Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1. Сообщество хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих Fe , S /S " и сульфидные минералы при низких значениях рН 14
2. Характеристика Acidithiobacillus ferrooxidans 18
2.1. История открытия. Таксономическое положение 18
2.2. Особенности морфологии и структурной организации клетки 19
2.3. Физиология и метаболизм A. ferrooxidans 21
2.3.1. Физиологические особенности 21
2.3.2. Особенности конструктивного и энергетического метаболизмов 23
2.4. Механизмы бактериального окисления Fe2+, S/S2" и сульфидных минералов 25
2.4.1. Участие клеточных структур и метаболитов в процессах окисления Fe2+, S и сульфидных минералов 26
2.4.2. Окисление Fe2+ 27
2.4.3. Окисление элементной серы и её восстановленных соединений 33
2.4.4. Окисление сульфидных минералов 37
2.5. Генетическая система A. ferrooxidans 41
2.5.1. Размер генома и нуклеотидный состав ДНК . 41
2.5.2. Генный состав A. ferrooxidans: характеристика отдельных генов и продуктов их экспрессии 42
2.5.3. Мобильные нуклеотидные повторяющиеся последовательности в геноме A. ferrooxidans 45
2.5.4. Плазмиды A. ferrooxidans 48
3. Фенотипические и генотипические характеристики штаммов A. ferrooxidans . 53
3.1. Штаммовый полиморфизм A. ferrooxidans 53
3.2. Штаммовый полиморфизм структуры хромосомной ДНК
у A. ferrooxidans 55
3.3. Влияние различных факторов среды на генотипическую изменчивость A. ferrooxidans 56
3.3.1. Влияние субстрата окисления 57
3.3.2. Влияние концентрации ионов металлов 58
3.3.3. Влияние рН среды 59
Заключение по обзору литературы 61
Глава 2. Объекты и методы исследований 63
2.1. Штаммы A. ferrooxidans и условия культивирования 63
2.2. Методы исследований 66
2.2.1. Аналитические методы 66
2.2.2. Генетические и молекулярно-биологические методы 66
2.2.2.1. Выделение ДНК 66
2.2.2.2. Анализ ДНК 69
2.2.2.3. Перенос и гибридизация по Саузерну 73
2.2.2.4. Амплификация и секвенирование генов 16S рРНК 75
2.3. Филогенетический анализ 76
2.4. Математико-статистический анализ данных 76
Глава 3. Результаты и обсуждение 78
3.1. Изучение генотипического полиморфизма штаммов A. ferrooxidans и оценка филогенетической гетерогенности вида 78
3.1.1. Экологическое разнообразие штаммов A. ferrooxidans 78
3.1.2. Анализ сходства структуры хромосомной ДНК штаммов A. ferrooxidans методом пульс-электрофореза 81
3.1.3. Нуклеотидный состав ДНК и размер генома у штаммов A. ferrooxidans 83
3.1.4. Анализ сходства тотальных геномов штаммов A. ferrooxidans методом ДНК-ДНК гибридизации 84
3.1.5. Филогенетический анализ генов 16S рРНК и оценка филогенетической гетерогенности вида A. ferrooxidans 87
3.2. Изучение фенотипических особенностей штаммов A. ferrooxidans 90
3.2.1. Штаммы A. ferrooxidans и характеристика субстратов их выделения..„92
3.2.2. Окисление Fe2+ 94
3.2.3. Адаптация штаммов A. ferrooxidans к новым энергетическим субстратам 96
3.2.3.1. Адаптация штаммов A. ferrooxidans к элементной сере 96
3.2.3.2. Адаптация штаммов A. ferrooxidans к пириту 100
3.2.3.3. Адаптация штаммов A. ferrooxidans к сульфидному концентрату 103
3.3. Изучение особенностей структуры хромосомной ДНК у штаммов A. ferrooxidans, адаптированных к разным энергетическим субстратам 109
3.4. Штаммовый полиморфизм плазмидных профилей у A. ferrooxidans 123
3.4.1. Плазмидные профили штаммов A. ferrooxidans, выделенных из природных субстратов 123
3.4.2. Плазмидные профили штаммов A. ferrooxidans с экспериментально повышенной устойчивостью к ионам металлов или токсичных элементов... 126
3.5. Изучение плазмидных профилей штаммов A. ferrooxidans, адаптированных к разным энергетическим субстратам 129
3.6. Изучение взаимодействия хромосомной и плазмидной ДНК у штаммов A. ferrooxidans, адаптированных к разным субстратам окисления 137
3.6.1. Рестрикционный анализ плазмид из штамма A. ferrooxidans TFBk 138
3.6.2. Гибридизация ДНК плазмиды рТЖ2 с хромосомной ДНК штаммов A. ferrooxidans, адаптированных к разным энергетическим субстратам 141
3.6.2.1. Гибридизация ДНК плазмиды pTFK2 с хромосомной ДНК штамма TFBk, адаптированного к разным субстратам окисления 141
3.6.2.2. Гибридизация ДНК плазмиды pTFK2 с хромосомной ДНК других штаммов A. ferrooxidans адаптированных к разным субстратам окисления... 144
Заключение.. 150
Выводы 157
Литература 159
- Сообщество хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих Fe , S /S " и сульфидные минералы при низких значениях рН
- Мобильные нуклеотидные повторяющиеся последовательности в геноме A. ferrooxidans
- Анализ сходства тотальных геномов штаммов A. ferrooxidans методом ДНК-ДНК гибридизации
- Адаптация штаммов A. ferrooxidans к сульфидному концентрату
Введение к работе
Постановка проблемы и её актуальность. В процессе эволюции отдельные представители филогенетически отдалённых групп микроорганизмов приобрели способность получать энергию за счет окисления закисного железа, элементной серы и её восстановленных соединений или сульфидных минералов в кислых условиях среды. Это грамотрицательные бактерии родов Acidithiobacil-lus и Leptospirillum, грамположительные бактерии рода Sulfobacillus, а также некоторые археи: представители родов Acidianus, Metallosphaera, Sulfolobus и Ferroplasma. В природных условиях данные микроорганизмы участвуют в процессе выщелачивания металлов из сульфидных руд и горных пород, охватывая широкий диапазон физико-химических параметров среды (рН от 0,7 до 3,5; температура от 5 до 80 °С). В биогидрометаллургии сообщества этих микроорганизмов используются в бактериально-химических технологиях извлечения цветных и благородных металлов из сульфидных руд и концентратов, в разработку научных основ переработки которых большой вклад внесли отечественные учёные [Каравайко и др., 1972; Полькин и др., 1982].
Доминирующей бактерией в мезофильном сообществе ацидофильных хемо-литотрофных микроорганизмов является A. ferrooxidans. Использование в качестве источников энергии широкого круга окисляемых субстратов (от водорода до многокомпонентных сульфидных руд), устойчивость к ионам тяжёлых металлов (Zn2+, Cu2+, Ni2+, Со2+, Fe2 1 и др.), низким значениям рН, а также высокий уровень изменчивости в экстремальных условиях среды обусловливают ведущую роль A. ferrooxidans в бактериально-химических процессах вскрытия золота или выщелачивания цветных металлов. Последнее, во многом, определило характер исследований физиологии, биохимии и генетики данного микроорганизма. Изучены особенности конструктивного и энергетического метаболизма A. ferrooxidans [Ingledew, 1982; 1986], устойчивость к ионам металлов и токсичных элементов [De et al., 1997, Sampson et al., 2001]. Подробно исследованы компоненты железоокисляющей системы A. ferrooxidans [Rawlings, 2001], охарактеризованы отдельные ферменты пути окисления серы и её восстановленных соединений [Sugio et al., 1987; 1988 а; 1989]. Идентифицировано множество генов этой бактерии, изучена их регуляция, а также кодируемые белки. Много внимания было уделено созданию рекомбинантных, с улучшенными технологически значимыми свойствами штаммов A. ferrooxidans. Однако инициированные в начале 90-х годов отечественными авторами работы [Кондратьева и др., 1993] с использованием метода пульс-электрофореза для мониторинга состава микробных популяций в технологических процессах извлечения золота или выщелачивания цветных металлов позволили прийти к заключению о бесперспективности применения в биогидрометаллургии созданных генно-инженерными методами штаммов A. ferrooxidans, как не выдерживающих в переменных по субстрату и другим параметрам среды условиях технологического процесса конкуренции с природными аборигенными штаммами.
Из природных (горные породы, месторождения сульфидных руд, рудничные воды), а также технологических сред (плотные пульпы биогидрометаллургиче-ских установок по переработке руд и концентратов) исследователями разных стран выделено большое число штаммов A. ferrooxidans. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об их значительном разнообразии, как по фено-типическим, так и генотипическим признакам. Штаммы A. ferrooxidans разного происхождения различаются по размеру генома, содержанию нуклеотидных пар Г + Ц в ДНК, степени ДНК-ДНК гомологии тотальных геномов, плазмидным профилям [Harrison, 1982; 1986; Leduc, Ferrony, 1994; Rawlings, Kusano, 1994], оптимальным для роста значениям рН и температуры, устойчивости к ионам тяжёлых металлов и токсичных элементов, активности окисления разных субстратов [Грудев, 1985; Pichuantes et al., 1986; Frattmi et al., 2000]. Как возникло это штаммовое разнообразие, чем вызывается, какими механизмами реализуется? Какова роль штаммового полиморфизма в биогидрометаллургических процессах? Отсутствие ответов на эти вопросы свидетельствует об актуальности поставленной проблемы не только в теоретическом плане, но и в плане практической значимости.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение фенотипи-ческого и генотипического полиморфизма штаммов A. ferrooxidans, факторов среды, его вызывающих, и механизмов возникновения.
Задачи исследования включали:
1. Изучение генотипического полиморфизма штаммов A. ferrooxidans разного происхождения и оценка филогенетической гетерогенности вида.
2. Изучение фенотипических особенностей штаммов A. ferrooxidans и динамики их адаптации к разным энергетическим субстратам.
3. Анализ рестрикционных профилей хромосомной ДНК у штаммов A. ferrooxidans, адаптированных к разным субстратам окисления.
4. Изучение штаммового полиморфизма плазмидных профилей у A. ferrooxidans.
5. Анализ плазмидных профилей у штаммов A. ferrooxidans с экспериментально повышенной устойчивостью к ионам металлов и у адаптированных к разным энергетическим субстратам.
6. Исследование возможных механизмов внутривидовой изменчивости A. ferrooxidans и оценка роли отдельных факторов среды в существующем разнообразии штаммов.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые использован комплексный подход в исследовании штаммового полиморфизма вида A. ferrooxidans, заключающийся в изучении особенностей генотипа, фенотипа и механизмов изменчивости у одних и тех же штаммов в одинаковых условиях среды. Проведён полифазный генотипический анализ 15 штаммов A. ferrooxidans; выделенных в лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии РАН из различных по минералогическому составу типов субстратов; изучены ряд ключевых фенотипических признаков некоторых штаммов (скорость роста, эффективность адаптации к разным энергетическим субстратам и активность их окисления), а также штаммовая генотипическая изменчивость А. ferrooxidans, проявляемая на уровне хромосомной и плазмидной ДНК. В результате проведённых исследований получены дополнительные сведения о роли субстрата окисления в дивергенции штаммов A. ferrooxidans в разных экологических нишах, об изменениях в последовательности нуклеотидов в хромосомной ДНК как одном из механизмов штаммовой микроэволюции. Впервые отмечено влияние некоторых факторов среды: концентрации ионов металлов и субстрата окисления на плазмидные профили ряда штаммов A. ferrooxidans, что позволяет предположить участие плазмид в адаптации этой бактерии к изме-няющимся факторам среды. Впервые исследована возможность взаимодействия плазмидной и хромосомной ДНК как одного из механизмов адаптационной изменчивости A. ferrooxidans. Показано, что адаптация штаммов A. ferrooxidans к новым энергетическим субстратам может сопровождаться изменением локализации IS-элементов в геноме и плазмидно-хромосомными рекомбинациями. Необратимость этих процесов приводит к внутривидовой изменчивости, лежащей в основе микроэволюционных процессов, результатом которых является штам-мовый полиморфизм вида A. ferrooxidans.
Полученные в работе результаты исследования генотипических и фенотипи-ческих признаков различных штаммов A. ferrooxidans в зависимости от факторов среды, механизмов адаптации и регуляции активности окислительных процессов могут быть использованы при разработке стратегии управления бактериально-химическими процессами выщелачивания металлов, выработке практических рекомендаций по их интенсификации.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодых учёных «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), Всероссийской конференции по развитию концепции микробной экологии в XXI веке, посвященной 100-летию со дня рождения Кузнецова С. И. (Москва, ИНМИ РАН, 2000), конкурсе научно-исследовательских работ Института микробиологии РАН (2001), 1-м и 2-м Международных Конгрессах «Биотехно логия: состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), XV Международной молодёжной научной конференции - школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003), 15-м Международном симпозиуме по биогидрометаллургии (Греция, 2003).
Публикации. По материалам диссертации, включая тезисы, опубликовано семь работ; три статьи и двое тезисов сданы в печать.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 190 страницах машинописного текста, включают 10 таблиц и 43 рисунка. Диссертация состоит из введения, трёх глав («Обзор литературы», «Объекты и методы исследований», «Результаты и обсуждение»), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 308 наименований работ, в числе которых 38 на русском и 270 на иностранных языках.
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории хемолито-трофных микроорганизмов (зав. лабораторией чл.-корр. РАН Каравайко Г. И.) Института микробиологии РАН, Москва.
Благодарности. Автор благодарит сотрудников ИНМИ РАН к. б. н. Лысенко А. М., к. б. н. Турову Т. П. и научного сотрудника центра «Биоинженерия» РАН Колганову Т. В, за помощь в проведении генотипических исследований штаммов, старшего научного сотрудника ИБХ РАН им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова к. б. н. Данилевича В. Н. за участие в молекулярно-генетических работах и помощь в обсуждении экспериментальных данных.
Автор выражает глубокую благодарность и искреннюю признательность научному руководителю д. б. н. Кондратьевой Т. Ф. за внимательное и чуткое руководство, организацию и планирование экспериментальных исследований, участие в обсуждении результатов и помощь в подготовке рукописи диссертации, а также душевную теплоту и повседневную поддержку в работе. Особую благодарность автор выражает заведующему лабораторией хемолитотрофных микроорганизмов ИНМИ РАН чл.-корр. Каравайко Г. И. за постоянный интерес и внимание к работе, ценные замечания и помощь в обсуждении результатов. Автор признателен всем сотрудникам лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов за проявленный интерес к работе и дружескую поддержку. Автор благодарит Мунтян Л. Н. и Пивоварову Т. А. за предоставление коллекционных культур A. ferrooxidanSj полезные советы и дружеское участие в работе.
Сообщество хемолитотрофных микроорганизмов, окисляющих Fe , S /S " и сульфидные минералы при низких значениях рН
В природных и технологических кислых средах (рН 1,0 - 3,5), содержащих сульфидные минералы, формируются микробные сообщества, которые включают представителей филогенетически отдаленных групп микроорганизмов [Harrison, 1984; Kelly, 1988; Lane, Harrison, 1989; Lane et al., 1992; Johnson, 1998]. Их объединяет способность получать энергию за счет окисления таких неорганических субстратов, какзакисное железо [Blake, Shute, 1992; Blake et al., 1993], элементная сера и её" восстановленные соединения, а также сульфидные минералы в мезофильных или термофильных условиях среды [Lundgren, Silver, 1980; Pronk et al., 1990; Rawlings, Silver, 1995]. Представителями таких микроорганизмов являются грамотрицательные мезофильные бактерии Acidithiobacillus fer-rooxidans [Colmer, Hinkle, 1947; Colmer et al., 1950; Kelly, Wood, 2000], Acidithiobacillus albertensis [Bryant et al., 1983; Kelly, Wood, 2000], Acidithiobacillus thiooxidans [Waksman, Ioffe, 1922; Kelly, Wood, 2000], Leptospirillumferrooxidans [Markosyan, 1972], грамотрицательная умеренно-термофильная бактерия Acidithiobacillus caldus [Hallberg, Lindstrom, 1994; Kelly, Wood, 2000], грамположи-тельные бактерии рода Sulfobacillus: S. thermosulfidooxidans [Golovacheva, Kara-vaiko, 1978] и S. sibiricus [Меламуд и др., 2003], а также некоторые архебактерии: мезофильные рода Ferroplasma [Golyshina et al., 2000] и экстремально-термофильные родов Sulfolobus [Brock et al., 1972; Huber, Stettler, 1991], Acidianus [Segerer et al., 1986], Metallosphaera [Huber et al., 1989]. В природных условиях данные микроорганизмы участвуют в процессах выщелачивания металлов из руд и горных пород, играя ведущую роль в биогеохимических процессах, в частности, круговороте серы, железа и других сопутствующих элементов [Каравайко и др., 1972; Lundgren et al., 1983; Johnson et al., 1993.]. В практи ке добычи металлов сообщества железо- и сульфидокисляющих или сероокис-ляющих бактерий являются наиболее перспективными для промышленного использования в биогидрометаллургических технологиях извлечения золота или выщелачивания цветных металлов из сульфидных руд и концентратов [Кара-вайко и др., 2000; Hutchins et al, 1986; Norris et al, 2000].
Несмотря на основной общий признак - способность использовать при низких значениях рН окисление перечисленных выше субстратов для получения энергии, рассматриваемые микроорганизмы значительно различаются по морфологии, а также физиологическим характеристикам: отношению к температуре, источникам энергетического и конструктивного метаболизма. Оптимальные температуры для роста варьируют от 28 С у мезофильных форм до 45 - 50 С у умеренно-термофильных и 80 С у термофильных. Некоторые представители ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, например, A. ferrooxidans, A. brierleyi, S. thermosulfidooxidans окисляют закисное железо, элементную серу, её восстановленные соединения и сульфидные минералы, тогда как другие способны к окислению либо закисного железа и пирита, например, L. ferrooxidans и F. acidiphilum, либо к окислению элементной серы и её восстановленных соединений, - A. thiooxidans, A. caldus. Эти микроорганизмы являются как строгими автотрофами {A. ferrooxidans, A. thiooxidans, S. metallicus и др.), так и факультативными автотрофами {A. brierleyi, М. sedula) [Пивоварова, Головачёва, 1985]. Представители рода Sulfobacillus могут расти в авто-, гетеро- и миксотрофных условиях, предпочитая последние [Вартанян и др., 1990 а].
Бактерии, окисляющие закисное железо, элементную серу и её восстановленные соединения, а также сульфидные минералы при низких значениях рН, являются аэробами. Однако, как отмечает Джонсон [Johnson, 1998], множество природных изолятов фактически являются факультативными анаэробами, способными сопрягать окисление неорганических доноров электронов с восстановлением ионов трёхвалентного железа (Fe3+). Возможность окисления элементной серы в анаэробных условиях с использованием в качестве акцептора элек тронов Fe показана для A, ferrooxidans, A. thiooxidans и S. acidocaldarius [Brock, Gustafson, 1976], Имеются данные о возможности окисления A. ferrooxidans в анаэробных условиях с использованием в качестве акцептора электронов Fe3+ не только элементной серы, но и пирита, а также ряда других сульфидных минералов [Das, Mishra, 1996]. Кроме того, Sulfolobus, по данным Брайли [Brier-ley, 1974], и A. ferrooxidans, по данным Сугио [Sugio et al, 1988 b], в анаэробных условиях могут окислять элементную серу, используя в качестве акцептора электронов шестивалентный молибден, восстанавливая его до пятивалентной формы.
Существенной физиологической особенностью рассматриваемых микроорганизмов является их устойчивость к некоторым ионам тяжелых металлов и токсичных элементов (Zn2+, Ni2+, Со2+, Cu2+, As3+ и др.), а также способность адаптироваться к их высоким концентрациям в растворе [Вартанян и др., 19906; Tuovinen et al., 1971; Brierley et al., 1980; Kondratyeva et al., 1995; Li, Ke, 2001; Sampson, Phillips, 2001], что особенно важно в биогидрометаллургических процессах выщелачивания металлов.
Таким образом, окислять закисное железо, элементную серу и её восстановленные соединения, а также различные сульфидные минералы при низких значениях рН могут представители разных систематических групп в широком диапазоне физико-химических параметров среды. Их физиологическое разнообразие предполагает разнообразие путей окисления источников энергии, механизмов регуляции этих процессов, уровня устойчивости в экстремальных условиях среды, а также обеспечивает возможность проведения биогидрометаллургических процессов на различных типах минерального сырья и в разных температурных режимах. Физиологические особенности некоторых ацидофильных хе-молитотрофных микроорганизмов, используемых в биогидрометаллургии, представлены в таблице 1.
Мобильные нуклеотидные повторяющиеся последовательности в геноме A. ferrooxidans
Значительный интерес в исследовании генетической системы A. ferrooxidans представляют работы, посвященные изучению мобильных нуклеотидных повторяющихся последовательностей. В геноме A. ferrooxidans Холмсом с соавторами [Yates, Holmes, 1987; Holmes et al., 1988] были обнаружены два семейства таких последовательностей, число копий которых составляло порядка 20 - 30 на геном. Эти последовательности имели размер от 1,3 до 1,4 тпн и встречались как в хромосомной, так и в плазмидной ДНК. Согласно данным этих авторов, приблизительно 6 % хромосомы у штамма A. ferrooxidans АТСС 19859 приходится на долю повторяющихся последовательностей ДНК. Оба семейства были обнаружены у двенадцати из 22 проанализированных Холмсом и Хаком [Holmes, Haq, 1989] штаммов A. ferrooxidans, У четырех штаммов было выявлено только одно из семейств, в геноме шести остальных штаммов повторяющихся последовательностей ДНК обнаружено не было. Все четыре исследованных в работе Хакраборти с соавторами [Chakraborty et al., 1997] штамма A. ferrooxidans содержали в геноме оба семейства повторяющихся последовательностей ДНК.
Детальные исследования показали, что обнаруженные семейства повторяющихся нуклеотидных последовательностей имели структурную организацию, типичную для IS-элементов [Holmes et al., 1988; Yates et al., 1988; Chakraborty et al., 1997] и были названы IST-элементами (IST1 и IST2 соответственно). Структурная организация одного из семейств — IST2 была изучена подробно. На концах 18Т2-элемента, размер которого составляет 1,408 тпн, имелись инвертированные повторы из 25 нуклеотидных пар, а в его структуре были обнаружены три открытых рамки считывания [Yates et al., 1988]. Одна из них, протяженностью 888 пар нуклеотидов, кодировала транспозазу. Анализ аминокислотной последовательности кодируемого белка позволил обнаружить сходство транс-позазы IST2 из A. ferrooxidans с транспозазами ISRm3 из Rhizobium meliloti и IS256 из Staphylococcus aureus [Wheatcroft, Laberge, 1991].
В экспериментах с использованием гибридизации по Саузерну с ДНК культуры A. ferrooxidans, прошедшей несколько генераций, было показано, что TST1 и 13Т2-элементы являются мобильными [Holmes et al., 1988; Holmes, Haq, 1989]. Позднее, в работе Кадица с соавторами [Cadiz et al., 1994], были представлены доказательства того, что IST-элементы A. ferrooxidans перемещаются по геному механизмом транспозиции, а не рекомбинации, и что в геноме имеются «горячие точки» (hot spot) для инсерции 18Т2-элементов.
В геноме A. ferrooxidans присутствуют и другие семейства повторяющихся нуклеотидных последовательностей. Секвенирование части плазмиды A. ferrooxidans pTFI-91 обнаружило в её составе наличие IS-элемента, названного 1ST 3091, размер которого составлял 1,068 тпн. Для этого IS-элемента была показана возможность транспозиции в геноме Е. сої і [Chacravarty et al., 1997]. Группой исследователей под руководством Холмса был охарактеризован еще один IS-элемент, обнаруженный в геноме штамма A. ferrooxidans АТСС 19859. Изуче ниє его структурной организации, а также анализ аминокислотной последовательности транспозазы, кодируемой одной из двух имеющихся в его структуре открытых рамок считывания, обнаружили сходство этого IS-элемента, названного ISAfel, с IS-элементами семейства IS13. В геноме штамма были идентифицированы шесть различных сайтов инсерции ISAfel элемента и показана возможность его перемещения механизмом транспозиции [Holmes et at, 2001 b].
Обнаружение IS-элементов в геноме A. ferrooxidans поставило вопрос об их роли в жизнедеятельности бактерии. Холмс и Хак [Holmes, Haq, 1989] предположили, что IST-элементы участвуют в механизме адаптации A. ferrooxidans к изменяющимся условиям среды, в эволюции структуры и функции генов, в регуляции экспрессии биохимических путей, в обмене генетической информацией между штаммами. Адаптируя A. ferrooxidans к повышенному содержанию меди в среде (40 г/л Си24}, авторы обнаружили изменение в локализации на хромосомной ДНК одного из IST1-элементов. По данным Зао и Холмса [Zhao, Holmes, 1993], инсерция 1ST 1-элемента в специфический ВатН\ рестрикцион-ный фрагмент генома сопровождалась утратой способности A. ferrooxidans окислять железо, а его эксцизия приводила к восстановлению утраченной функции. Сиквенсный анализ структуры IST1 показал наличие регуляторных элементов, которые, по мнению авторов, могут контролировать экспрессию соседних генов. При изменении субстрата окисления с закисного железа на элементную серу, по данным Кадица с соавторами [Cadiz et at, 1994], изменялась локализация 15Т2-элементов. Шредер и Холмс [Schreder, Holmes, 1988] установили, что изменение морфологии образуемых A. ferrooxidans в разных условиях культивирования колоний явилось результатом изменения локализации в геноме A. ferrooxidans IST-элементов, С их присутствием авторы связывают генетическую нестабильность, высокую адаптационную способность A. ferrooxidans в изменяющихся условиях среды.
В геноме некоторых штаммов A. ferrooxidans показано наличие транспозонов (Тп), которые, как и IS-элементы, являются мобильными элементами генома. Однако, в отличие от IS-элементов, транспозоны содержат структурные гены, определяющие функции, не имеющие отношения к процессу транспозиции. Чаще всего — это гены, определяющие устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, тяжелым металлам, токсичным соединениям и др. [Хесин, 1984]. Одним из изученных у A. ferrooxidans транспозонов является Тп 467, обнаруженный в составе плазмиды pTF-FC2 штамма FC, устойчивого к мышьяку [Rawlings et al., 1993]. Исследование структурной организации Тп 467 показало, что транспозон ограничен инвертированными последовательностями транспозона Тп21, который, как известно, несет детерминанты устойчивости к ртути и некоторым антибиотикам [Grinsted et al., 1990]. Внутри границ Тп 467 находятся несколько открытых рамок считывания, одна из которых сходна с геном, кодирующим MerR регуляторныи белок оперона ртутной редуктазы, а другая имеет сходство с геном устойчивости к хлорамфениколу у транспозона Тп 696 плазмиды R 1033 из Pseudomonas aeruginosa [Clennel et al., 1995]. В геноме штамма A. ferrooxidans АТСС 33020 был обнаружен еще один транспозон - Тп 5468, локализованный в структуре хромосомного atp оперона. Этот транспозон был сек-венирован, и в его составе идентифицированы четыре открытых рамки считывания, сходные с генами транспозиции tnsA, tnsB, tnsC и tnsD у транспозона Тп7. В экспериментах с использованием Саузерн-блотт гибридизации Тп 5468 был выявлен еще у трех штаммов A. ferrooxidans [Oppon et al., 1998].
Анализ сходства тотальных геномов штаммов A. ferrooxidans методом ДНК-ДНК гибридизации
Представители каждого из геномоваров, войдя в состав основного филогенетического кластера, оказались, по результатам анализа генов 16S рРНК, в трёх разных филогенетических группах. Типовой штамм A. ferrooxidans АТСС 23270т относился к группе I, штамм TFN-d - к группе II, а штаммы TFY, TFI и TFD - к группе ІП. Таким образом, генетическая гетерогенность вида A. ferrooxidans обнаруживается уже на уровне сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, которые в значительной степени консервативнее последовательностей тотального генома бактерий.
Сравнительный анализ данных, полученных при изучении генотипического полиморфизма штаммов A. ferrooxidans методами ДНК-ДНК гибридизации и анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, показывает, что результаты обоих исследований, в общем, не противоречат друг другу. Распределение штаммов по филогенетическим группам коррелировало с разделением их на геномовары, за исключением случая, когда представители двух разных геномоваров (штаммы TFY и TFI, TFD) по результатам филогенетического анализа вошли в одну филогенетическую группу. Полученные данные позволяют говорить о существовании нескольких уровней генотипическои дивергенции вида A. ferrooxidans, один из которых соответствует филогенетическим группам, а другой - геномов арам. Деление штаммов A. ferrooxidans на филогенетические группы представляет более высокий уровень генотипическои дивергенции, чем деление их на геномовары.
Результаты сравнительного филогенетического анализа генов 16S рРНК большой группы штаммов A. ferrooxidans свидетельствуют, таким образом, как о филогенетическом единстве, так и о составляющей несколько уровней филогенетической гетерогенности вида A. ferrooxidans. Филогенетическое единство этого вида подтверждается результатами анализа нуклеотидного состава ДНК и размера генома, вариабельность которых у изученных штаммов, как видно из представленных выше данных, невелика. В то же время, полученные нами с использованием различных методов данные, указывают на то, что вид A. ferrooxi dans характеризуется значительным генотипическим разнообразием штаммов, выделенных из разных мест обитания. Это разнообразие проявляется в заметной дивергенции нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, низком уровне сходства их тотальных геномов, в различиях структуры хромосомной ДНК, проанализированной методом ПФ.
Какие факторы среды вызывают генотипический полиморфизм штаммов А. ferrooxidans1} Есть ли связь между разнообразием мест обитания и существующим многообразием штаммов? В исследовании Харрисона [Harrison, 1982] корреляции между группированием штаммов и их географическим происхождением установлено не было. Полученные данные были интерпретированы автором как свидетельство селекции генотипов в микроэкологических нишах, образование которых возможно в макросистемах различных географических зон. Результаты, полученные в нашем исследовании, и сопоставление их с данными по минералогической характеристике субстратов, из которых были выделены использованные в работе штаммы A. ferrooxidans, позволили отметить ряд закономерностей. Так, например, штаммы A. ferrooxidans TFO, TFM, TFN-d и TFT, выделенные из золото-мышьяковых пиритно-арсенопиритных руд, по результатам анализа сходства тотальных геномов вошли в один и тот же геномовар, а штаммы ВКМ В-1160, TFP-15, TFN и TFWc, выделенные из субстратов, содержащих цветные металлы (Zn2+n Cu2+), сгруппировались в одном и том же кластере по результатам анализа структуры их хромосомной ДНК методом ПФ. Очевидной представляется необходимость более детального исследования генотипических и фенотипических признаков штаммов A. ferrooxidans разного происхождения во взаимосвязи с анализом субстратов их выделения.
Генотипический штаммовый полиморфизм A. ferrooxidans реализуется через фенотипическое разнообразие штаммов, проявляющееся, как известно, в их различии по ряду физиологических характеристик: оптимальным для роста значениям рН и температуры, устойчивости к ионам тяжёлых металлов и токсичных элементов, активности окисления различных субстратов и др. [Грудев, 1985; Tuovinen, 1971; Pichuantes et al., 1986 a; Suzuki et al., 1990; Hallman et al, 1992; Shively et al., 1993; Frattini et al., 2000]. Биологическая природа этих различий изучена недостаточно, однако, согласно имеющемуся мнению, носит адаптивный характер и связана с условиями жизнедеятельности штаммов A. ferrooxidans в различных экологических нишах [Кондратьева, Каравайко, 1997]. В связи с этим представляло интерес изучение фенотипических особенностей штаммов A. ferrooxidans разного происхождения с целью оценки корреляции фенотипических свойств штаммов с генотипическим полиморфизмом и с условиями среды, в которых протекала их микроэволюция.
Объектами исследования являлись пять штаммов A. ferrooxidans TFV-1, TFN-d, TFBk, TFO и TFL-2, выбор которых объяснялся следующим: 1) штаммы были выделены из разных по минералогическому составу типов субстратов (см. ниже); 2) по результатам генотипического анализа штаммы входили в разные кластеры, обнаруженные при анализе сходства рестриктных профилей их хромосомной ДНК (TFV-1 - кластер 1, TFN-d - кластер 2, TFBk - кластер 3), либо принадлежали к разным геномоварам, согласно данным по ДНК-ДНК гибридизации (TFBk - геномовар 1, TFO и TFN-d - геномовар 2, TFL-2 - геномовар 3). Штамм TFV-1 не входил ни в один из геномоваров и принадлежал к группе значительно дивергировавших штаммов A. ferrooxidans; 3) штаммы были выделены из технологических сред при испытаниях различных бактериально-химических технологий извлечения золота или выщелачивания цветных металлов (см. ниже). Производственные штаммы являются наиболее активными в окислении сульфидных руд и изучение их фенотипических признаков, важнейшими из которых, обеспечивающими конкурентоспособность в экстремальных условиях технологического процесса, являются ско рость роста, активность окисления субстрата и эффективность переключения на окисление нового субстрата, имеет практическое значение,
Адаптация штаммов A. ferrooxidans к сульфидному концентрату
Работу проводили со штаммами A, ferrooxidans, выделенными из плотных пульп реакторов при испытаниях бактериально-химических технологий извлечения золота из концентратов сульфидных руд Нежданинского (штамм TFN-d), Бакырчикского (штамм TFBk) и Олимпиадинского (штамм TFO) месторождений, а также штаммом TFV-1, выделенным из медной руды Волковского месторождения, и штаммом TFL-2, выделенным из пульпы хвостов цикла доводки медно-пиритного промпродукта руды Учалинского месторождения. Эти же штаммы были выделены из соответствующих природных субстратов - сульфидных руд и получаемых из них концентратов. Идентичность промышленных штаммов с выделенными из природных субстратов была установлена по структуре хромосомной ДНК.
В таблице 5 представлены данные, характеризующие условия жизнедеятельности изучаемых штаммов бактерий. Минералогический состав сульфидных руд - субстратов выделения штаммов, был приведён выше (табл. 2), Можно выделить три принципиально различных типа субстратов, определяющих условия жизнедеятельности штаммов в природных экологических нишах (предысторию штаммов): 1) золото-мышьяковые высокосернистые руды и концентраты, содержащие преимущественно пирит и арсенопирит (Нежданинское и Бакырчикское месторождения), а также пирротин (Олимпиадинское месторождение), и характеризующиеся высокой концентрацией накапливаемых в процессе их окисления в жидкой фазе ионов железа и мышьяка; 2) медно-цинковые руды с преимущественным содержанием пирита, сфалерита (ZnS) и халькопирита (CuFeSi) (Учалинское месторождение), а в растворах - ионов меди, цинка и железа; 3) бедные медные руды и отвалы Волковского месторождения с низким содержанием ионов металлов в растворах, Поскольку закисное железо является наиболее легко окисляемым источником энергии для A. ferrooxidans и входит в состав сульфидных минералов субстратов выделения исследуемых нами штаммов A. ferrooxidans, было проведено изучение динамики их роста на среде с данным субстратом. Параметры роста штаммов и окисления закисного железа приведены в таблице 6. Полученные данные близки к известным в литературе для аналогичных периодических условий [McGoran et al., 1969; Kelly, Jones, 1978].
Из представленных в таблице данных видно, что исследуемые штаммы различались по скорости роста и активности окисления закисного железа, на основании чего могут быть условно разделены на три группы. Первая включает штаммы TFN-d и TFL-2, характеризующиеся наибольшей, в сравнении с другими штаммами, активностью роста и окисления субстрата; вторая - штаммы TFBk и TFO, со средней активностью роста. Штамм TFV-1, наименее активно растущий на среде с закисным железом, можно отнести к третьей группе. Это подтверждается данными по удельной скорости роста штаммов, времени генерации, активности накопления биомассы в единицу времени. Активность окисления субстрата и коэффициент его использования снижались в той же последовательности. Полученные данные указывают на индивидуальные фенотипические особенности штаммов A. ferrooxidans, вероятно, обусловленные их микроэволюцией в различных экологических нишах.
Штаммы A. ferrooxidans, выделенные из сред технологических установок или природных сред обитания, уже обладают высокой активностью окисления субстрата и устойчивостью к экстремальным факторам среды. Тем не менее, для получения культур бактерии, функционирующих в плотных и сверхплотных пульпах, характеризующихся повышенным содержанием ионов тяжёлых металлов и токсичных элементов, требуется период адаптации. Очевидна необходимость знания адаптационных возможностей различных штаммов A. ferrooxidans с тем, чтобы использовать наиболее активные из них, обладающие высоким регулятор-ным потенциалом. Последующая адаптация к комплексу технологических факторов повышает конкурентоспособность таких штаммов и обеспечивает высокую эффективность в окислении субстрата.
Штаммы TFV-1, TFN-d, TFBk, TFO и TFL-2, длительно культивировавшиеся на среде с закисным железом, были использованы в качестве инокулята при изучении динамики их адаптации к следующим энергетическим субстратам: элементной сере, пириту и золото-мышьяковому концентрату, содержащему смесь сульфидных минералов. Все эти субстраты являются характерными как для сульфидных руд, так и для пульп в технологическом процессе. Однако ключевые фенотипические признаки разных штаммов A.ferrooxidans при оценке скорости и эффективности их адаптации к этим субстратам не изучены, не ясны пределы адаптации.
