Введение к работе
Актуальность проблемы
Метан (СН4) является одним из наиболее активных парниковых газов Земли. Из всего разнообразия микроорганизмов лишь метанотрофные бактерии способны использовать его в качестве единственного источника углерода и энергии. Аэробные метанотрофы ныне известны в пределах классов Gamma- и Alphaproteobacteria (метанотрофы I и II типов, соответственно), а также филума Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1986; Гальченко, 2000; Trotsenko, Murrell, 2008; Троценко, Хмеленина, 2008; Op den Camp et al., 2009).
Крупнейшим природным источником метана являются северные болотные экосистемы (Matthews et al., 1987), среди которых наиболее распространены кислые (рН 3.5-5.5) сфагновые болота. Эмиссия метана из болот в атмосферу контролируется аэробными метанотрофными бактериями, населяющими верхние слои болотного профиля. Исследования последних полутора десятков лет позволили установить, что основным компонентом «метанокисляющего фильтра» кислых северных болот являются метанотрофные представители Alphaproteobacteria, относящиеся к семействам Methylocystaceae и Beijerinckiaceae (Dedysh et al., 2001; Chen et al, 2008; Dedysh, 2009). Выделенные из болот метанотрофы родов Methylocystis, Methylocapsa, Methylocella и Methyloferula были охарактеризованы как умеренно ацидофильные организмы, способные окислять метан в кислых и холодных условиях (Dedysh et al., 2000, 2002, 2007; Vorobev et al., 2011; Belova et al., 2013). Помимо адаптации к физико-химическим условиям кислых болот, эти метанотрофы имеют и ряд других экологических преимуществ, в числе которых - способность некоторых представителей к росту на ацетате (Dedysh et al., 2005; Belova et al, 2011, 2013) и обладание мембранной метанмонооксигеназой высокого сродства к СН4 (Belova et al., 2013).
В общей картине состава метанокисляющего сообщества болотных экосистем, тем не менее, остается ряд существенных пробелов. Первый из них, это нерешенный вопрос о присутствии в кислых болотах и вкладе в процесс окисления метана метанотрофов I типа. До недавнего времени, среди метанотрофов I типа ацидофилов известно не было. По данным анализа кислых торфов с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), метанотрофы I типа в них немногочисленны и составляют не более нескольких процентов от общей численности метанотрофных бактерий (Dedysh et al., 2001; 2003). Все же, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и ртоА, обнаруживающие сходство с таковыми у представителей родов Methylobacter и Methylomonas, были неоднократно выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из сфагнового торфа (Morris et al., 2002; Jaatinen et al, 2005; Слободова и др., 2006; Chen et al., 2008; Kip et al., 2010, 2011a). Первый аргумент в пользу существования ацидофильных метанотрофов I типа был получен голландскими исследователями, выделившими два штамма
Methylomonas- и Methylovulum-подобных бактерий из кислого торфа (Kip et al., 2011б). Эти изоляты, однако, были лишь частично охарактеризованы, а их роль в окислении метана в кислых болотах оставалась неподтвержденной.
Вторым нерешенным вопросом является природа организмов, идентифицированных голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (Raghoebarsing et al., 2005). Последовательности генов 16S рРНК этих пока некультивируемых бактерий принадлежат к обширному кластеру клонов, полученных из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Этот кластер принадлежит к Alphaproteobacteria и филогенетически равноудален от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae. Физиологические характеристики представителей этого кластера неизвестны, так как получить культуры представляющих его организмов до последнего времени не удавалось. Выделение этих бактерий, филогенетически родственных метанотрофам II типа, и изучение их метаболического потенциала представляло особый интерес для установления их роли в болотных экосистемах.
Настоящее исследование было предпринято для восполнения вышеперечисленных пробелов в знаниях о метанотрофных бактериях северных болотных экосистем.
Цели и задачи исследования Цель работы - оценка численности и филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в кислых сфагновых болотах, выделение и описание новых представителей болотных метанотрофов, а также филогенетически родственных им неметанотрофных организмов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Определение популяционной численности и молекулярная идентификация метанотрофов I типа, населяющих сфагновые болота.
-
Получение репрезентативных изолятов метанотрофов I типа из кислых торфов, изучение их рН-предпочтений и установление таксономической принадлежности.
-
Изучение биологии представителей нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофным бактериям семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae.
Научная новизна и значимость работы
Впервые проведена детальная оценка филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в северных сфагновых болотах России.
Описан и узаконен первый ацидотолерантный вид рода Methylomonas Methylomonas paludis sp. nov., который также является первым ацидотолерантным представителем семейства Methylococcaceae. Установлена способность метанотрофов этого вида развиваться в кислых средах (рН 3.8-4.5). Типовой штамм нового вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ.
Впервые из нескольких болот переходного типа получен в накопительных культурах метанотроф необычной спиралевидной формы Candidatus Methylospira palustris, представляющий новый род и вид семейства Methylococcaceae. С помощью анализа библиотек клонов генов ртоА и 16S рРНК установлено присутствие этих метанотрофов в различных местообитаниях.
Описан новый род и вид умеренно ацидофильных, микроаэрофильных бактерий-бродильщиков, Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov. Это первый представитель обширного кластера ранее некультивируемых микроорганизмов, филогенетически равноудаленного от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae, и представленного клонами из различных болот и почв. Типовой штамм нового рода и вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ.
Практическая значимость
Существенно расширена база данных последовательностей генов ртоА и 16S рРНК метанотрофных бактерий, населяющих северные сфагновые болота. Совокупность полученных в работе новых последовательностей депонирована в GenBank.
Разработаны и апробированы 16S рРНК-специфичные флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды для детекции новой группы метанотрофов-спирилл Candidatus Methylospira palustris.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах:
-
4th Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011.
-
VII Молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”, ИНМИ РАН, Москва, 2011.
-
14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark, 2012.
-
IX Молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”, ИНМИ РАН, Москва, 2013.
Публикации
Материалы диссертации содержатся в 7 печатных работах: 3 экспериментальных
статьях и 4 тезисах конференций.
Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 122 страницах, включая 11 таблиц, 25 рисунков и списка литературы из 224 наименований, из них 21 - на русском и 203 - на английском языке.
Место проведения работы и благодарности
Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им С.Н. Виноградского РАН с 2010 по 2013 годы.
Использованные в работе образцы торфа были предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской и к.б.н. С.Э. Беловой, а также отобраны автором. Изоляты MG30T и Pf56T были выделены и предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской (ИНМИ РАН, Москва). Исследования ультратонкого строения клеток были проведены к.б.н. Н.Е. Сузиной, а энзимологический анализ - к.б.н. О.Н. Розовой (ИБФМ РАН, Пущино). Анализ хинонов был проведен к.х.н. Б. П. Баскуновым (ИБФМ РАН, Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены совместно с к.б.н. Е. Н. Детковой, а анализ продуктов брожения - с В.В. Кевбриным (ИНМИ РАН, Москва). Автор выражает глубокую признательность научному руководителю С.Н. Дедыш, а также всему составу лаборатории за всестороннюю помощь и советы при выполнении работы.
Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект № 12-04-00768).
