Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Особенности биологии метанотрофных бактерий .. 12
1.1. История развития метапотрофии как научного направления 12
1.2. Свойства метанотрофных бактерий 17
1.2.1. Физиолого-биохимические свойства и ультраструктура 18
1.2.2. Таксономическое разнообразие аэробных метанотрофов 24
1.2.3. Особенности метаболизма облигатных метанотрофов 25
1.2.3.1. Энергетический метаболизм метанотрофов 25
1.2.3.2. Конструктивный метаболизм метанотрофов 35
1.2.3.3. Биохимическая основа облигатной метапотрофии 41
1.3. Методы детекции и анализа метанотрофных популяций 46
1.4. Аэробные метанотрофы экстремальных экосистем 51
1.4.1. Метанотрофы (гипер)соленых и щелочных экосистем 51
1.4.2. Термофильные и термотолерантные метанотрофы 60
1.4.3. Метанотрофные бактерии психросферы 62
Экспериментальная часть 66
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 66
2.1. Объекты исследования 66
2.2. Культивирование метанотрофов 66
2.3. Выделение накопительных и чистых культур метанотрофов 68
2.4. Изучение физиологических свойств 69
2.5. Полярографические измерения 69
2.6. Изучение влияния NaCl на потребление метана 70
2.7. Изучение морфологических и цитологических свойств метанотрофов 70
2.8. Определение числа клеток метанотрофов 71
2.9. Изучение влияния ингибиторов и ионофоров на подвижность клеток 71
2.10. Определение фосфолипидного состава клеток ; 71
2.11. Анализ жирнокислотного состава клеток 73
2.12. Определение цитохромов 74
2.13. Определение убихинонов 74
2.14. Определение формиата 74
2.15. Идентификация органических осмолитов у метанотрофов 75
2.16. Определение содержания воды в клетках 76
2.17. Характеристика белков S-слоев 76
2.18. Молекулярно-генетические методы 78
2.18.1. Выделение и очистка препаратов ДНК 78
2.18.2. Определение нуклеотидного состава ДНК и ДНК-ДНК-гибридизация 78
2.18.3. ПЦР-амплификация 81
2.18.4. Выделение плазмидной ДНК 83
2.18.5. Выделение РНК и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 83
2.18.6. Клонирование генов биосинтеза эктоина 85
2.19. Выделение белков аффинной металл-хелатной хроматографией 86
2.20. Определение активности ферментов 86
Результаты и их обсуждение 95
ГЛАВА 3. Метанотрофы соленых и щелочных водоемов 95
3.1. Потенциальная активность потребления метана в соленых и щелочных водоемах 95
3.2. Выделение чистых культур галофильных и алкалофильных метанотрофов 98
3.3. Таксономическое положение и физиологические свойства солезависимых метанотрофов 99
3.4. Особенности метаболизма 107
3.5. Особенности роста галоалкалофильных метанотрофов на метаноле 110
3.6. Механизмы осмоадаптации метанотрофов 115
3.6.1. Особенности ультраструктуры солезависимых метанотрофов 116
3.6.2. Фосфолипидный и жирнокислотный состав клеток 123
3.7. Осмопротекторы галофильных и галотолерантных метанотрофов 124
3.7.1. Спектр совместимых растворимых веществ 126
3.7.2. Пути биосинтеза осмопротекторов у метанотрофов 129
3.7.3. Идентификация генов биосинтеза эктоина у Mm. alcaliphilum 20Z 131
3.8.1. Филогенетический анализ генов биосинтеза эктоина : 136
3.7.1. Клонирование, очистка и характеристика ДАБ-ацетилтрансферазы
Mm. alcaliphilum 20Z 138
3.8. Биоэнергетические аспекты осмоадаптации метанотрофов 141
ГЛАВА 4. Умеренно термофильные метанотрофы 146
4.1. Морфофизиологические особенности метанотрофов рода Methylocaldum 146
4.2. Особенности конструктивного метаболизма 151
4.3. Метанотрофы термальных источников 153
ГЛАВА 5. Аэробные метанотрофы холодных экосистем 155
5.1. Особенности метаболизма Methylobacterpsychrophilus 155
5.2. Особенности метаболизма ацидофильных метанотрофов 156
5.3. Метанотрофные бактерии почв Северной тайги и Субарктической тундры России 158
5.4. Метанотрофы многолетнемерзлых пород 161
5.5. Метанотрофы глубинных залежей гранитов 165
Краткое описание новых таксонов метанотрофов 171
Заключение 175
Выводы 176
Список цитируемой литературы
- История развития метапотрофии как научного направления
- Выделение накопительных и чистых культур метанотрофов
- Потенциальная активность потребления метана в соленых и щелочных водоемах
- Морфофизиологические особенности метанотрофов рода Methylocaldum
Введение к работе
Актуальность проблемы
Области с экстремальными физико-химическими условиями занимают значительную часть поверхности Земли и населены адаптированными к этим условиям микробными сообществами. Микроорганизмы, способные к существованию при повышенных или пониженных значениях рН, солености или температуры, в том числе в биотопах, где отсутствуют высшие формы жизни, приобрели или сохранили в процессе эволюции специфические структурно-функциональные и физиолого-биохимические свойства. Эти экстремофильные и экстремотолерантные микроорганизмы представляют интерес как модели для изучения механизмов адаптации, способов стабилизации биомолекул и целых клеток при воздействии различных физико-химических факторов, и могут служить источниками получения биопротекторов, биостимуляторов, стабильных ферментов, ценными объектами для создания новых биотехнологий (Кашнер, 1981; Ventosa et al., 1998; Horikoshi, 1999).
Метан - наиболее распространенный на Земле органический газ наивысшей степени восстановленности, активно влияет на климат нашей планеты. Высокие скорости ежегодного прироста содержания метана в атмосфере (1%) привлекли внимание исследователей к факторам, регулирующим процессы его глобальной эмиссии. Важной особенностью поступающего в атмосферу метана является его преимущественно биологическое происхождение. Образование метана и его потребление осуществляют две специфические группы прокариот: анаэробные метаногенные археи и аэробные метанотрофные бактерии, объединенные в метановый цикл или цикл Зенгена (Заварзин, 1984, 1995). Аэробные метанотрофы широко распространены в почвенных и пресноводных экосистемах, и, обладая способностыо синтезировать все клеточные компоненты из Сі-соединений, являются основой бактериальных фильтров, потребляющих до 80% образующегося метана (King, 1990; Hanson, Hanson 1996; Гальченко, 2001). Наличие у метанотрофов уникального фермента, метанмонооксигеназы (ММО), обусловливает их способность окислять наряду с СЩ широкий спектр алифатических и ароматических соединений и, следовательно, участие в биоремедиации окружающей среды (Dalton, 2005).
До недавнего времени большинство поддерживаемых в мировых коллекциях культур метанотрофов были выделены из пресных водоемов и почв и представлены мезофильными, нейтрофильными и негалофильными штаммами (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001). Целенаправленный поиск и изучение метанотрофов, адаптированных
к условиям экстремальных биотопов, весьма актуальны, поскольку способствуют
выяснению роли этих бактерий в различных природных эконишах и определяют возможность их интродукции в открытые экосистемы. Возрастающий интерес к метанотрофам обусловлен также перспективами их использования в качестве моделей для изучения молекулярных механизмов адаптации и имеет целью более глубокое понимание особенностей биологии этой специализированной группы бактерий.
Состояние вопроса
Первые сведения о метанотрофах, способных к существованию в биотопах с высокими значениями температуры или солености, ограничивались описанием термофильных и термотолерантных метанотрофов, растущих при температуре до 55С (Foster, Davis, 1966; Малашенко с соавт., 1975; 1978), а также морских метанотрофов, толерантных к 3% NaCl (Lidstrom, 1988). Сообщения о выделении метанотрофов из гиперсоленых озер не сопровождались описанием чистых культур (Малашенко с соавт., 1993, 1995). Структурно-функциональные особенности метанотрофов, обеспечивающие их выживание в биотопах с селективным давлением повышенных или пониженных значений температуры, солености и рН, практически не исследовались.
По совокупности цитологических, физиолого-биохимических и таксономических характеристик метанотрофные бактерии разделены на два основных типа (I и II), которые принадлежат к а- и у-подклассам Proteobacleria, соответственно. На основании классических исследований нескольких видов метанотрофов группой Дж. Р. Квейла (Англия) были открыты рибулозомонофосфатный (РМФ) и сериновый пути как основные механизмы ассимиляции Сі-соединений у метанотрофов I и II типов, соответственно. В дальнейшем, у представителей рода Methylococcus, отнесенных к промежуточному 'X' типу метанотрофов (у-подкласс Proteobacleria), был выявлен минорный рибулозобисфосфатный (РБФ) путь фиксации СО2 как дополнительный к сериновому и рибулозомопофосфатному циклам ассимиляции углерода. Значительный прогресс в исследованиях метанотрофии, достигнутый в последние два десятилетия, отражен в монографиях и обзорах (Малашенко с соавт., 1978, 1987, 1993; Anthony, 1991; Гальченко с соавт., 1986а,б; Романовская с соавт., 1991; Murrell, Dalton, 1992; Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001) и трудах специализированных Сі-симпозиумов. Ко времени начала целенаправленных поисков метанотрофов, адаптированных к существованию при температуре >55С, солености > 3% NaCl, рН > 9 или <5, перечень узаконенных таксонов насчитывал 8 родов (Bowman et al„ 1993, 1995).
Было показано, что круговорот углерода в соленых и содовых водоемах включает все необходимые звенья - от фиксации углекислоты до образования метана, одного из основных конечных продуктов разложения органического материала в анаэробной зоне (Заварзин, 1993; Zhilina, Zavarzin, 1994; Заварзин и др., 1996, 1999; Сорокин и др., 1996; Ventosa et al., 1998; Joye et al., 1999). Тем не менее, экспериментальные данные о дальнейших путях стока СН4 либо отсутствовали, либо были крайне противоречивыми. Возможность окисления метана и наличия метанотрофов в соленых экосистемах казалась сомнительной из-за низкой растворимости ( (Conrad et al., 1993).
В последнее десятилетие несколькими группами исследователей, включая нашу, предпринимаются активные попытки выделения и изучения термофильных и термотолерантных метанотрофов, но их таксономическое разнообразие ограничивается тремя родами: Methylococcus, Methylocaldum и 'Methylotermus'. Наиболее детально изучен Methylococcus capsulatus, который является одним из основных объектов молекулярно-генетических исследований. Метанотрофы рода Methylocaldum по физиологическим свойствам близки видам Methylococcus, но несколько различаются по последовательности 16S rDNA (Bodrossy et al., 1995, 1997). Их физиолого-биохимические и генотипические свойства описаны весьма поверхностно, а механизмы термоадаптации не изучались. Род "Methylotermus" практически не изучен, а единственный изолят 'НВ' утерян (Bodrossy et al., 1999).
Присутствие метанотрофов в различных холодных экосистемах было впервые показано В.Ф. Гальченко радиоизотопным и иммунофлуоресцентным методами, а также подтверждено анализом специфических маркеров в составе экстрагированных из природных образцов тотальной ДНК и фосфолипидов (Vecherskaya et al., 1993; Гальченко, 1994; Sundh et al., 1995). Системные исследования метанотрофов психросферы под руководством акад. Г.А. Заварзина привели к выделению из тундровой почвы первого психрофильного метанотрофа Methylobacter psychrophilus (Омельченко, 1993,1996).
Метан присутствует также в анаэробных грунтовых водах гранитных пород в концентрациях от 1 мкМ до 18 мМ, где в основном имеет геохимическое происхождение, а также является результатом биохимической активности метаногенов (Sherwood et al., 1993; Pedersen, 1997). Повышающаяся с глубиной радиация может приводить к появлению молекулярного кислорода вследствие радиолиза воды, создавая, таким образом, условия для развития аэробных метанотрофов. Хотя
присутствие и роль метанотрофов в подземных микробных сообществах практически
не изучались, тем не менее, эти экстремальные экосистемы следует рассматривать как потенциальный ресурс новых метанотрофных бактерий.
Цель и задачи исследований
Цель данной работы - поиск и выявление особенностей биологии аэробных метанотрофных бактерий различных экстремальных экосистем. Для достижения этой цели решали следующие основные задачи:
Оценить потенциальную активность потребления метана аэробными метанотрофными сообществами различных экстремальных экосистем.
Выделить чистые культуры доминирующих метанотрофных бактерий из соленых и содовых озер, термальных источников, грунтовых вод глубинных залежей гранитов.
Идентифицировать метанотрофные изоляты из различных экстремальных биотопов с привлечением подходов полифазной таксономии.
Исследовать основные цитологические, культуральные и физиолого-биохимические особенности экстремофильных/толерантных метанотрофов, обуславливающие их адаптацию к соответствующим биотопам.
Изучить основные механизмы осмоадаптации у галофильных и галотолерантных метанотрофов.
Сформировать коллекцию чистых культур экстремофильных/толерантных метанотрофов.
Научная новизна
Впервые из экстремальных экоситем различных географических регионов мира выделены и детально охарактеризованы умеренно галофильные, алкалофильные, термофильные и психроактивные метанотрофы. Выделенные из содовых и соленых озер Центральной и Юго-Восточной Азии, Америки и Африки галофильные и алкалофильные метанотрофы классифицированы как новые виды родов Methylomicrobium {Mm. alcaliphilum, Mm. buryatense, Mm. modestohalophilum) и Methylocystis (Mcs. gottschalki). Из термального источника Японии выделен в чистую культуру и классифицирован как новый род и вид умеренно термофильных галотолерантных метанотрофов Methylothermus thermalis, образующий вместе с галофильным мезофильным метанотрофом Methylohalobius cremeensis филогенетически обособленную ветвь в подклассе Gammaproteobacteria. Выявлены галотолерантность и факторы, регулирующие полиморфизм умеренно термофильных метанотрофов рода Methylocaldum. Из подземных вод глубинных залежей гранитов
Финно-Скандинавского шельфа выделены штаммы психроактивных метанотрофов, представляющие новый вид Methylomonas scandinavica.
В многолетнемерзлых породах найдены гены практически всех известных родов метанотрофных бактерий, включая мезофильные, психрофильные/психротрофные и термотолерантные формы. Показано, что метанотрофы даже после длительного пребывания в мерзлоте (от 1 тыс до 1.8-3 млн лет) способны окислять и ассимилировать метан, в том числе при отрицательной температуре, поэтому могут быть активными в вечномерзлых экосистемах.
Расшифрованы механизмы осмоадаптации галоалкалофильных метанотрофов: аккумуляция органических осмопротекторов (эктоина, глутамата, сахарозы) и ионов калия в клетках, накопление фосфатидилглицерина и фосфатидилхолина в составе мембран, формирование гликопротеиновых S-слоев р2 или рб симметрии. Выявлен новый тип трехмерной организации S-слоев у метанотрофов.
У галотолерантных и галофильных метанотрофов впервые определены пути биосинтеза органических осмопротекторов, нуклеотидные последовательности и организация генов биосинтеза эктоина, проведен их филогенетический анализ. Обнаружена связь наличия гена аспартокиназы (ask) в кластере ес/-генов с повышенной солеустойчивостью метанотрофов и особенностями центрального метаболизма. Впервые клонирована, очищена и охарактеризована диаминобутират-ацетилтрансфераза, катализирующая одну из ключевых стадий биосинтеза эктоина, выявлена регуляция синтеза эктоина на уровне активности данного фермента.
Практическая значимость работы
Создана коллекция детально охарактеризованных
экстремофильных/толерантных метанотрофов, которая служит базой референтных штаммов при идентификации новых изолятов, а также при проведении сравнительных физиолого-биохимических исследований. Способность галофильных метанотрофов накапливать циклическую иминокислоту эктоин (до 15% веса сухой биомассы) может быть использована для получения данного биопротектора, применяемого в медицине, косметике и научной практике. Проведенная расшифровка нуклеотидных последовательностей генов и организации структуры эктоинового оперона создала реальные предпосылки получения эктоина путем целенаправленного генно-инженерного конструирования новых эффективных штаммов-продуцентов на основе непищевого сырья - метана и метанола. Полученные сведения о механизмах регуляции
ферментов пути биосинтеза эктоина у галофильных метанотрофов способствуют подбору оптимальных условий их культивирования с целью увеличения выхода этого универсального биопротектора. Обнаруженная нами способность галотолерантных метанотрофов синтезировать экзополисахариды из метана или метанола может найти практическое применение. Полученная научно-методическая информация об особенностях биологии экстремофильных/толерантных метанотрофов используется в курсе при чтении лекций в Пущинском государственном университете, 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, 3.
Апробация результатов
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции памяти акад. Е.Н. Кондратьевой "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 1996, 2005), международных симпозиумах "Microbial Growth on Сі Compounds" (Геттинген, 1989; Уорик, 1992; Сан-Диего, 1995), Гордоновских научных конференциях "Молекулярные основы микробного Сі метаболизма" (Нью Хемпшир, 1998; Коннектикут колледж, 2002; Маунт Холиок колледж, 2004, США), международном INTAS симпозиуме (Москва, 1997), международных конференциях "MICROBIAL RESPONSE ТО STRESS: what's new and how can it be applied?", Сесимбра, Португалия, 1997.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 статьи и 6 обзоров.
Благодарности
Автор выражает благодарность сотрудникам ИБФМ РАН, принимавшим участие в данной работе: с.н.с. лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов к.б.н. Сузиной Н.Е. за помощь в исследованиях ультраструктуры экстремофильных метанотрофов, с.н.с. к.х.н. Сахаровскому В.Г. за идентификацию осмопротекторов методами 13С- и 'Н-ЯМР спектроскопии, к.б.н. Калюжной М.Г., м.н.с. Решетникову А.С., м.н.с. Ешинимаеву Б.Ц, а также аспирантам Медведковой К.А., Цыренжаповой И.С., Мустахимову И.И., магистрантам Смирновой К.В. и Рыжмановой Я.В. Их вклад адекватно отражен в соответствующих публикациях. Автор признателен сотрудникам Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН чл.-корр. Гальченко В.Ф. за внимание к работе, д.б.н. Жилиной Т.Н. и д.б.н. Горленко В.М. за любезно предоставленные пробы ила содовых озер, д.б.н. Дедыш С.Н. и д.б.н. Васильевой Л.В за плодотворное сотрудничество в изучении ацидофильных и
психрофильных метанотрофов, к.б.н. Лысенко A.M. за определение ГЦ состава ДНК. Автор признателен д.гм.н. Д.А. Гиличинскому и к.б.н. Е.М. Ривкиной (Институт физико-химческих и биологических проблем почвоведения РАН) за предоставленные образцы и возможность проведения экспериментов. Автор выражает благодарность д.б.н. Осипову Г.А. (академическая группа РАМН, Москва) за анализ жирнокислотного состава бактерий.
Особую благодарность автор выражает д.б.н., профессору Ю.А. Троценко - инициатору этой работы и научному консультанту, а также профессору Г. Готтшалку (Геттингенский университет, Германия) за внимание и поддержку данных исследований в рамках программы INTAS.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
История развития метапотрофии как научного направления
В 2005 г. исполнилось 100 лет со дня опубликования первого научного сообщения о выделении метанокисляющих (метанотрофных) бактерий (Kaserer, 1905). Интерес к биологии этих уникальных микроорганизмов, вносящих существенный вклад в глобальный баланс атмосферного метана, обладающего почти в 30 раз большим парниковым эффектом, по сравнению с углекислым газом, неуклонно возрастает.
Разумеется, первооткрыватели метанотрофов - Казерер и Збнген (Kaserer, 1905; Sohngen, 1906, 1910), вряд ли представляли реальные масштабы и значение жизнедеятельности этих бактерий, также как другие научно-практические следствия своего открытия. Более того, это открытие в течение полувека оставалось известным немногим. И лишь основополагающие работы исследователей из США и Великобритании (Dworkin, Foster, 1956; Foster, Davis, 1966; Quayle, 1969; Whittenbury et al., 1970) придали новый импульс к познанию уникального способа существования микроорганизмов за счет предельно восстановленного органического газообразного соединения - метана.
Следующему поколению микробиологов и биохимиков с начала 70-х годов прошлого столетия предстояло ответить на ряд принципиальных вопросов: Как метанотрофы окисляют метан - метаболически весьма инертный субстрат? Как метанотрофы получают энергию для синтеза фосфотриоз и как их синтезируют? Какова генетическая организация путей метаболизма у метанотрофов? Насколько широко распространено явление метанотрофии в мире микробов? Каково разнообразие метанотрофов? Каковы экологический статус метанотрофов и их биогеохимическая роль в глобальных циклах углерода? Каков вклад метанотрофов в процесс стабилизации теплового режима биосферы? Какие микроорганизмы ответственны за процесс анаэробного окисления метана? Каков биотехнологический потенциал метанотрофов? Частично ответы на эти вопросы были получены благодаря пионерским работам и существенному вкладу ряда исследовательских лабораторий и групп, интенсивно работавших в России и за рубежом (Табл.1).
Своеобразный «золотой век» прикладной и фундаментальной метанотрофии начался с 70-х годов. Было показано, что метанотрофные бактерии представляют значительный интерес как потенциальные объекты биотехнологии: для производства белка, ферментов, липидов, стеринов, антиоксидантов, пигментов, полисахаридов, факторов транспорта железа, первичных и вторичных метаболитов (аминокислот, органических кислот, растворителей, витаминов, алкалоидов, антибиотиков), биотрансформации органических соединений, для снижения содержания метана в угольных шахтах, создания биосенсоров и энергетических биоэлементов (Humphrey, 1967; Wolnak et al., 1967; Quayle, 1969; Whittenbury, 1969; Davies, 1973; Whittenbury et al., 1975; Иванов с соавт., 1978; Григорян, Горская 1975; Higgins et al., 1980, 1981; Нестеров, 1983). Последовавшее некоторое затишье и даже стагнация, были вызваны, с одной стороны, падением интереса к промышленному производству кормового белка из метана, а с другой - отсутствием адекватных молекулярно-генетических методологий познания сути феномена метанотрофии вследствие объективных трудностей получения мутантов и их генетического анализа.
В то же время, осознание вероятности возможного изменения климата в течение 3-5 поколений в результате катастрофического загрязнения биосферы заставило исследователей задуматься об участии в этих процессах земной микрофлоры. Присутствие метана в атмосфере было открыто в 1948 г, измерена его концентрация, которая достигает значений 1.8 ррт в северном полушарии и 1.7 ррт в южном, а общее содержание составляет 4x109т. С помощью газохроматографического анализа воздушных пузырьков во льдах Гренландии и Антарктики, возраст которых датирован по изотопному составу, были реконструированы условия последних 3000 лет (Rasmussen, Khalil, 1984). Показано, что концентрация метана в атмосфере в течение длительного периода истории Земли была неизменной, но неуклонно возрастает в последние 200 лет, что указывает на весомый вклад техногенных источников (сжигание органики, добыча ископаемого топлива) (Dlugokecky et al., 1998). Несмотря на высокую химическую стабильность, метан разлагается в атмосфере под влиянием коротковолновых лучей посредством фотохимических реакций до СОг и НгО, при этом ключевой является его реакция с гидроксильным радикалом: СН4 + ОН" = СНз" + НгО (Ehhalt, 1976). В дальнейших реакциях образуется формальдегид, который быстро окисляется до СОг и Нг. Таким образом, энергия инфракрасного излучения участвует в химических превращениях газов, и, следовательно, задерживается в атмосфере, что обусловливает парниковый эффект. Молекула метана, вовлекаемая в серию реакций, обладает более сильным парниковым эффектом, по сравнению с молекулой СОг.
Ежегодно содержание метана в атмосфере возрастает на 1%. Поскольку 80-90% метана атмосферы содержит то же количество 4С, что и органическое вещество, а метан газовых, угольных и нефтяных месторождений и абиогенный метан из гидротермальных источников не содержит 14С, метаногенез считается самым важным источником метана. Образование и окисление метана осуществляют две специализированные группы прокариот - анаэробные метаногенные археи, потребляющие водород и ацетат, а также аэробные метанотрофные бактерии. Анаэробные метаногенные археи и аэробные метанотрофы объединены в метановый цикл или цикл Зенгена (Заварзин, 1984, 1995), который может быть замкнут, например, в океане, где метан практически полностью окисляется в аэробной водной толще (Гальченко, 1995), или незамкнутым в некоторых наземных экосистемах. Анаэробные метаногены и аэробные метанокисляющие бактерии не могут развиваться совместно, но они объединены в цикл вследствие диффузии метана из анаэробной зоны в аэробную. В результате дисбаланса в цикле Зенгена метан поступает в атмосферу и участвует в фотохимических реакциях. Метанотрофы обнаруживаются в различных экосистемах, где их присутствие определено наличием метана и кислорода. Чаще всего это водные экосистемы, в донных отложениях которых происходит интенсивное микробное образование метана, а также в почвах нефтегазоносных районов, в очистных сооружениях, стоках животноводческих комплексов, рубце крупнорогатого скота (Dworkin, Foster, 1956; Foster, Davis, 1966; Whittenbury et al., 1970; Гальченко и др., 1975, 1977, 1986). Кроме того, сенсационное открытие образования метана наземными растениями в аэробных условиях без участия анаэробных метаногенных микроорганизмов требует переосмысления биохимии растений, цикла углерода и вклада природных источников метана в климат Земли (Keppler et al., 2006). Наряду с выявлением устойчивой ассоциации метанотрофов с растениями (Троценко с соавт., 2001), это указывает на новую нишу и новую важную функцию метанотрофов в природе. Все больше накапливается данных в пользу того, что метанотрофные бактерии являются эффективным биологическим фильтром на пути выхода метана в атмосферу из мест его образования или захоронения (Заварзин, 1984; Galchenko et al., 1989).
Выделение накопительных и чистых культур метанотрофов
Для выделения накопительных культур пробы ила или воды вносили в колбы объемом от 250 или 750 мл, содержащие 50 мл среды «П». Концентрацию NaCl и рН среды доводили в соответствие со значениями солености и рН in situ. Затем колбы продували 0.5 или 1.5 л смеси метана и воздуха (1:1) и инкубировали при соответствующей температуре в термостате с периодическим перемешиванием. После заметного помутнения среды или образования бактериальной пленки на поверхности среды 5 мл инокуля или пленку переносили в свежую среду и инкубировали в присутствии метана на роторной качалке при 100 об/мин. Процесс накопления метанотрофных бактерий при последовательных пересевах контролировали с помощью фазово-контрастной световой микроскопии. Для выделения метанотрофов II морфотипа использовали среду без меди и с пониженным содержанием азота (KNO3 -0.2 г/л; NH4CI -0,2 г/л).
По мере увеличения доли метанотрофов в накопительных культурах сокращали время между двумя последовательными пассажами до 1-2 дней. В ряде случаев обогащение накопительных культур метанотрофами достигали, отделяя их от, как правило, более мелких гетеротрофных спутников фильтрованием через стерильные мембранные фильтры (с размером пор 0.8-1.5 мкм). Использовали также последовательное центрифугирование: сначала при 3000 g, 3 мин, осадок ресуспендировали в среде и вновь центрифугировали при 2000 g, 5 мин. Последний осадок промывали стерильной средой на фильтрах, которые использовали в качестве инокулята. Чистые культуры выделяли методом истощающегося посева накопительной культуры на чашки с агаризованной средой. В ряде случаев специально готовили чашки с двухслойной агаризованной средой следующего состава: для нижнего слоя использовали стерильный супернатант накопительной культуры, содержащий 1.5% агар; для верхнего слоя - среду "П", 3% NaCl, 0.8% агар.
Чистоту культур контролировали с помощью световой и электронной микроскопии, а также по отсутствию роста на МПА, глюкозо-картофельном агаре (ГКА) (Гальченко с соавт., 1986а), пептоно-дрожжевой среде (ПДС) следующего состава: 0.2% пептона, 0.1% дрожжевого автолизата и 1.5% агар (Difco).
Изучение физиологических свойств
Влияние концентрации NaCl и рН среды на рост чистых культур изучали, используя среду "П" с добавлением различных концентраций NaCl (0 - 15 %) при рН 9.5; 7.0 или оптимальном. Влияние рН среды на рост изучали, культивируя бактерий при оптимальной солености в диапазоне рН от 4.5 до 11.0. Значения рН среды устанавливали добавлением фосфатного (рН 5.0-8.0), Na-карбонатного (рН 8-11.5) или CHES/KOH (рН 9.5) буферов до конечной концентрации 50-100 мМ. Удельную скорость роста бактерий в экспоненциальной фазе рассчитывали по формуле (Перт, 1978): I fy Y — I ГУ Y ц = _e_i—Е_± ч1 где ]gg =0,43429, о и xt - начальная и конечная плотность W о) клеточной суспензии в моменты to и /.
Способность метанотрофов использовать различные источники углерода проверяли на агаризованных средах при оптимальных для данной культуры значениях температуры, солености и рН с добавлением (в концентрации 0.05%): метанола, формальдегида, формиата, метиламина, триметиламина, тетраметиламмония, диметилформамида, цитрата, малата, сукцината, пирувата, ацетата, глюкозы, маннита, мальтозы, арабинозы, ксилозы, сахарозы, этанола или глицерина. Способность использовать различные источники азота проверяли на безазотистой среде при оптимальных для каждой культуры значениях температуры, солености и рН с добавлением (в концентрации 0,01%): (NH SCM, NaN02, мочевины, метиламина, пролина, глицина, аланина, аспартата, глутамата, серина, триптофана или дрожжевого экстракта. Способность штаммов расти автотрофно в атмосфере 1 и СОг определяли по методу, описанному в работе Bodrossy et al. (1995).
Для скрининга штаммов, имеющих sMMO, использовали модифицированный чашечный тест (Graham et al., 1992; Bodrossy et al., 1995). Колонии метанотрофных бактерий на чашке Петри заливали горячей 0.2% агарозой, приготовленной на 0,05 М MOPS-буфере (рН 6.8). Чашки выдерживали 1 ч в эксикаторе, на дно которого были помещены кристаллы нафталина. На поверхность агарозы наливали раствор тетразотированного о-дианизидина (5 мг/мл). Колонии штаммов, содержащих sMMO, окрашивались в пурпурный цвет.
Клетки отделяли от среды центрифугированием (10000 g, 10 мин), дважды отмывали средой и ресуспендировали в малом объеме среды (ОП5ю=6 ед.). Скорость поглощения кислорода измеряли на полярографе LP-7 (Чехия) с использованием платино-хлорсеребряного электрода закрытого типа в ячейке объемом 1.5 мл. При определении скорости окисления метана в зависимости от рН среды в полярографическую ячейку добавляли: 0.4 мл среды, 0.5 мл буферной системы (0.2 М NaH2P04/Na2HP04 для рН 4.2-8.0; 0.2М NaHC03/Na2C03 для рН 8.5-10.0; 0.2М NaH2P04/KOH для рН 10.5-12), 100 мкл клеточной суспензии. После установления постоянной скорости поглощения кислорода клетками (эндогенное дыхание) вносили 0,5 мл насыщенной метаном воды. Концентрацию кислорода в ячейке рассчитывали по растворимости кислорода воздуха. Сродство бактерий к метану определяли, регистрируя скорость потребления кислорода в зависимости от концентрации СН4. В ячейку добавляли различные количества насыщенной метаном воды (принимая растворимость СН4 в воде равной 33.1 мл/л). Ks рассчитывали по уравнениям Лайнуивера-Бэрка и Эди-Хофсти (Перт, 1978).
Клетки выращивали в течение 20 ч на среде "П" с различными концентрациями NaCl (0.2-1.4 М) и рН среды 7, 9, 10, центрифугировали и ресуспендировали в ростовой среде. 1 мл суспензии вносили в пенициллиновые флаконы (16 мл), в которые помещали пробирку с 0.4 мл 2 N NaOH для поглощения С02. После замены газовой фазы смесью метана и воздуха (1:1), флаконы закрывали резиновыми пробками, инкубировали 3 мин, затем вносили 0.2 мл СН4 (конечная удельная радиоактивность 0.016 мкКи/мкмоль) и встряхивали при 30С на качалке. Через определенные интервалы времени шприцем вносили 0.2 мл 3 N НС1. Для полного связывания С02 щелочью флаконы выдерживали в течение ночи. Аликвоты суспензии клеток и щелочи наносили на стекловолокнистые фильтры GF/F (Amersham, Англия), высушивали и просчитывали радиоактивность.
Потенциальная активность потребления метана в соленых и щелочных водоемах
Потенциальную активность потребления метана образцами ила из содовых озер разных географических регионов России, Монголии, Египта и Северной Америки оценивали по скорости образования 14С02 из 14СН4 и по включению радиоуглерода в кислотоустойчивые продукты, последнее служило индикатором ассимиляцинных процессов (табл. 6). Выявлен ряд закономерностей процесса потребления метана в соленых и щелочных водоемах.
1) Потенциальная активность потребления метана в осадках содовых озер в ряде образцов достигала значений 15-32 нмоль СН мл -сут"1 (табл.6,7), сопоставимых с интенсивностью окисления метана в пресных водоемах (Гальченко, 2001), однако на порядок превышавших потребление метана в гиперсоленых нейтральных озерах Крыма (Sokolov, Trotsenko, 1995). Скорость окисления и ассимиляции метана, как правило, выше в пробах из слабоминерализованных содовых озер (табл. 6).
2) Активность процесса потребления метана в содовых озерах Южного Забайкалья выявлена в широком диапазоне значений рН - от 5 до 11. В ряде случаев обнаружены два пика потребления 14СН4 - в кислой (рН 5.8 - 6.0) и щелочной (рН 8.2 9.4) областях, что указывало на присутствие разных физиологических групп метанотрофных бактерий, или метанотрофов, способных адаптироваться к значительным колебаниям рН.
3) Большинство проб щелочных озер Юго-Восточного Забайкалья катализировали образование нитрита из аммония, причем скорости окисления NH/ были соизмеримы со скоростями окисления метана (табл. 7). Окисление аммония ингибировалось в присутствии метана, что отражало активное участие в этом процессе не только нитрификаторов, но и метанотрофов.
Эти данные, в совокупности со способностью чистых культур галоалкалофильных метанотрофов окислять аммоний до нитрита при рН 9.0-10.5, впервые обнаруженной Д.Ю. Сорокиным у Methylomicrobium keniense AMOl (Sorokin et al., 2000), а также выявленной нами у Methylomicrobium buryatense 5B, указывают на участие метанотрофов в проведении первой фазы нитрификации, и, следовательно, в поддержании уровня связанного азота в сильно щелочных экосистемах.
Сравнение выявленных нами активностей бактериального метанокисления с литературными данными по измерению интенсивностей метаногенеза (Намсараев с соавт., 1999) в ряде щелочных озер Юго-Восточного Забайкалья показало, что потенциальная скорость потребления метана превышала скорость его образования в анаэробной зоне донных осадков. Можно предположить, что метанотрофы способны потреблять весь биогенный метан в содовых озерах.
Выделение чистых культур галофильных и алкалофильных метанотрофов
Основной подход при выделении чистых культур метанотрофных бактерий, наиболее адаптированных к условиям биотопа, заключался в использовании сред и параметров культивирования, которые максимально соответствовали условиям in situ. Как правило, метанотрофные сообщества экстремальных экосистем состояли из тесно связанных ассоциаций гетеротрофных и метанотрофных бактерий, и попытки их разделения приводили к потере метанотрофного компонента. Это, по-видимому, связано с зависимостью метанотрофов от образуемых гетеротрофами ростовых факторов, в первую очередь, осмопротекторов, синтез de novo которых у метанотрофов мог быть репрессирован. Поэтому для обогащения накопительных культур метанотрофами использовали несколько специальных приемов.
1. На первых этапах выделения в среды добавляли фильтрат культуралыюй жидкости накопительной культуры или спутника. В сочетании с методом ускоряющегося пассирования (сокращение временного интервала между пересевами), это приводило к накоплению метанотрофов и последующему отбору штаммов, полностью независимых от экзогенных ростовых факторов.
2. Асептическое фильтрование и/или центрифугирование накопительных культур для отделения относительно крупных и тяжелых клеток метанотрофов от, как правило, более мелких и легких гетеротрофных спутников позволяло значительно ускорить процесс их обогащения метанотрофами.
3. Поскольку в образцах ила соленых озер присутствовали простейшие, добавление ингибитора роста эукариот - циклогексимида (20 мкг/мл), было необходимым условием для успешного выделения метанотрофов, служащих источником питания для Protozoa (Lidstrom, 1988).
4. При выделении чистых культур метанотрофов с неизвестными физиологическими свойствами проводили подбор оптимальных режимов культивирования радиоизотопным методом, измеряя скорость ассимиляции 14С-метана накопительными культурами в различных ростовых условиях. Эти приемы в итоге привели к выделению чистых культур и созданию первой коллекции галофильных и галоалкалофильных метанотрофов.
Морфофизиологические особенности метанотрофов рода Methylocaldum
Проведенный скрининг показал, что присутствие растворимой формы ММО, наряду с мембранной ММО, является штаммовым свойством галоалкалофильных метанотрофов. Только Mm. buryateme 5G способен к окислению нафталина до нафтола и имеет ген, кодирующий sMMO, что подтверждено ПЦР с использованием праймера ттоХ\12 (табл. 5).
Пути первичного и промежуточного метаболизма изолятов соленых и щелочных озер достаточно типичны для метанотрофов I или II морфотипов. Галоалкалофильные штаммы окисляют метан до СОг с участием дегидрогеназ метанола, формальдегида и формиата. Штаммы, отнесенные к родам Methylomicrobium и Methylobacter, ассимилируют углерод метана на уровне окисленности формальдегида через РМФ-цикл, о чем свидетельствует присутствие ключевого фермента этого пути -гексулозофосфатсинтаы. По аналогии с известными метанотрофами, у них функционируют два пути распада фосфосахаров: через 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазу и фруктозобисфосфатальдолазу (табл. 12, рис. 10), при этом в гликолитической последовательности участвует пирофосфат- (но не АТФ) зависимая 6-фосфофруктокиназа. Цикл Кребса разомкнут на уровне а-кетоглутаратдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназа проявляет активность только с НАДФ+. Ферменты глиоксилатного шунта (изоцитратлиаза и малатсинтаза) отсутствуют. Ассимилируют аммоний посредством восстановительного аминирования а-кетоглутарата и пирувата, а также через глутаматный цикл (ГС/ГОГАТ).
За исключением Methylocystis gottschalki ВЗ, реализующего сериновый путь Сі-ассимиляции (у штамма присутствуют активности оксипируватредуктазы и серин-глиоксилатаминотроансферазы), все изоляты содовых и соленых озер усваивают углерод через РМФ-цикл. Как известно, РМФ-цикл энергетически более эффективен по сравнению с другими известными для метанотрофов и метилобактерий путями С\-метаболизма - сериновым и рибулозобисфосфатным (Anthony, 1991). Преобладание метанотрофов с РМФ-путем в содовых и соленых водоемах представляется закономерным результатом селективного отбора, поскольку существование в условиях высокой солености и/или щелочности связано с дополнительными энергетическими затратами на поддержание ионного гомеостаза клеток и биосинтез осмопротекторов.
Поскольку использованные нами условия для выделения чистых культур метанотрофов способствовали выявлению наиболее адаптированных и быстрорастущих форм, некоторые представители метанотрофных сообществ (гипер)соленых и щелочных озер, очевидно, остались вне поля зрения. Несомненно, для более адекватной оценки видового разнообразия метанотрофов в этих экстремальных экосистемах необходимо сочетание традиционных подходов с методами молекулярной экологии.
К настоящему времени наиболее полная картина разнообразия метанотрофов в двух содовых озерах Южного Забайкалья была получена методом SIP (Lin et al., 2004). В ДНК из проб донных осадков озер Горбунка и Сундутуйский Тором присутствовали гены 16S рРНК и рММО, специфичные для практически всех известных родов метанотрофов, включая тех, которые в чистых культурах представлены термофильными, нейтрофильными и даже ацидофильными формами. Это свидетельствует о высокой выживаемости метанотрофов в экстремальных условиях содовых озер. Достаточно высокое филогенетическое разнообразие метанотрофных бактерий, выявленное анализом ДНК, согласуется с предположением об экстремально алкалофильном микробном сообществе содовых озер как реликтовом аналоге древней наземной биоты (Заварзин, 1993; Заварзин с соавт., 1999). Однако, анализ генов 16S рРНК, РтоА и МтоХ в «тяжелой» ДНК из образцов, предварительно инкубированных с СИ , выявил, что за окисление метана в этих биотопах ответственны метанотрофы I морфотипа, относящиеся к родам Methylomicrobium, Methylobacter, Methylomonas и Methylothermus (Lin et al., 2004).
Метанотрофные бактерии могут усваивать в качестве источника углерода и энергии не только метан, но и метанол. Однако метанол токсичен для большинства метанотрофов в концентрации выше 0.1%. Способность к росту в присутствии 0.2% метанола используется в качестве одного из фенотипических признаков при идентификации метанотрофов (Whittenbury et al., 1970; Гальченко с соавт., 1984, 1986а). Известно лишь несколько штаммов метанотрофов, способных расти при относительно высоких концентрациях метанола. Так, Methylococcus capsulatus рос в присутствии 0.2% метанола в периодической культуре или при концентрации метанола 1% в непрерывном режиме (Linton, Vokes, 1978). Но, как правило, при хемостатном культивировании остаточное содержание метанола невелико. Метанотрофы с сериновым путем Methylocystis parvus ОВВР и Methylosinus trichosporium ОВЗЬ после длительной адаптации росли в среде, содержащей 4% метанола (Hou et al., 1979; Best, Higgins, 1981). Однако причины чувствительности или механизмы устойчивости различных метанотрофов к метанолу не были выяснены.
Основной причиной ингибирования роста метанотрофов на метаноле может быть накопление в среде формальдегида. Являясь центраболитом метилотрофов, это высоко-реакционноспособное соединение, накапливаясь в среде в случае дисбаланса скоростей окисления и ассимиляции Сі-соединений, может инактивировать ферменты, системы транскрипции и трансляции (Attwood, Quayle, 1984).
Methylomicrobium buryatense 5В на метане (а) или метаноле (б).
Примечательной особенностью галоалкалофильных метанотрофов является их устойчивость к относительно высоким концентрациям метанола (до 7%, v/v), что, как правило, не свойственно метанотрофам I типа. Рост Methylomicrobium buryatense 5В на метаноле происходил с более высокой скоростью, чем на метане, и сопровождался накоплением в среде формальдегида (1.2 мМ), формиата (8 мМ) (рис. 11), а также экзополисахарида (2.6 г/л), содержащего 23% белка и 77% углеводов. Формальдегид в среде не накапливался растущей на метане культурой (рис. 11). Растущие на метаноле метанотрофы накапливают гликоген в клетках (рис. 12), причем уровень гликогена достигает значений 35% массы клеток, характеризующихся также значительной редукцией ВЦМ (рис. 14м).
