5. Методы определения содержания микроэлементов: железа,
марганца, меди в клетках картофеля, зооспорангиях и почве 59
2.6. Статистическая обработка результатов 61
ГЛАВА 3. Результаты исследования 62
3.1. Особенности изменения активности каталазы и пероксидазы при фитофторозной инфекции 62
3.2. Особенности изменения содержания микроэлементов: железа, марганца, меди при фитофторозной инфекции 67
3.3. Содержание микроэлементов: железа, марганца, меди в зооспорангиях исходной и агрессивной рас фитофторы 70
3.4. Влияние соединений марганца на активность ферментов, а
также на проявление агрессивности фитофторы 73
3.5. Содержание микроэлементов: железа, марганца, меди в почвах произрастания картофеля 79
3.6. Влияние на устойчивость клубней картофеля к фитофторозу трехкратной обработки растений в период вегетации соединениями марганца 80
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 86
Заключение 95
Выводы 97
Список литературы
- Факторы совместимости патогена с растительным организмом
- Защитные реакции растений при биотических стрессах
- Определение индекса агрессивности патогена
- Содержание микроэлементов: железа, марганца, меди в зооспорангиях исходной и агрессивной рас фитофторы
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Фитофтороз, вызываемый оомицетом Phytophthora infestans (Mont.) de Bary – самое вредоносное заболевание картофеля в большинстве стран мира. Ежегодные общие потери этой культуры от заболевания и затраты на борьбу с ним стремительно растут и недавно оценивались примерно в 3 млрд. долларов (Захаренко В.А., 2003).
В начале ХХІ столетия была зафиксирована очередная волна резкого возрастания вредоносности фитофтороза. Серьезные изменения в биологии возбудителя заболевания в итоге привели к повышению его экологической пластичности, адаптивности и усилению патогенных свойств.
Возросший эпифитотиологический потенциал P. Infestans стал причиной снижения эффективности традиционных методов защиты картофеля, и агротехнические мероприятия в настоящее время имеют скорее профилактическое значение. Считается также, что возделывание устойчивых сортов картофеля не гарантирует получения стабильного урожая в условиях сильного развития болезни без применения фунгицидов.
Однако и химический метод может обеспечить приемлемый уровень контроля заболевания, но только при условии увеличения количества обработок. Так, в странах ЕС посадки картофеля опрыскивают 7–20 раз за сезон, что на 40% выше, чем в 70-х годах (Филиппов А.В., 2005). Дополнительные затраты на пестициды снижают рентабельность выращивания культуры, вызывают обеспокоенность потребителей картофеля, отдающих предпочтение экологически чистой продукции, и усиливают антропогенный прессинг на окружающую среду. Современная концепция интегрированной защиты картофеля ориентирована на использование, как химических, так и нехимических (организационно-хозяйственных, агротехнических и биологических) методов.
Альтернативой применению пестицидов являются биологические методы защиты растений, в первую очередь те методы и приемы, которые индуцируют устойчивость растений к патогену.
Устойчивость растения к патогену определяется способностью распознать и своевременно включить механизм защиты. Наряду с индукцией синтеза фитоалексинов и гидролитических ферментов, к таким механизмам относится активация в инфицированных клетках и клетках, локализованных вблизи очага инфекции, программы собственной гибели - процесс, называемый гиперчувствительным ответом (ГО). Образуется зона мертвых обезвоженных клеток, которая служит барьером для дальнейшего распространения патогена. Установлено, что при ГО гибель клеток растений вызывается не прямым деструктивным действием патогена, а активацией им генетической программы гибели растительной клетки. Процесс сопровождается дыхательным взрывом - генерацией H2О2 при участии NADPH-оксидазы цитоплазматической мембраны (Tada Y. et al., 2001).
При этом перекись водорода в малых концентрациях является индуктором апоптоза, а в высоких концентрациях вызывает некроз - быструю гибель клеток, без каких-либо морфологических изменений, характерных для апоптоза(Apel K., Hirt H., 2004).
В настоящее время имеются убедительные свидетельства, что в реализации неспецифической устойчивости растений принимают участие активные формы кислорода и противостоящая им система антиоксидантной системы защиты. В частности, показано, что ингибирование системы антиоксидантной защиты (АОЗ) способно увеличить устойчивость картофеля к фитофторозу (Еланский С.Н., Попова И.И., 1998). Каталаза и пероксидаза являются ферментами, участвующими в деградации H2О2. При этом ключевую роль в реализации и направленности окислительно-восстановительных реакций, осуществляемыми этими ферментами, играют «переходные» металлы (металлы с переменной валентностью) (Ребров В.Г., Громова О.А., 1989; Сусликов В.Л., 2000).
Но, если влияние активности антиоксидантных ферментов, в частности каталазы, на формирование устойчивости и восприимчивости картофеля к фитофторе установлено (Панина Я.С. и др., 2004), то работы о характере влияния ионов железа, меди и марганца на эти процессы практически отсутствуют.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: выявление уровня активности каталазы и пероксидазы и сопряженного с этим обмена железа, меди и марганца в картофеле, инфицированном двумя, отличающимися по агрессивности расами Phytophthora infestans (Mont.) de Bary и сопоставление этой активности с процессом формирования устойчивости или восприимчивости картофеля.
Задачи исследования:
1. Определить характер изменения активности каталазы и пероксидазы в клубнях картофеля при его инфицировании исходной (первичный полевой изолят) и агрессивной расами фитофторы.
2. Определить содержание железа, меди, марганца в клубнях картофеля, инфицированных исходной и агрессивной расами фитофторы.
3. Определить содержание железа, меди и марганца в зооспорангиях исходной и агрессивной рас фитофторы.
4. Оценить содержание железа, меди и марганца в почвах промышленного выращивания картофеля.
5. Исследовать характер влияния марганца на активность каталазы и пероксидазы в клетках картофеля, инфицированных фитофторой.
6. Определить возможность индуцирования устойчивости картофеля к фитофторозу обработкой растений в период вегетации соединениями марганца.
Впервые показан характер изменения активности каталазы и пероксидазы - основных ферментов, регулирующих содержание внутриклеточной перекиси водорода при инфицировании клеток картофеля расами фитофторы, отличающимися агрессивностью. Выявлена корреляция между агрессивностью патогена, изменением активности двух антиоксидантных ферментов, содержанием железа, меди и марганца.
Показано в системах in vivo и in vitro, что восстановление баланса «Fe / Mn» индуцирует устойчивость картофеля к инфицированию фитофторой.
В проведенных полевых опытах было установлено, что опрыскивание растений в период вегетации растворами, содержащими марганец (особенно в форме сукцината марганца), индуцирует устойчивость клубней картофеля к инфицированию фитофторой.
Факторы совместимости патогена с растительным организмом
Главными- факторами совместимости патогена и растения-хозяина, на ранних стадиях их взаимоотношений являются, во-первых, характер адгезионных контактов партнеров и, во-вторых, морфологические особенности первичных инфекционных структур патогена, их изменчивость (Рябченко, Сережкина, Мишина, Андреев, 2003). Эволюция взаимоотношений фитопатогенных грибови растений-хозяев привелак тому, что высокоспециализированные биотрофные (прижизненные) грибы-эндобионты существуют за счет обусловливаемых ими модификаций цитолазматической мембраны клеток растения-хозяина в отношении транспорта метаболитов и биосинтеза клеточной стенки (Проценко, 1988). При этом обеспечиваются высокоуравновешенные взаимоотношения грибов (Ascomycetes, Basidiomycetes, Zygomycetes, Oomycetes) и растений-хозяев.
Концепция! симбиоза, предложенная Антоном де Бари более 120 лет назад (Douglas, 1994), рассматривает его как длительное сосуществование неродственных организмов, в ходе которого осуществляется широкий спектр взаимовыгодных (мутуалистических) и паразитарных (антагонистических) взаимодействий. Впоследствии эти типы отношений стали противопоставлять друг другу, что выразилось в становлении фитопатологии и паразитологии в качестве самостоятельных дисциплин. К концу 1980-х стало очевидным, что мутуализм и антагонизм в отношениях партнеров могут быть разделены только на популяционном и экологическом уровнях, так как генетические и биохимические механизмы этих отношений имеют больше сходства, чем различий, (Spaink, 1995; Проворов, 2001).
Выяснение этого факта имело огромное методологическое значение, так как создало возможность для синтеза, знаний, о генетике мутуализма и антагонизма, что привело к становлению новой области знаний — симбиогенетики. Ее предметом являются надорганизменные генетические системы симбиоза, формируемые в.результате функциональной, а иногда и структурной интеграции «симбиотических» (sym) генов-партнеров» (Проворов; 2001; Тихонович, 2004).
Благодаря работе этих систем осуществляются: 1) сигнальные взаимодействия партнеров, приводящие1 к перекрестной регуляции и дифференциальной экспрессии- их sym-генов; 2) развитие комбинированных структур, содержащих компоненты от разных партнеров; 3) их метаболическая, интеграция, которая, приводит к появлению у организмов новых адаптивно значимых свойств.
Наиболее изученный, пример сигнальных взаимодействий — это обмен партнеров регуляторными факторами1 на ранних стадиях симбиоза бобовых растений и клубеньковых бактерий- или ризобий (Овцына, Тихонович, 2004). Он начинается с узнавания ризобиями флавоноидов, выделяемых прорастающими семенами и корнями хозяина и воздействующих на белковый продукт конститутивного бактериального гена nodD. В результате этого белок NodD активирует систему генов клубенькообразования, функцией которых является синтез липо-хито-олигосахаридных Nod-факторов. Одни из этих генов {nodABC) являются общими для всех видов ризобий и кодируют коровую« часть молекулы- Nod-фактора. Другие гены (например, nodPO, nodH, nodEF, nodX) являются видо- или даже штаммоспецифичными. Они контролируют модификации химической структуры Nod-фактора, определяющие специфичность последующего взаимодействия.
Итогом сигнальных и морфогенетических процессов, сопровождающих развитие симбиоза, является формирование-у партнеров комплекса новых признаков, которые отсутствовали у них в свободном состоянии и развитие которых приводит к расширению адаптивных возможностей; одного или обоих взаимодействующих организмов. Это расширение часто происходит путем метаболической интеграции партнеров, которая открывает им доступ к новым источникам питания и энергии.
Необходимо различать несколько типов метаболических взаимодействий при симбиозе. Наиболее простым из них является установление между партнерами, тесных трофических связей, которые, однако, сводятся к передаче неспецифических метаболитов: обычно эндосимбионты получают от хозяина вещества, которые могут вырабатывать и сами. При паразитизме взаимодействие партнеров обычно ограничивается- этими связями. При мутуализме взаимодействие1 часто оказывается более сложным: наблюдается предоставление одним из партнеров другому новошбиохимической функции, которую последний не может выполнять самостоятельно. Подобные отношения часто оформляются в виде обобщенных (межорганизменных) метаболических систем, которые объединяют биохимические пути партнеров (Проворов, 2001; Тихонович, 2004).
Защитные реакции растений при биотических стрессах
Для определения активности антиоксидантных ферментов и содержания микроэлементов с граней брусочков, которые были инфицированы, срезали слой ткани высотой в 2-3 мм. В этих срезанных частях, после соответствующей подготовки и проводились указанные выше определения. С контрольных брусочков также срезали слой обращенный вверх.
Активность каталазы определяли по Баху А.Н. и Опарину A.M. (Тенишева, 2003). Подготовка проб: 2 г сырой навески-картофеля растирали с использованием кварцевого песка, материал суспендировали в 100 мл дистиллированной воды, фильтровали, доводили объем фильтрата до 100 мл дистиллированной водой. К 20 мл фильтрата добавляли 25 мл раствора перекиси водорода и после внесения серной кислоты проводили титрование перманганатом-калия. Активность каталазы определяли по формуле: (VK-V0)-V2-m- m, E = , где t- V, -0,034 VK - объем контрольного титрования Vo - объем опытного титрования Vi - объем вытяжки фермента, взятой для реакции V2 . объем приготовленной вытяжки фермента m - количество биоматериала (г) mi - количество пероксида водорода (мг) t - время реакции 0, 034 - поправочный коэффициент
Активность пероксидазы определяли в кинетической реакции с ферроцианидом калия (Рогожкин, 2006). Для этого в кювету вносили 0.1 мл натрий-фосфатного буфера рН 6.0, вытяжку из картофеля (супернатант, способ получения которого описан выше) в объеме 0,2 мл и 0,1 мл ферроцианида калия. После перемешивания реакцию инициировали введением в кювету 0,1 мл перекиси водорода. Через каждые 15-20 секунд в течение 2 минут регистрировали показатель поглощения на ФЭК при 420 нм. Строили график зависимости изменения поглощения от времени проведения реакции. Скорость реакции определяли из тангенса угла наклона касательной к кинетической кривой, выражаемой в изменении поглощения, в течение одной минуты (dD / dt, усл.ед./мин).
Содержание железа, марганца и меди в клубнях картофеля и зооспорангиях фитофторы определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на спектрофотометре AAS-3. Определение проводили в окислительном воздушно-ацетиленовом пламени: железа, при длине волны 248.3 нм, марганца — 279.5 нм, меди - 324.8 нм (Хавезов, Цалев, 1983). Пробы готовили следующим образом: навески картофеля весом 5 г смачивались концентрированной азотной кислотой, помещались в фарфоровые тигли, которые устанавливали в холодную муфельную печь. Температуру муфельной печи постепенно (в течении 2 ч) поднимали до 450 С и выдерживали при этой температуре до полного озоления образца ( 8 ч). Золу растворяли в 50 мл 1 н азотной кислоте, отфильтровывали через беззольный фильтр. Фильтрат доводили в мерной колбе до 50 мл и анализировали на спектрофотометре AAS-3. Концентрации металлов пересчитывались в мг/кг сырой растительной ткани по формуле: С = (А 50)/т, где С - концентрация металла в образце, мкг/г А - показания прибора, мкг/мл 50 - объем аликвоты, мл m - навеска, г Содержание металлов в суспензии зооспорангиев определяли следующим образом: раствор суспензии зооспорангиев объемом 100 мл выпаривали на водяной бане, сухой остаток растворяли в 5 мл концентрированной азотной кислоты и кипятили в течение 10 мин. Затем раствор доводили дистиллированной водой до 10 мл и анализировали. Результаты пересчитывали по формуле: С = (А 10)/100,где С — концентрация металла в суспензии, мкг/мл А - показания прибора, мкг/мл 10 — объем аликвотной части, мл 100 - объем пробы, мл Отбор почвы осуществлялся методом «конверта», с 5 точек на расстоянии 3 м друг от друга. Образцы высушивали до воздушно-сухого состояния, растирали в фарфоровой ступке, просеивали через сито d 1 мм; корни и примеси в виде камней при этом удалялись. С разных участков поля было отобрано 10 подобных «конвертов».
Подготовка проб: на аналитических весах отбиралась навеска почвы в 2 грамма, к которой добавляли 10 мл 5 н азотной кислоты. Суспензию выдерживали 3 ч в водяной бане. Раствор фильтровали и доводили дистиллированной водой до объема 50 мл. Аликвотную часть полученного раствора анализировали на атомно-абсорбционном спектрофотометре AAS-3. Результаты рассчитывали по формуле: С = (А 50)/т, где С - концентрация металла в образце, мкг/г А - показания прибора, мкг/мл 50 — объем аликвоты, мл ш - навеска, г Влияние марганца на резистентность растительных клеток к фитофторе изучали с использованием трех соединений: сульфата марганца, комплекса марганец-ЭДТА (ООО «Агрохимснаб», Россия), сукцината марганца (Universal Nutrition, США). В экспериментах использовали растворы указанных соединений с равной концентрацией по марганцу — 0,07 мкМ.
Определение индекса агрессивности патогена
Действительно, содержание этого элемента было приблизительно в 1,5 раза выше в образцах, инкубированных в растворах с сульфатом марганца и марганец-ЭДТА, чем контроле. Если в последнем его концентрация составляла 6,22±0,75 мг/кг сырой ткани, то в варианте с сульфатом марганца - 9,10±0,34 мг/кг сырой ткани, а в варианте с марганец-ЭДТА - 9,92±0,30 мг/кг сырой ткани. В тканях клубней картофеля максимальные концентрации этого элемента наблюдались при использовании сукцината марганца - 14,32±0,23 мг/кг сырой ткани, достоверно различаясь, в свою очередь, от содержания марганца в других экспериментальных группах, в которых использовали сульфат марганца и марганец-ЭДТА (р 0.05).
Содержание железа, меди, марганца в инфицированных агрессивной расой фитофторы брусочках картофеля, обработанных соединениями марганца Экспериментальные Группы Контроль (вода) Сульфат марганца Мп-ЭДТА Сукцинат марганца Железо мг/кг сырой ткани 17,87±1,08 15,96±1,83 14,58±2,55 15,31±2,18 Марганец мг/кг сырой ткани 6,22±0,75 9,10±0,34 9,92+0,30 14,32±0,23 Медь мг/кг сырой ткани 2,33±0,41 2,06±0,44 2,22±0,32 2,80±0,35 Несколько удивительным был характер изменения содержания железа: в вариантах опыта с соединениями марганца - его количество снижалось. Если в контроле концентрация по железу составляла 17,87±1,08 мг/кг сырой ткани, то в вариантах с марганцем колебалась от 14,58±2,55 мг/кг сырой ткани до 15,96±1,83 мг/кг сырой ткани.
Различие в содержании меди было незначительным: в контроле -2,33±0,41 мг/кг сыр. ткани, в вариантах с сульфатом марганца - 2,06±0,44 мг/кг сыр. ткани и в вариантах с марганец-ЭДТА - 2,22±0,32 мг/кг сыр. ткани. Несколько выше (на 20%) его концентрация была только в образцах, обработанных сукцинатом марганца - 2,80±0,35 мг/кг сырой ткани.
В целом, все представленные выше данные (сводная таблица II в разделе «Приложение») свидетельствуют о том, что обработка клеток картофеля соединениями марганца индуцирует устойчивость к фитофторе, приводит к снижению активности каталазы и пероксидазы. При этом наиболее значительно эти показатели изменяются в варианте с сукцинатом марганца.
Характер зависимости проявления агрессивности фитофторы от активности каталазы и содержания марганца приведен на рисунке 11.
Зависимость индекса агрессивности от активности каталазы и содержания Мп в клубнях картофеля опытных растений, обработанных в период вегетации соединениями марганца
Взаимосвязь между индексом агрессивности и содержанием марганца в тканях клубней выражается регрессионным уравнением: R=0.95,p=0.022,F=19,8 Индекс агресс. = 112.0 - 7.335 Мп
Между индексом агрессивности и активностью каталазы: R=0.98,p=0.011,F=77,5 Индекс агресс. = 8.205 Каталаза— 36.5 Множественная регрессия всех этих показателей моделируется следующим уравнением: R=0.99,p=0.048,F=171,4 Индекс агресс. = 13.00 + 5.66 Каталаза - 2.622 Мп
Поскольку источником поступления микроэлементов в растения является почва, то было проведено определение содержания железа, меди и марганца в почвах, на которых произрастает картофель. В черноземах рекомендуемый максимально-допустимый уровень подвижных форм железа определен в 1200 мг/кг, меди - 15-25 мг/кг, марганца - 500 мг/кг сухого вещества (почвы) (Трахтенберг, Колесников, Луковенко, 1994).
Определение кислоторастворимых форм этих элементов, как отражающих общий мобильный пул металлов (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989) проводили методом «конверта», с 5 точек на расстоянии 3 метров друг от друга. Таблица 10 Содержание микроэлементов: железа, марганца и меди в почвах, на которых выращивали картофель Экспериментальные группы Железомг/кг сухойпочвы Марганецмг/кг сухойпочвы Медьмг/кг сухойпочвы Диапазон варьирования концентраций 912,5 - 1863,6 102,3-288,3 10,2-27,7 Среднее значение концентраций 1002,1±17,1 165,5±11,4 20,3±4,8 В итоге площадной съемки было установлено, что в пересчете на 1 кг сухой почвы диапазон варьирования концентраций железа колебался от 912,5 до 1863,6 мг/кг, меди - от 10,2 до 27,7 мг/кг, марганца - от 102,3 до 288,3 мг/кг.
Среднее содержание в почве мобильной формы железа составило — 1002,1±17,1 мг/кг, меди — 20,3±4,8 мг/кг, марганца - 165,5±Ц,4 мг/кг.
Таким образом, проведенные исследования показали, что почвы, на которых произрастает картофель, оптимальны по содержанию железа и меди, но дефицитны по марганцу.
В описанных ранее экспериментах было установлено, что предварительная, перед инфицированием, обработка образцов картофеля соединениями марганца вызывает снижение активности двух антиоксидантных ферментов и индуцирует устойчивость картофеля к фитофторе. Установлено также, что в районе выращивания, картофеля почвы, во-первых дефицитны по» марганцу, во-вторых, имеют нейтральное или-слабощелочное значение рН (данные районной агрохимической лаборатории). В тоже время, исследованиями Гундаревой (2005) установлено, что в нейтральных или слабощелочных почвах затруднено-усвоение марганца растениями. В связи с этим было решено провести полевой опыт, в, котором недостаток марганца в почве восполняли путем опрыскивания растений соединениями марганца.
Всего было сформировано 4 группы растений. Три из них обрабатывали (опрыскивали) воднымифастворами сульфата марганца,- марганца с ЭДТА и марганца с янтарной кислотой-с равным содержанием марганца - 0,07 мкМ. Опрыскивание проводили трижды: перед цветением, в фазу цветения и после цветения, с интервалом в ДО дней, из расчета 1 л раствора на растение. В контрольной группе растения- опрыскивали-водой. Все остальные проводимые агротехнические мероприятия в группах были одинаковы. Собранные осенью клубни, исследовались в лаборатории. Инфицирования картофельных брусочков5 проводили агрессивной расой фитофторы в которых затем определяли активность каталазы, пероксидазы, концентрацию микроэлементовш-проявление агрессивности патогена. Результаты исследования, представлены в таблице 11. Видно, что на брусочках из клубней контрольной, группы патоген проявил максимальную агрессивность- (индекс агрессивности- 78). К моменту исследования (на, 6 сутки после инфицирования) клетки картофеля контрольного варианта были заполнены хорошо развитыми гифами фитофторы, которыми были поражено» 10-15 рядов клеток.
Содержание микроэлементов: железа, марганца, меди в зооспорангиях исходной и агрессивной рас фитофторы
Из собранных осенью клубней нарезали брусочки, которые после заражения агрессивным штаммом фитофторы и последующей 6-ти дневной инкубации исследовались на устойчивость к развитию инфекционного процесса. Проводилось также определение активности каталазы и пероксидазы и содержание в клетках железа, марганца и меди.
Результаты исследований представлены в таблице 11. Видно, что максимальную агрессивность фитофтора проявляет в контрольной группе (индекс агрессивности равен 78).
В группе, обработанной раствором сульфата марганца — средний показатель индекса агрессивности был равен 60. Показатели индекса агрессивности, в группах которые обрабатывались комплексом Mn-ЭДТА и сукцинатом марганца равнялись, соответственно, 37 и 32. То есть, агрессивность патогена достаточно резко снижалась в клубнях тех растений, которые обрабатывались соединениями марганца с ЭДТА и янтарной кислотой. В двух последних опытных вариантах проявление агрессивности фитофторы было более чем в 2 раза ниже по сравнению с контрольным вариантом.
Активность каталазы в клубнях снижалась параллельно снижению индекса агрессивности, достигая минимальных значений в клубнях картофеля, обработанного комплексами марганца с ЭДТА и янтарной кислотой: 8,34±0,35 мкМ/мин г и 7,51±0,25 мкМ/мин г, соответственно (табл. 12). В клубнях растений, которые обрабатывались сульфатом марганца, активность была несколько выше — 12,51±0,23 мкМ/мин г. В контроле эта величина составляла 15,53+0,60 мкМ/мин г (различия статистически достоверны, р 0.01). Снижение активности пероксидазы, было менее значительным: от 56,86+4,10 мкМ/мин г в контроле до 42,54±5,80 мкМ/мин г в клетках обработанных сукцинатом марганца. В остальных вариантах опыта значения активности были следующими: в клетках растений, обработанных сульфатом марганца и марганец- ЭДТА, активность была 54,63±5,11 мкМ/мин г и 44,0+5,33 мкМ/мин г, соответственно.
Что касается содержания5 марганца, то вполне естественно, что его было больше в клетках, обработанных соединениями1 марганца, чем в контрольных. Причем наиболее высокое содержание наблюдалось в клетках, обработанных сукцинатом марганца- 12,1±0,38 мг на кг сырой ткани, против 6,80+0,48 мг/кг в контроле. В клетках, обработанных комплексом марганец-ЭДТА и сульфатом марганца, его содержалось 10,56±0;52 мг/кг и 7,85+0,67 мг/кг сырой ткани, соответственно (табл. 13).
Содержание меди менялось в том же порядке, в каком происходило увеличение содержания марганца. Исключение представлял только вариант с сульфатом марганца (2,01 ±0,27 , мг/кг сырой ткани), его содержание было на уровне1 контроля! (2,10±0,59 , мг/кг сырой ткани). На 20% количество меди увеличилось в варианте с марганец-ЭДТА и почти на 50% - в варианте с сукцинатом марганца.
Своеобразным был характер изменения содержания железа (табл. 13). Максимальное количество его - 23,30±2,14 мг/кг сырой ткани было в контрольных клетках. По мере снижения, его содержания варианты опыта располагаются в следующем порядке: вариант с сульфатом марганца (20,24±0,66 мг/кг), вариант с комплексом марганец-ЭДТА (16,30±1,55 мг/кг) и вариант с сукцинатом марганца (13,0+1,10 мг/кг).
Следует отметить, что характер изменения содержания железа в клетках клубней картофеля после опрыскивания растений в период вегетации растворами, содержащими ионы марганца, совпадает с характером изменения содержания железа, полученным в результате опытов in vitro (инкубация картофельных кубиков в чашках Петри в растворах, содержащих соединения марганца.). Но снижение содержания железа в клетках после обработки растений соединениями марганца было более значительным. Это свидетельствует в пользу ранее высказанного предположения, что ионы марганца препятствуют проникновению ионов железа в клетку. Вероятнее всего, что этот процесс не является следствием пассивной диффузии указанных ионов через клеточную мембрану, а идет под активным контролем самой растительной клетки.
В целом, результаты исследований свидетельствуют, что увеличение содержания в растительных клетках марганца сопровождается снижением активностей двух антиоксидантных ферментов, снижением содержания железа и, наконец, возрастанием устойчивости картофеля к фитофторозной инфекции.
