Биокаталитическое получение акрилата аммония Полтавская Светлана Викторовна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 11

1.1. Акриловая кислота. Ее свойства и области применения. Способы получения акриловой кислоты 11

1.2. Микробная утилизация нитрилов: механизмы реакций микробной утилизации нитрилов. Характерисика ферментных систем. Промышленные аспекты применения нитрилутилизирующих микроорганизмов 15

1.3. Микробиологическая трансформация акрилонитрила в акрилат аммония: характеристика штаммов, условий культивирования, параметров процесса биотрансформации 26

ГЛАВА 2. Материалы и методы 39

2.1. Исследуемые объекты и штаммы микроорганизмов 39

2.2. Среды 39

2.3. Исследуемые соединения 41

2.4. Методы выделения микроорганизмов, способных трансформировать акрилонитрил в акрилат аммония 42

2.5. Идентификация культур 44

2.6. Определение концентрации микробных клеток 44

2.7. Изучение нитрилазной активности выделенных штаммов микроорганизмов 45

2.7.1. Определение нитрилазной активности интактных клеток штаммов-продуцентов нитрилазы 45

2.7.2. Изучение возможности использования нитрилов для роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 46

2.7.3. Изучение индуцирующей способности нитрилов 46

2.7.4. Исследование влияния состава питательной среды на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 47

2.8. Исследование условий культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 47

2.8.1. Изучение физиологических параметров роста штамма Alcaligenes denitrificans С-32 47

2.8.2. Изучение процесса роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в ферментере с периодическим режимом культивирования 48

2.9. Изучение процесса трансформации акрилонитрила в акрилат аммония с использованием штамма Alcaligenes denitrificans С-32 49

2.9.1. Оптимизация условий реакции гидролиза акрилонитрила 49

2.9.2. Исследование основных технологических параметров процесса получения акрилата аммония с использованием штамма Alcaligenes denitrificans С-32 50

ГЛАВА 3. Выделение микроорганизмов, трансформирующих акрилонитрил в акрилат аммония 51

ГЛАВА 4. Оценка нитрилазной активности штаммов. Биологическая характеристика штамма С-32 56

ГЛАВА 5. Оптимизация состава среды культивирования штамма alcaligenes denitrificans с-32 - продуцента фермента нитрилазы 61

5.1. Изучение параметров роста клеток штамма AIcaligenes denitrificans С-32 на питательной среде, содержащей перевар Хоттингера 61

5.2. Изучение параметров роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 на среде, содержащей ацетонитрил в качестве единственного источника углерода, азота и энергии 64

5.3. Влияние различных питательных основ на параметры роста культуры Alcaligenes denitrificans С-32 67

5.4. Влияние концентрации ацетата аммония на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 69

5.5. Влияние неорганических солей на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 74

5.6. Влияние нитрилов на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 75

5.7. Изучение влияния температуры и кислотности среды на скорость роста и нитрилазную активность штамма Alcaligenes denitrificans С-32 77

5.8. Исследование роста коллекционных штаммов, обладающих нитрилазной активностью, на среде, содержащей ацетат аммония 80

ГЛАВА 6. Оптимизация процесса культивирования клеток штамма alcaligenes denitrificans С-32 в реакторах с периодическим режимом выращивания ..83

ГЛАВА 7. Разработка биотехнологїіческого способа получения акрилата аммония с использованием штамма alcaligenes denitrificans С-32 - продуцента фермента нитрилазы 90

7.1. Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония клетками штамма Alcaligenes denitrificans С-32 90

7.2. Разработка процесса получения акрилата аммония 98

Заключение 106

Выводы 117

Список использованных источников 119

Приложения 131

• Акриловая кислота. Ее свойства и области применения. Способы получения акриловой кислоты
• Методы выделения микроорганизмов, способных трансформировать акрилонитрил в акрилат аммония
• Изучение параметров роста клеток штамма AIcaligenes denitrificans С-32 на питательной среде, содержащей перевар Хоттингера
• Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония клетками штамма Alcaligenes denitrificans С-32

Введение к работе

Методы промышленного получения органических соединений с использованием микроорганизмов условно можно разделить на две группы: биосинтетические и биокаталитические [69]. Методы биосинтеза представляют собой образование новых веществ, осуществляемое клетками в процессе роста на основе питательных компонентов среды. В результате синтезируются природные соединения, в низкой концентрации и трудно выделяемые. Сегодня в промышленном масштабе этим методом получают многие аминокислоты, некоторые антибиотики, лимонную, глюконовую, молочную, уксусную и другие кислоты.

Методы биокатализа предполагают использование клеток
микроорганизмов как источник ферментов, катализирующих специфические
реакции трансформации субстрата, и предполагает проводить получение
веществ in vitro. Общей чертой всех трансформаций является изменение
молекулярной структуры трансформируемого вещества, а не синтез новой
молекулы. С помощью данного подхода производят амиды (например,
акриламид, метакриламид, никотинамид), органические кислоты (например,
аспарагиновую и итаконовую), пептиды, витамины, коферменты;
осуществляют трансформацию стероидов, алкалоидов, Сахаров и липидов,
модифицируют природные антибиотики. Микробиологическая

трансформация позволяет получать чистые вещества в мягких условиях, с высоким выходом, на основе неприродных субстратов.

Производство химических веществ биокаталитическими методами имеет целый ряд преимуществ: специфичность, работа при невысоких температурах, простота конструктивного оформления процесса, поэтому они начинают составлять серьезную конкуренцию традиционным химическим синтезам [15].

В последние десятилетия появились сообщения о возможностях использования бактерий, способных трансформировать алифатические и ароматические нитрилы органических кислот в практически важные продукты - амиды и кислоты [45]. Синтез акриламида с использованием микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной активностью, реализован в Японии и России в промышленных масштабах [15, 52, 75]. Биотехнология получения акриловой кислоты находилась на лабораторном уровне.

Сополимеры акриламида, акриловой кислоты или ее солей широко используются как флокулянты, суперабсорбенты и диспергаторы. Полимеры акриловой кислоты находят применение в экологосберегающих технологиях: укрепления поверхности горных отвалов, предотвращения выветривания, пылеобразования и водной эрозии почв, обезвоживания активного ила очистных сооружений. Акриловая кислота и ее производные необходимы в производстве лаков, красок, стройматериалов, товаров бытовой химии [3].

Примерно 55% производимой в мире акриловой кислоты используется для выработки акриловых эфиров. В последние годы мировые мощности по производству акриловой кислоты увеличивались в среднем на 400 тыс. т в год и к концу 2004 г., по оценке компании Technon Orbi-Chem, они достигли 3.4 млн. т в год. По прогнозу ведущих производителей спрос на акриловую кислоту в ближайшие годы будет увеличиваться на 3.5 - 5 % в год и к 2009 г. мировые потребности составят 4 млн. т.

В России потребление продуктов на основе акриловой кислоты и ее производных в последние годы стремительно растет. Единственный завод по химическому производству акриловых мономеров начал работу в четвертом квартале 2004 года в г. Дзержинске Нижегородской области. Технология получения акриловой кислоты основана на использовании пропилена, продукта глубокой переработки нефти, с последующим его окислением. Проектная мощность завода составила 25 тыс. тонн сырой акриловой кислоты (эфирного сорта) в год, из которых будет производиться около 2.5

тыс. тонн ледяной акриловой кислоты (полимерного сорта) и до 40 тыс. тонн эфиров. Но даже пуск этого химического производства не решает в полном объеме проблему получения акриловой кислоты полимерного сорта, необходимой в производстве высокомолекулярных полимеров. Именно они используются в нефтедобывающей отрасли, при производстве товаров бытового назначения (суперабсорбенты), в калийной промышленности.

Возрастающая потребность в акриловых полимерах и существенные энергетические, экономические и экологические проблемы, связанные с химическим синтезом акриловой кислоты, делают весьма актуальной задачу разработки биокаталитического способа получения акриловой кислоты, в частности, акрилата аммония на основе использования оригинальных штаммов микроорганизмов, обладающих высокой нитрилазной активностью.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось создание высокоактивного биокатализатора, способного трансформировать акрилонитрил в аммонийную соль акриловой кислоты, и разработка на его основе процесса получения водных растворов акрилата аммония.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи:

1. Создание коллекции микроорганизмов, трансформирующих нитрилы в соответствующие кислоты, селекция штамма с максимальной активностью.

2. Оптимизация условий культивирования штамма, обладающего максимальной активностью фермента нитрилазы.

3. Разработка ферментационного процесса промышленного получения биомассы штамма - продуцента нитрилазы.

4. Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония.

5. Разработка технологии получения водных растворов акрилата аммония с использованием созданного биокатализатора.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Создана коллекция микроорганизмов, отнесенных к родам Pseudomonas и Alcaligenes, способных трансформировать алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие кислоты.

Выделенные штаммы обладают высокой нитрилазной активностью и способны трансформировать нитрилы в широком диапазоне рН и температуры. Штамм Alcaligenes denitrificans С-32, проявляющий максимальную нитрилазную активность, и условия его культивирования защищены патентом РФ № 2177034, приоритет от 03.04.2001.

Разработаны среда и условия культивирования для штамма Alcaligenes denitrificans С-32, не использующего углеводы и многоатомные спирты в качестве ростового субстрата.

Разработан биокаталитический способ получения водных растворов акрилата аммония с использованием биокатализатора на основе штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Разработаны подходы к конструированию сред для культивирования микроорганизмов, проявляющих нитрилазную активность и не использующих углеводы и многоатомные спирты в качестве источника углерода.

Реализованы в промышленном масштабе процессы получения биомассы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 и биокатализатора С-32 на ее основе.

Разработана промышленная технология получения 20 % растворов акрилата аммония полимерного сорта с использованием биокатализатора С-32. С января 2005 г осуществляется плановый выпуск акрилата аммония в объеме нескольких десятков тонн в месяц.

Работа является частью комплексных исследований проводимых в ЗАО "Биоамид", направленных на создание биокаталитического способа получения акрилата аммония.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

6. Создана коллекция микроорганизмов, относящихся к родам Pseudomonas и Alcaligenes, обладающих нитрилазной активностью.

7. Селектированный штамм Alcaligenes denitrificans С-32, обладающий конститутивной нитрилазой, метаболизирует алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие органические кислоты без промежуточного образования амидов.

8. Высокая нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 достигается при росте на оптимизированной среде, не содержащей дорогостоящих компонентов и дополнительных индукторов.

9. Разработаны условия культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в аппаратах с периодическим режимом выращивания, позволяющие получать 9.3 г/л биомассы с удельной нитрилазной активностью до 5.7 ед/г.

10. Разработана и внедрена на ОАО "Биосинтез", г. Пенза, технология промышленного получения биомассы штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

11. Разработана технология получения водных растворов акрилата аммония с использованием созданного биокатализатора. Оптимизированные параметры процесса позволяют получать в лабораторных условиях растворы акрилата аммония концентрацией до 50%.

12. С использованием созданного биокатализатора разработана и внедрена на российско-германском предприятии "MSP", г. Пермь, промышленная технология получения 18 - 20% водных растворов акрилата аммония.

«

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на Российских и Международных семинарах-презентациях, конференциях "Новые направления в биотехнологии", Пущино, 2000, 2001 и 2003 гг.; "Экологизация подготовки специалистов в ВУЗах. Утилизация и переработка отходов", Саратов, 2001 г.; на Первом и Третьем Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2002, 2005 гг.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 1 патент и 2 статьи.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 123 работы отечественных и зарубежных авторов, изложена на 135 страницах машинописного текста, включающего 7 рисунков и 19 таблиц.

и ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Акриловая кислота. Ее свойства и области применения. Способы получения акриловой кислоты

В настоящее время в химической и микробиологической промышленности производится широкий спектр карбоновых кислот, использующихся в различных областях. Непредельные кислоты - большая группа карбоновых кислот, в молекулах которых два атома углерода связаны между собой двойными связями. Эти кислоты и их производные используются как мономеры при полимеризации или сополимеризации для получения широкого спектра полимеров различного назначения [11].

Акриловая кислота (пропеновая, этиленкарбоновая) - непредельная кислота, представляющая собой бесцветную жидкость с резким специфическим запахом, растворима в воде, спирте, хлороформе, бензоле, токсична [17]. При хранении полимеризуется, ингибитор полимеризации -гидрохинон. При УФ облучении или в кислых водных растворах (рН «1) образует полиакриловую кислоту. Соли и эфиры акриловой кислоты называются акрилатами.

Область использования акриловой кислоты и ее производных (солей и эфиров) все более расширяется: акриловая кислота служит сырьем для производства синтетических волокон, ионообменных смол, каучуков, пластмасс [14]. Ее водные растворы с последующей полимеризацией применяются для загущения клеевых систем, для получения звукопоглощающих материалов, как связующее средство в производстве изделий с высокой плотностью из тонкодисперсной технической керамики, для прививок на пленки с целью придания им гидрофильных свойств. Аммонийная соль акриловой кислоты в виде сополимера с этилакрилатом и метилметакрилатом используется в текстильной промышленности для

шлихтования синтетических нитей и пряж; при производстве обоев - в качестве загустителя при их печати; в кожевенной - в качестве загустителя для выделки натуральных кож.

Материалы на основе полимеров и сополимеров акриловой кислоты нашли широкое применение в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства [1]:

в изготовлении резинотехнических изделий, электроизоляционных материалов, герметиков,

в производстве лакокрасочных материалов высокой ударопрочности,

в печатной промышленности, как растворители для типографской краски и отделки печатных плат,

в оптике, как полимерная красящая композиция для волоконооптических датчиков и при изготовлении оптических изделий (видеодисков, призм, линз),

в медицине в качестве гидрофильных мембран, биологически активных полимеров, при изготовлении препаратов для лечения глаукомы, контактных линз, искусственных зубов и зубных протезов,

в экологосберегающих технологиях, при очистке сточных вод и укреплении поверхности горных отвалов, для предотвращения выветривания, пылеобразования и водной эрозии почв.

Анионные полимеры, представляющие собой сополимеры акриламида и акриловой кислоты или ее солей широко используются как флокулянты и суперабсорбенты (средства гигиены, кондиционеры почвы). Высокомолекулярные сополимеры включены в рецептуры буровых растворов при нефте- и газодобыче.

Основным промышленным способом получения акриловой кислоты является окисление пропилена на многокомпонентных катализаторах [3, 16]. Процесс протекает в две основные стадии, при высокой температуре и

требует достаточно сложного аппаратурного обеспечения:

0₂ о₂

СН₂ = СН - СН СН₂ = СН - СОН СНг = СН - СООН

кат.1,180С кат.2,220С

На первой стадии происходит окисление пропилена кислородом воздуха в акролеин в присутствии водяного пара и азота в стационарном слое окисного катализатора при температуре 160-180С. Затем смесь газов поступает в следующий реактор, где происходит окисление акролеина до акриловой кислоты на катализаторе второй стадии при температуре 220С. Реакционные газы из второго реактора поступают в абсорбер, где происходит абсорбция продуктов реакции циркулирующим водным раствором кислот. Помимо акролеина, основными побочными продуктами являются ацетальдегид, уксусная, пропионовая и малеиновая кислоты, диоксид и оксид углерода. Несмотря на то, что продукты окисления проходят несколько стадий разделения и очистки, получаемая акриловая кислота относится к эфирному сорту, и может использоваться только для синтеза различных эфиров, таких как метилакрилат, бутилакрилат. Для получения высокоочищенного продукта полимерного сорта необходима дополнительная стадия ректификации. К недостаткам описанного процесса можно отнести характерные особенности химических синтезов: высокие энергозатраты, необходимость специального оборудования, нескольких стадий очистки и образование побочных продуктов и отходов.

Одним из первых методов получения акриловой кислоты является метод Реппе, основанный на гидрокарбоксилировании ацетилена, но высокая токсичность и сильные коррозионные свойства катализатора - карбонила никеля, ограничивают возможность его широкого использования [9].

Другие химические способы получения акриловой кислоты, такие как жидкофазное окисление акролеина кислородом в ароматическом

растворителе, взаимодействие уксусной кислоты и формальдегида (или его производного), характеризуются низким выходом продукта, дороговизной катализатора, сложностью выделения синтезированной акриловой кислоты.

Кроме химических методов существуют комбинированные способы получения акриловой кислоты. Так в патенте [21] описано получение акриловой кислоты и ее эфиров из молочной кислоты и лактатов. На первом этапе ферментационным методом получают соли молочной кислоты с помощью микроорганизмов рода Lactobacillus, затем концентрируют их и этерифицируют. На последнем этапе, используя химический катализатор и нагрев до 80С, проводят дегидратацию сложных эфиров молочной кислоты с выделением эфиров акриловой кислоты. Для выделения свободной акриловой кислоты может быть введена дополнительная стадия. Этот метод также не лишен недостатков. Прежде всего это низкий выход целевого продукта, приводящий к дополнительным затратам на концентрирование, выделение и очистку от побочных продуктов.

Таким образом, современным способам получения акриловой кислоты присущи особенности, характерные для химических производств. Возможное решение проблемы - это использование биокаталитического способа, так как известно, что биологические каталитические системы превосходят химические по селективности и эффективности. Биотехнологические процессы протекают в мягких условиях (невысокая температура, атмосферное давление, рН среды близкое к нейтральному), обладают малой энергоемкостью, невзрывоопасны и реализуются с использованием достаточно простого оборудования.

1.2. Микробная утилизация нитрилов: механизмы реакций микробной утилизации нитрилов. Характерисика ферментных систем. Промышленные аспекты применения нитрилутилизирующих микроорганизмов

Нитрильные соединения, содержащие в молекуле CN - группу, являются естественными компонентами живых организмов. Органические нитрилы, такие как цианогликозиды, цианолипиды, рицин (N-метил-З-циано-4-метокси-2-пиридон), индолацетонитрил и р-циано-а-аланин синтезируются широким кругом растений. Тойокамицин, треконемицин - антибиотики, в молекулах которых содержится нитрильная группа, синтезируются микроорганизмами рода Streptomyces [24, 68]. Кроме того, в окружающую среду попадают нитрилы, выпускаемые химической промышленностью и используемые в различных областях. Поэтому, вполне естественно, ожидать наличия в окружающей среде микроорганизмов, способных метаболизировать эти соединения.

Наиболее ранние сообщения о метаболизме нитрилов растениями касались возможности гидролиза аминоацетонитрила и Р-цианоаланина их нитрилазными ферментами [51]. Доказательства ферментного гидролиза нитрилов получили Thimann и Mahadevan в 1964 г, которые показали наличие нитрилазы в растениях различных видов [37]. Фермент, превращавший индол-3-ацетонитрил в растительный гормон индол-3-уксусную кислоту, был частично очищен и охарактеризован [41].

В начале 60-х годов XX века появились и первые публикации о наличии микроорганизмов, способных утилизировать нитрилы. Авторы этих исследований показали возможность гидролиза нитрилов грибами и бактериями [24, 87, 102, 112]. Для создания биотехнологии получения акриловой кислоты подобные реакции интересны тем, что в качестве

16 промежуточных продуктов утилизации нитрилов образуются соответствующие амиды и кислоты.

Наиболее полно метаболизм нитрилов изучен у микроорганизмов. В настоящее время все три фермента, участвующие в гидролизе нитрилов, выделены из микроорганизмов и подробно описаны [25, 27, 38, 44, 51, 104].

Согласно литературным данным биологическая деградация нитрилов протекает по двум ферментативным путям [51].

Нитрилаза R-CN —^.,_^^ R-COOH

\ 2Н₂0 NH₃/f у

Нитрил- \ JP Н2О ]УАмидаза

гидратаза S> H₂OJ|p^

R-CONH2 Нитрилаза катализирует прямое превращение нитрилов с образованием соответствующих кислот и аммиака, нитрилгидратаза катализирует гидратацию нитрилов до амидов, которые затем гидролизуются до кислот и аммиака под воздействием амидазы. Таким образом, нитрилаза и нитрилгидратаза относятся к различным группам ферментов.

Схему реакции, катализируемой ферментом нитрилазой, предложили в 1964 году W. Robinson и R. Hook [41, 102] на примере рицининовой нитрилазы, выделенной из микроорганизмов рода Pseudomonas.

Реакция, катализируемая ферментом нитрилгидратазой, была впервые описана A. Mimura в 1969 году [67], а ее механизм был подтвержден в 1979 году переносом С14* меченого атома с нитрила на амид [118].

С точки зрения биотехнологии получения кислот, одностадийный гидролиз нитрилов, катализируемый ферментом нитрилазой, более выгоден. Поэтому в дальнейшем мы подробнее остановимся на характеристике фермента нитрилазы и микроорганизмах, его продуцирующих.

По аналогии с химическим гидролизом нитрилов в карбоновые кислоты, энзиматическая конверсия должна представлять собой гидролитическую реакцию с участием двух молекул воды. Принимая во внимание, что во время реакции образуются как кислота, так и небольшое количество амида, но в то же время кислота и амид не являются субстратами для частично очищенного фермента, W. Robinson и R. Hook предложили возможный механизм для энзиматического гидролиза нитрилов [41,102].

Нуклеофильная атака ферментом нитрила приводит к получению фермент-имино эфира (ЕХН, в котором X может быть эфирным атомом кислорода или серы), который затем гидратируется с образованием тетрагидрол интермедиата I (Уравнение 1). В присутствии основных (В) или кислотных (НА) групп фермента аммиак может освобождаться из интермедиата I с образованием ацил-энзима (Уравнение II). Гидролиз ацил-энзима приводит к выделению кислоты и фермента. Но промежуточный комплекс I может распадаться и по другому пути (Уравнение III). В этом случае фермент является более легко уходящей группой, чем аммиак, поэтому продуктами реакции будут фермент и амид.

NH Н₂0 ОН Н
R-C = N + EXH^>R- «~» R-C-N (I)

ХЕ ХЕ Н

Rjfc - N NH₃ + A* + BH + R-C ^/

і ч±&- \ \

ХЕ НАН ^ХХЕ

Или (И)

^{//Р н2о Єя J>}

R-C₄ R-C-OH -» EXH + A* + BH + R-C₄

\ і \

XE AH~XE OH

OH ЛІ JOH JO

R-C - N -* EXH + A" + BH + R-C ->R-C (III)

AH~XE H NH NH₂

K. Thimann и S. Mahadevan [64, ПО], а также, D. Harper [38], исследуя различные нитрилазы, подтвердили этот механизм ферментативной реакции, уточнив, что нуклеофильная атака на нитрильный атом углерода осуществляется благодаря тиольной группе в активном центре фермента (ЕХН, фермент-иминотиольный эфир, в котором X эфирный атом серы)

Предложенный механизм хорошо согласуется как с экспериментальными данными, так и с известным химическим механизмом гидролиза. Намного позднее, в 1990 году, ковалентный энзим-субстратный интермедиат в реакции гидролиза с очищенной нитрилазой из Rhodococcus АТСС 39484 был зафиксирован с использованием метода ионизирующей масс-спектроскопии [105,106].

Первоначально рицининовую нитрилазу выделили и очистили из штамма бактерий рода Pseudomonas, который был изолирован из почвы методом накопительной культуры с рицином в качестве единственного источника углерода [41, 102]. Основным продуктом ферментативного гидролиза рицина являлся М-метил-3-карбокси-4-метокси-2-пиримидон, но около 9% субстрата превращалось в амид. Помимо рицина фермент был способен гидролизовать большое число его аналогов.

Позже Harper выделил из почвы три микроорганизма, образующих нитрилазу. Клетки Nocardia sp. NCIB 11216 [37] и Fusarium solani [38] катаболизировали ароматические нитрилы, такие как бензонитрил. Несмотря на то, что клетки штамма Nocardia sp. NCIB 11215 [40] могли расти, используя р-гидроксибензонитрил, как единственный источник углерода и азота, они не усваивали бензонитрил. В то же время очищенная нитрилаза этого штамма могла трансформировать оба этих нитрила как субстраты. Эти три нитрилазы конвертировали бензонитрил в бензойную кислоту без образования бензамида как интермедиата.

Из штамма Arthrobacter sp. Л были выделены и охарактеризованы два вида нитрилаз, которые гидролизовали ароматические нитрилы, такие как бензонитрил и р-толуолонитрил без образования амида, но не алифатические нитрилы [26].

Однако вышеописанные нитрилазы были очень неустойчивы и получены в небольших количествах. Для характеристики фермента были исследованы лишь частично очищенные нитрилазы из Pseudomonas, Nocardia sp. NCIB 11216 и F. solani [35, 37, 38,41].

Позднее нитрилазу, специфичную для гербицида бромоксинитрила (3,5-дибромо-4-гидроксибензонитрила), выделили из штамма Е. coli, трансформированного плазмидной ДНК из Klebsiella ozaenae [104]. Это сообщение можно считать первым, касающимся клонирования нитрилазного гена.

Впервые фермент нитрилаза в большом количестве выделили из клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Л, изолированного из почвы посевом на среду с ацетонитрилом в качестве единственного источника углерода [49]. Количество данного фермента в клетках, выросших на среде с изовалеронитрилом и глицерином, могло достигать 35 % от общего растворимого белка. Позже было показано, что є-капролактам также является превосходным индуктором для образования нитрилазы [78].

Очищенный фермент воздействует строго на ароматические и гетероциклические нитрилы. Однако при добавлении глицерина или сульфата аммония в реакционную смесь, очищенная нитрилаза, субъединицы которой ассоциируются из дим еров в додекамеры (12-меры), может воздействовать на алифатические нитрилы, такие как акрилонитрил [81].

Ранее было показано, что нитрилы, в которых цианогруппа сопряжена с двойной связью, в том числе ароматические и гетероциклические нитрилы, могут трансформироваться нитрилазой. В то же время алифатические нитрилы гидролизуются в две стадии, сначала до соответствующих амидов, а затем - кислоты и аммиака, под воздействием нитрилгидратазы и амидазы, соответственно [73-75]. Все известные нитрилазы, которые воздействуют на ароматические нитрилы как субстраты, получили название бензонитрилаз, не способны к избирательной деградации алифатических нитрилов [51].

В последние годы появились сообщения о наличии нового типа нитрилаз, способных действовать на алифатические нитрилы. Так, из клеток штамма Rhodococcus rhodochrous К 22 была выделена нитрилаза, лучшими субстратами для которой являлись кротононитрил и акрилонитрил [53]. Для изоляции новой нитрилазы как алифатический нитрил-субстрат был использован кротононитрил. Как и нитрилаза из R. rhodochrous Л, нитрилаза из R. rhodochrous К22 индуцировалась при добавлении в среду изовалеронитрила. В этом случае образовавшаяся нитрилаза составляла 24 % от общего растворимого белка в клетках [54]. Она проявляла широкую субстратную специфичность по отношению к ненасыщенным алифатическим нитрилам, таким как кротононитрил и акрилонитрил, и в равной степени взаимодействовала с насыщенными алифатическими нитрилами, такими как ацетонитрил и глутаронитрил.

Новый тип нитрилаз [70], выделенный в отдельную группу, был обнаружен в клетках штамма Alcaligenes faecalis JM3, выращиваемых на среде, содержащей изовалеронитрил, стимулирующий сверхпродукцию

нитрилаз в родококках. Очищенная нитрилаза не воздействует на ароматические или алифатические нитрилы, например, ацетонитрил и акрилонитрил, но воздействует на арилацетонитрилы, такие как индол-3-ацетонитрил, фенилацетонитрил (бензилцианид) и тиофенацетонитрил, которые получаются замещением ароматического кольца индолильными, фенильными или тиофеновыми группами, соответственно. Принимая во внимание сведения о том, что данные соединения также являются природными предшественниками ауксина (ростового гормона), арилацетонитрилазы, как микробная, так и растительная, могут быть важны с эволюционной точки зрения, как ферменты, синтезирующие индолацетоуксусную кислоту.

Нитрилаза из Alcaligenes faecalis АТСС 8750, отвечающая за энантиселективный гидролиз манделонитрила была очищена и охарактеризована [123]. Этот фермент катализировал гидролиз бензилцианида и его р-заместителей, но реагировал с ароматическими нитрилами с трудом; нитрилаза была отнесена к арилацетонитрилазам.

Все выделенные из бактериальных штаммов нитрилазы, условно разделенные на три основных категории по их субстратной специфичности: ароматические, алифатические и арилацетонитрилазы, состояли из различного числа идентичных субъединиц и не содержали металла в активном центре [51].

Так, из клеток штамма Fusarium solani был выделен фермент, лучшим субстратом для которого являлся бензонитрил. Молекулярная масса белка составила 620 кДа, он состоял из 8 идентичных субъединиц с молекулярной массой 76 кДа [38].

Нитрилаза, выделенная из клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Л, выращиваемых на среде с изовалеронитрилом и глицерином, имела молекулярную массу 76 кДа и состояла из двух одинаковых субъединиц [49].

Алифатическая нитрилаза, выделенная и очищенная из

изовалеронитрил-индуцированных клеток Rhodococcus rhodochrous К22, с молекулярной массой 650 кДа состояла приблизительно из 15 или 16 идентичных субъединиц с молекулярной массой 41 кДа [53].

Арилацетонитрилаза из клеток штамма Alcaligenes faecalis JM3, выросших на среде содержащей изовалеронитрил в качестве индуктора, состояла из 6 идентичных по молекулярной массе субъединиц (44 кДа). Молекулярная масса активного конгломерата составляла около 260 кДа [70].

В последние годы появились первые сообщения об относительно термостабильных нитрилазах из термофильных микроорганизмов [19, 33]. Так, нитрилаза из клеток штамма Bacillus pall idus Dac521, выращиваемых на бензонитрил-содержащей минимальной среде, состояла из идентичных субъединиц с молекулярной массой 41 кДа. Но фермент был выделен в комплексе с GroEL белком с общей молекулярной массой 600 кДа. Очищенный нитрилаза - GroEL комплекс терял половину своей активности за 8.4 часа при 50С, за 2.5 часа при 60С, за 13 мин при 70С и менее чем через 3 мин при 80С. Нитрилаза катализировала гидролиз алифатических, ароматических и гетероциклических нитрилов, хотя 4-цианопиридин гидролизовался с наибольшей скоростью.

Анализ спектра поглощения и анализ металлов с использованием индуктивно-сопряженного радиочастотного плазменного спектрофотометра, свидетельствуют в первую очередь о том, что фермент нитрилаза не содержит простетическую группу или металл, в то время как нитрилгидратаза содержит металлы, такие как железо или кобальт [31, 73-76, 107], или пирролохинолин хинон-подобный комплекс [79,108].

При исследовании выделенных и очищенных нитрилаз, принадлежащих к различным группам по субстратной специфичности, оказалось, что ингибирующее влияние на активность фермента оказывали специфические тиольные реагенты, такие как р-гидроксимеркуробензоат, N-этилмалеимид. Они сильно снижали скорость трансформации. Тяжелые

металлы, добавленные в реакционную среду, полностью лишали фермент каталитической активности. Это говорит о том, что в активном центре фермента большую роль играют тиоловые группы [26, 105]. Позднее, было показано, что важную роль в функционировании активного центра нитрилазы играет цистеин [50, 51]. В настоящее время фермент нитрилаза объеденен в большую группу тиоловых ферментов - "надсемейство нитрилаз", участвующих в биосинтезе природных продуктов, таких как ауксин, биотин, Р - аланин и др., и их последующей модификации. Тиоловые ферменты подразделены на 13 родственных групп, 9 из которых известны благодаря специфичному нитрильному или амидному гидролизу или амид-конденсирующим реакциям [82].

В литературе описаны микроорганизмы, способные к прямому гидролизу нитрилов в соли соответствующих кислот без образования амида в качестве интермедиата. Хотя фермент нитрилаза из них не был выделен и очищен, существует уверенность в том, что эти бактерии обладают нитрилазной активностью. Таким, например, является штамм Alcaligenes sp. ВКПМ В-6706, выделенный и описанный в нашей лаборатории [13].

Микроорганизмы, обладающие нитрилазной активностью, позволяют получать продукты, имеющие важное практическое значение [109].

Так, Rhodococcus rhodochrous Л и Nocardia rhodochrous LL100-21, проявляющие метаболическую многосторонность при индукции изовалеронитрилом, продуцировали бензонитрилазу, которая катализировала прямой гидролиз 3-цианопиридина в никотиновую кислоту без образования никотинамида [65, 77]. За 26 часов в реакционной смеси, содержащей 2.89 г клеток Rhodococcus rhodochrous Л, накапливалось 172 г никотиновой кислоты. Подобным образом были получены n-аминобензойная кислота в концентрации 110 г/л [55] и пиразиновая кислота (434 г/л) [56] со 100% конверсией субстрата. Более того, фермент проявлял регио-специфичность при гидролизе динитрилов, трансформируя изофталонитрил и

терефталонитрил в 3- и 4-цианобензойные кислоты с конверсией более 99% [29, 57].

Нитрилаза из штамма R. rhodochrous К22 также способна к гидролизу только одной цианогруппы динитрила - глутаронитрила, в карбоксильную группу [58]. Подобная избирательность была показана в реакциях нитрилазы R. rhodochrous NCIB 11216 с динитрильными субстратами 1,3-дицианобензином [28] и фумаронитрилом [29, 42].

Открытие гиперпродукции фермента нитрилазы в штаммах R. rhodochrous Л и К22 и возможности с его помощью синтезировать в больших количествах различные кислоты, привело к другим исследованиям на основе нитрилаз Rhodococcus. Например: гидролиз рацемата а-аминонитрилов в оптически активные аминокислоты, такие как L-лейцин, осуществленный с помощью нитрилазы из клеток штамма R. rhodochrous РА-34 [30], и стереоспецифичный гидролиз рацемата нитрилов, такого как а-арилпропионитрил, при использовании нитрилазы из R. rhodochrous АТСС 21197 [96].

Хиральные интермедиаты для фармацевтической промышленности, такие как Я-(-)-манделовая кислота и 8-(+)-ибупрофен-(8-(+)-2-(4'-изобутилфенил)-пропионовая кислота), получаются из соответствующих рацематов нитрилов под воздействием нитрилаз из штаммов A. faecalis АТСС 8750 [122] nAcinetobactersp. АК226 [120,121], соответственно.

Использование гербицидов для уничтожения сорняков, приводящее к уменьшению потерь урожая, является одним из важных направлений в современном земледелии. Весьма популярен широко используемый гербицид, бромоксинил (3,5-дибромо-4-гидроксибензонитрил), который ингибирует фотосинтез в растениях. Получена и охарактеризована на генетическом уровне нитрилаза из клеток штамма Klebsiella ozaenae [103]. Фермент активен по отношению к этим гербицидам. Нитрилаза,

классифицированая как ароматическая нитрилаза, инактивирует гербицид, гидролизуя его цианогруппу в карбоновую кислоту [104]. Толерантность к бромоксинилу может быть достигнута введением нитрилазного гена из клеток К. ozaenae в растения. Уже получены трансгенные культуры растений с внедренным бактериальным нитрилазным геном. Испытания подобных растений проводятся в полевых условиях [51].

Для получения некоторых алифатических кислот, представляющих промышленный интерес, могут быть использованы штаммы с комбинацией двух ферментов нитрилгидратазы и амидазы. Подобный двухстадийный процесс был использован A. Arnaud с соавторами [85] для ферментативной трансформации лактонитрила в DL-лактат аммония через лактамид.

Для получения акриловой кислоты путем гидролиза акриламида с использованием амидазы Brevibacterium sp. R312 был создан проточный реактор с иммобилизованными клетками. Позднее обнаружено, что штамм Arthrobacter sp. 19 продуцирует нитрилазу, катализирующую прямой гидролиз акрилонитрила в акриловую кислоту [87].

В последнее время стали появляться сообщения о возможности получения промышленно важных акриловой и метакриловой кислот с использованием прямого гидролиза (мет)акрилонитрила в (мет)акриловую кислоту под воздействием микроорганизмов, обладающих нитрилазной активностью [83, 89, 90].

Так, например, используя клетки штамма Rhodococcus rhodochrous Л, индуцированные є-капролактамом, за 24 часа реакции при периодическом внесении акрилонитрила или метакрилонитрила можно получить 390 г/л акриловой кислоты или 260 г/л метакриловой кислоты [71].

В последние годы появились сообщения о штаммах Rhodococcus rhodochrous NCIMB 4057 и NCIMB 40833, заявленных фирмой "США", используя ферментную систему которых, возможно получение 48-50% (5.68 М) растворов акрилата аммония [83, 91].

1.3. Микробиологическая трансформация акрилонитрила в акрилат аммония: характеристика штаммов, условий культивирования, параметров процесса биотрансформации

Исходя из цели исследования, ниже более подробно описаны бактерии, способные к гидролизу акрилонитрила до аммонийной соли акриловой кислоты.

Как показано выше, к трансформации акрилонитрила в акрилат
аммония способны лишь некоторые штаммы, продуцирующие

бензонитрилазы или алифатические нитрилазы. Штаммы, обладающие арилацетонитрилазной активностью, к гидролизу акрилонитрила не способны [51].

Большинство известных штаммов - продуцентов нитрилазы было выделено методом накопительной культуры из образцов почвы. В качестве селектирующих агентов были использованы нитрилы, являющиеся субстратами для ферментной системы изолированных штаммов.

Так, например, штамм Rhodococcus rhodochrous Л был изолирован из образцов почвы как утилизирующий ацетонитрил [49, 78].

Штамм бактерий Alcaligenes sp. ВКГГМ В-6706, описанный Забазной
Е.В. с соавторами, был выделен из почвы производства акрилонитрила
методом накопительной культуры [6]. В качестве селектирующего агента
использовался ацетонитрил. Клетки штамма проявляли широкую
субстратную специфичность к алифатическим нитрилам, таким как
пропионитрил, ацетонитрил, бутиронитрил, изобутиронитрил,

изовалеронитрил. Наибольшую активность клетки штамма проявляли по отношению к акрилонитрилу.

Для изоляции штамма Rhodococcus rhodochrous К22, продуцирующего алифатическую нитрилазу, японскими исследователями был целенаправленно использован кротононитрил. Выделение проводилось

методами накопительной культуры и прямого высева на агаризованную среду [53].

Для изоляции штаммов Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и NCIMB 40833 использовали инокулированную экстрактом из почвенных образцов минимальную среду, содержащую в качестве единственного источника углерода и азота ацетонитрил в концентрации 0.2% или акрилонитрил в концентрации 0.05%. После 7-дневного культивирования образцы культур высевались на агаризованную минимальную среду, содержащую акрилонитрил в концентрации 0.25% в качестве единственного источника углерода и азота [115]. Позднее штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 был переклассифицирован в Rhodococcus ruber.

Методы выделения и селектирующий агент для изоляции штамма Alcaligenes sp. AK866N, способного к прямой трансформации акрилонитрила в акрилат аммония, в литературе не описаны. В патенте, где приведены характеристики этого штамма, лишь подчеркивается, что важными критериями отбора штаммов должны являться высокая нитрилазная активность клеток и их устойчивость к высоким концентрациям накапливаемого продукта [88].

Изучение условий роста микроорганизмов - продуцентов фермента нитрилазы и влияние различных факторов на этот процесс представляется важной задачей при создании соответствующей технологии.

В связи с тем, что большинство описанных штаммов начинают продуцировать заметные количества фермента нитрилазы только после внесения в среду индуктора, чаще всего - нитрила, важным моментом в подборе условий культивирования подобных микроорганизмов, является правильный выбор индуктора и поддержание его в нужной концентрации. Так, для культивирования клеток штамма Alcaligenes sp. AK866N в качестве индуктора и источника углерода могли использоваться ацетонитрил, пропионитрил или изобутиронитрил в начальной концентрации 10 г/л. В

результате 1-3 суточного роста, нитрилазная активность клеток штамма по отношению к арилонитрилу достигала 506 ммоль/г-мин. (Измерение проводилось при 30С). Зависимость активности от внесенного в среду нитрила авторы не приводят [88].

Для индукции нитрилазы, продуцируемой клетками штаммов Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и NCIMB 40833, использовали ацетонитрил в концентрации 2 г/л. Инкубирование клеток в присутствии этого нитрила в течение 24 часов приводит к проявлению ими специфической активности по отношению к акрилонитрилу 1060 мкмоль/г-мин [83].

Более подробно индукция алифатической нитрилазы под действием различных нитрилов описана для клеток штамма Rhodococcus rhodochrous К22 [22, 53, 54, 72]. Клетки, выращенные в отсутствие нитрилов, амидов или кислот, не проявляли заметной ферментативной активности, что указывает на индуцибельность нитрилазы. Алифатические нитрилы, такие как пропионитрил, изокапронитрил, метакрилонитрил и 3,3 -оксидипропионитрил, являлись индукторами. Ароматические нитрилы, например бензонитрил, не только не приводили к заметному увеличению активности фермента, но и сильно ингибировали рост клеток. Максимальным индуцирующим эффектом обладал изовалеронитрил. Внесение его в среду культивирования увеличивало активность нитрилазы в десятки раз. Концентрация нитрила в среде культивирования во время ферментации уменьшалась, так как под действием нитрилазы клеток Rhodococcus rhodochrous К22 изовалеронитрил постепенно превращался в изовалериановую кислоту. Активность очищенного фермента по отношению к изовалеронитрилу составляла всего 2 % от активности в отношении кротононитрила. Низкая скорость трансформации изовалеронитрила в культуральном бульоне под действием нитрилазы способствует проявлению его индуцирующего эффекта.

Тем не менее, изовалеронитрил является субстратом для алифатической нитрилазы, и во время роста культуры его концентрация в среде падала, что приводило к снижению индуцирующего эффекта. Более высокая концентрация нитрила, создаваемая в среде, ингибировала рост. Для сохранения наибольшей скорости роста культуры и поддержания ее высокой нитрилазной активности, нитрил вносили дробно в течение всей ферментации.

В более поздних исследованиях [78] было показано, что хорошим индуктором для нитрилазных штаммов, в том числе и Rhodococcus rhodochrous К22, является є- капролактам, концентрация которого в среде за все время роста практически не падает.

Интересно, что в зависимости от индуктора в клетках одного и того же штамма Rhodococcus rhodochrous Л могут индуцироваться два различных фермента, отвечающих за гидролиз нитрила: нитрилаза или нитрилгидратаза. Так, при выращивании культуры в присутствии ионов кобальта и кротонамида индуцировалось образование двух форм нитрилгидратаз. Наличие в среде культивирования мочевины приводило к синтезу Н-форм, действующих преимущественно на алифатические нитрилы. В присутствии циклогексанкарбоксамида преобладал синтез L-форм нитрилгидратазы, лучшими субстратами для которой являлись ароматические нитрилы [59].

Когда же питательная среда для культивирования содержала изовалеронитрил в качестве индуктора, в клетках продуцировался в больших количествах только фермент нитрилаза. Среди нитрилов изовалеронитрил является самым мощным индуктором синтеза нитрилазы. Общая нитрилазная активность культуры, выращенной в его присутствии, была приблизительно в 3160 раз выше полученной при росте в аналогичных условиях с добавлением в среду бензонитрила [54].

При дальнейшем изучении образования нитрилазы микроорганизмом Rhodococcus rhodochrous Л Тоги Nagasawa с соавторами показали, что при

добавлении в питательную среду є - капролактама количество этого фермента в клетках значительно увеличивается. Было показано, что наибольшая специфическая активность проявлялась при концентрации є -капролактама 0.75%, максимальная общая активность культуры наблюдалась при концентрациях 0.3-0.5%. Это снижение связано с ингибированием роста при повышении концентрации индуктора в среде [78].

є - Капролактам как индуктор фермента нитрилазы превосходит изовалеронитрил по выраженности индуцирующего эффекта. Другим важным преимуществом этого индуктора является то, что его уровень в ферментационной среде снижается незначительно, то есть нет необходимости последующего дополнительного внесения.

На наличие индуцирующего эффекта исследовались различные лактамы и родственные соединения. Было показано, что у - бутиролактам и 5 - валеролактам проявляют высокую индукционную способность для образования нитрилазы, тогда как 6 - амино - п - капроновая кислота, которая представляет собой продукт гидратации є - капролактама, и N - метил -є - капролактам не индуцируют образование нитрилазы.

Внесение в среду культивирования индуктора приводит к усложнению выращивания клеток любого штамма-трансформатора. В случае летучих и токсичных нитрилов - это постоянный контроль их концентрации в культуральной и окружающей средах, в случае є - капролактама -необходимость его удаления из готового биокатализатора перед реакцией трансформации.

В нашей лаборатории [13] был селектирован штамм Alcaligenes sp. ВКПМ В-6706 с конститутивным синтезом фермента нитрилазы. Хотя в чистом виде фермент не выделялся, клетки штамма проявляли высокую нитрилазную активность при росте на средах, в составе которых отсутствовали специфические индукторы синтеза нитрилазы. Добавление в среду культивирования наиболее сильных (согласно литературным данным)

индукторов, таких как изовалеронитрил и є - капролактам, также не приводило к увеличению нитрилазной активности клеток этого штамма. Таким образом, штамм Alcaligenes sp. ВКПМ В-6706 является единственным из представленных в литературе, обладающим конститутивной нитрилазой.

В ходе роста микроорганизмы нуждаются во внешних источниках энергии и доступных веществах, поставляющих углерод и азот в такой форме, в которой они могут быть использованы для синтеза клеточных компонентов. Подбор питательных веществ для каждого штамма индивидуален. Кроме того, у микроорганизмов, применяемых в промышленности в качестве катализаторов, необходимо учитывать и влияние источников питания на продукцию целевого фермента. С одной стороны, их сбалансированное присутствие в среде позволяет достигнуть максимального выхода биомассы, с другой - включаются механизмы азотной и углеродной репрессии синтеза ферментов [2].

К сожалению, подробных сообщений о составе сред для культивирования бактерий, способных к прямому гидролизу акрилонитрила в акрилат аммония, мало. В основном исследования большинства авторов касаются влияния индуктора на образование фермента нитрилазы.

Так, описывая штаммы Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и NCIMB 40833, Armitage с соавторами приводят состав среды культивирования, не останавливаясь на ее оптимизации. Это солевая среда, в состав которой в качестве источников углерода и азота входят ацетат натрия и ацетонитрил (по-видимому, выступающий еще и индуктором). Урожай клеток не представлен [83, 115].

Для культивирования клеток штамма Alcaligenes sp. AK866N авторами предложена среда, содержащая в соответствующих пропорциях источники углерода (они же индукторы): ацетонитрил, пропионитрил или изобутиронитрил и источники азота - неорганические соли аммония: сульфат

или хлорид. Органические питательные вещества в составе среды представлены дрожжевым экстрактом и пептоном [88].

Несмотря на то, что клетки штамма Alcaligenes sp. ВКПМ В-6706 не требуют внесения в состав среды культивирования токсичных индукторов, для проявления высокой нитрилазной активности необходим этанол, как источник углерода, и казаминовые кислоты в качестве источника азота. При росте клеток штамма на оптимизированной среде в течение 24 часов их специфическая нитрилазная активность по отношению к акрилонитрилу достигала 180.9 ммоль/г-ч (30С) [13].

Штамм Rhodococcus rhodochrous К22 мог расти на солевой среде, содержащей кротононитрил в 0.1% концентрации, как единственный источник углерода и азота. Однако на протяжении 112 ч культивирования скорость роста и алифатическая нитрилазная активность оставались низкими [54].

Авторами было изучено влияние различных источников углерода на урожай клеток и активность фермента. Их добавляли к основной среде, содержавшей 0.1% изовалеронитрила, до концентрации 1%. Клетки выращивали в течение 108 ч с двукратной подачей изовалеронитрила. Было обнаружено, что добавки маннита и глутамата натрия увеличивали специфическую ферментативную активность, однако в наибольшей степени росту активности способствовал сорбит. При введении глюкозы в среду культивирования нитрилазная активность уменьшалась пропорционально начальной концентрации глюкозы. По-видимому, ее присутствие в культуральной среде вызывает катаболитную репрессию фермента.

В результате оптимальная среда содержала 0.7% мочевины и 0.1% изовалеронитрила; дополнительно после 76 и 100 ч роста подавали изовалеронитрил, создавая концентрацию 0.2%. После 120 ч инкубации общая и удельная активность достигли максимальных значений - 1.70 ед/мг сухой массы клеток (активность измерялась по отношению к

кротононитрилу), что превышало активность, достигнутую при росте на среде, содержащей только кротононитрил, в сотни раз.

Torn Nagasawa и другие оптимизировали основную среду для выращивания клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Л, содержащую є -капролактам в качестве индуктора, и показали, что глюкоза и глутамат натрия являются удобными источниками углерода и азота, соответственно. Максимальный урожай клеток на данной среде составил ~ 5 мг сухих клеток/мл, общая активность нитрилазы культуры по отношению к акрилонитрилу - 17.8 ед/мл на 120 ч культивирования [72].

Таким образом, выделение микроорганизмов, способных к прямому гидролизу акрилонитрила в акрилат аммония, оптимизация условий их культивирования, создали предпосылки для разработки биотехнологии получения акрилата аммония.

В литературе описаны два подхода к осуществлению микробиологического получения кислот: в периодическом режиме с использованием интактных клеток и в непрерывном процессе на основе иммобилизованных бактерий, либо частично или высокоочищенного фермента [32, 43] . В любом случае при разработке технологии необходимо изучение условий и параметров процесса биотрансформации исходного соединения. Как правило, оба подхода предполагают проводить процесс в водной среде, с минимальным количеством солей или без них в зависимости от вида микроорганизма. Выбор среды преследует своей целью с одной стороны получение высокочистого продукта, с другой - длительную работу биокатализатора с максимальной активностью.

В работах, посвященных получению аммонийной соли акриловой кислоты с помощью клеток микроорганизмов, трансформация акрилонитрила представлена, как периодический процесс [6, 88, 71,113].

В термостатируемый реактор с мешалкой, содержащий суспензию целых или частично разрушенных клеток в дистиллированной воде или

фосфатном буферном растворе подается акрилонитрил. Внесение нитрила акриловой кислоты в реакционную смесь может осуществляться различными способами: все количество в начале реакции трансформации или на протяжении всей реакции, поддерживая его концентрацию на определенном уровне. Температура, рН реакционной среды и концентрация целевого акрилата аммония различны и зависят от вида микроорганизма и характеристик нитрилазы. Удаление бактерий из полученного водного раствора акрилата аммония осуществляли центрифугированием.

По литературным данным, оптимальное значение рН для проявления активности нитрилазами, выделенными из различных микроорганизмов, находится либо в нейтральной, либо в слабощелочной области. Температурный диапазон реакции широк и, хотя, максимальные активности многих нитрилаз проявляются при 45С и выше, получение акриловой кислоты проводили при более низких температурах.

Так, клетки штамма Alcaligenes sp. AK866N, способны к гидролизу акрилонитрила в акрилат аммония в интервале значений рН 6 -10, с оптимумом рН 7-9. Температурный диапазон проявления нитрилазной активности составлял 0 - 30С, максимальная нитрилазная активность достигалась при 30С [88].

Клетки штамма Alcaligenes sp. ВКПМ В-6706 по сравнению с клетками вышеописанного микроорганизма проявляли нитрилазную активность в более широком диапазоне температур 2 - 65С. Хотя максимальная активность клеток отмечена при 50С, проводить гидролиз акрилонитрила лучше при 30С. Более высокие температуры быстро инактивируют нитрилазу. Интервал значений рН для проявления ферментативной активности штамма 4.0 - 9.5, с оптимумом при рН 8.0 [6].

Нитрилаза, выделенная из клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Л, проявляла наибольшую активность при рН около 7.5. Температурный оптимум 45С, выше 50С фермент быстро терял активность. Исследования

проводили с бензонитрилом в качестве субстрата, так как очищенный фермент не способен трансформировать акрилонитрил, что, видимо, связано с меньшей способностью к комплексообразованию у акрилонитрила по сравнению с ароматическими нитрилами [49].

Интактными клетками Rhodococcus rhodochrous Л акрилонитрил подвергался гидролизу. В процессе трансформации при 30С нитрилазная активность длительное время оставалась на постоянном уровне. Оптимальное значение рН реакционной смеси 7.8 поддерживали внесением 6 М раствора КОН [71,93].

Высокая активность нитрилазы у клеток штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 сохранялась при 60 и 65С в течение 15-30 минут, с максимумом при 55С. Несмотря на эти данные, процесс получения концентрированных растворов акрилата аммония проводили при 30С. Максимальная активность нитрилазы клеток Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 находится в диапазоне рН 6 -7, характерном для водных растворов акрилата аммония. В этом случае отпадала необходимость подтитровки щелочью в ходе реакции [83].

Важными характеристиками для процесса трансформации являются стабильность клеток к высоким концентрациям субстрата и продукта реакции.

Для того чтобы снизить токсическое воздействие акрилонитрила на клетки бактерий, биотрансформацию осуществляют в периодическом режиме, дробно добавляя субстрат.

Для получения растворов акрилата аммония 48 - 50 % концентрации с использованием клеток штаммов Rhodococcus rhodochrous Ли Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 процесс вели при периодическом внесении акрилонитрила, поддерживая его концентрацию на уровне 200 ммоль [71, 83]. При более высоких концентрациях субстрата наблюдалось угнетение нитрилазной активности. Продукт реакции, акрилат аммония, также оказывал

ингибирующее действие на нитрилазную активность клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Л, заметно замедляя процесс при достижении 25 % концентрации.

Получение концентрированных растворов акрилата аммония с использованием клеток штамма Alcaligenes sp. ВКПМ В-6706 можно осуществлять, добавляя акрилонитрил в раствор до концентрации 2 % [6]. По мере гидролиза субстрата в реакционную среду вносили новые порции акрилонитрила. Данные, представленные авторами, свидетельствуют, что в результате 9 часовой биотрансформации был получен 14% раствор акрилата аммония. Но, видимо, из-за инактивации фермента, скорость гидролиза резко замедлилась, и реакцию остановили.

Описывая характеристики процесса гидролиза мононитрилов с применением интактных клеток штамма Alcaligenes sp. AK866N, японские иссследователи подчеркивают, что важной особенностью используемых ими бактерий является толерантность к высоким концентрациям мононитрила. К сожалению, авторы не приводят конкретных примеров трансформации акрилонитрила [88].

Решать проблему повышения устойчивости биокатализатора к ингибирующему действию субстрата и продукта реакции ученые пытаются двумя путями: во-первых, это поиск новых штаммов; во-вторых, создание защищенных форм биокатализатора (иммобилизованные клетки).

Согласно литературным данным, наиболее близки к реализации в промышленных масштабах технологии получения акрилата аммония, разработанные Armitage с соавторами [84, 91]. Главным преимуществом новой нитрилазы, продуцированной клетками штаммов Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 или Rhodococcus rhodochrous NCDMB 40833, является высокая активность при низких концентрациях субстрата (константа Михаэлиса (К_т) по отношению к акрилонитрилу меньше 500 мкМ). Это выгодно, так как при низких концентрациях акрилонитрила в

реакционной среде не инактивируется фермент нитрилаза, а скорость гидролиза остается высокой.

Другим важным преимуществом является высокое значение константы ингибирования (К{) по акрилату аммония, что позволяет получать аммонийную соль акриловой кислоты вплоть до 50 % концентрации. Большое численное значение отношения Km /Kj, показывает возможность трансформации остаточного акрилонитрила в концентрированных растворах акрилата аммония [83].

Авторы штамма Rhodococcus rhodochrous NCTMB 40757 показали
возможность иммобилизации клеток или экстракта из них в
полиакриламидные гранулы, без потери нитрилазной активности [91].
Микроорганизмы, иммобилизованные в поперечно сшитых полимерных
гранулах, сохраняли свою активность в течение 17 суток при комнатной
температуре. В литературных источниках приводятся примеры

использования клеток, инкапсулированных в полимерные гранулы, для осуществления непрерывного и повторяющегося ступенчато-периодического процессов. Процессы проводили при 20С. При непрерывном синтезе с использованием иммобилизованного катализатора концентрация акрилата аммония возрастала в реакторе до 35%. Затем в автоматическом режиме в реактор раздельно подавали акрилонитрил и воду, поддерживая концентрацию акрилата аммония между 33 и 35%, а концентрацию акрилонитрила - между 2.4 и 3.6%. Во время опыта поток реакционной смеси непрерывно выводился из реактора для поддержания постоянного рабочего объема. Гранулы возвращались в реактор, а продукт поступал в резервуар, содержащий иммобилизованный ферментный материал, для остаточного гидролиза акрилонитрила. Конечный раствор содержал 39% акрилата аммония, концентрация акрилонитрила была ниже уровня обнаружения. К сожалению, время, в течение которого проводился опыт, и объемы полученного раствора акрилата аммония авторами указаны не были.

Повторяющийся ступенчато-периодический процесс с использованием иммобилизованных клеток осуществляли так же, как и при использовании интактных клеток. Полимерные гранулы помещали в реактор и суспендировали в воде. Затем добавляли акрилонитрил до концентрации 1.2%. Когда концентрация акрилонитрила в реакционной смеси снижалась до 0.9%, автоматически добавлялась очередная порция акрилонитрила. В результате была достигнута концентрация акрилата аммония 45%, а концентрация акрилонитрила падала практически до нуля.

Образовавшийся раствор акрилата аммония выводили из реактора и фильтровали для удаления иммобилизованного катализатора, который вновь возвращался в реактор для повторного использования. Количественные характеристики процесса, кроме концентрации начального и конечного продукта, авторами не уточняются.

Несмотря на несомненные достижения в развитии биотехнологии получения акрилата аммония с помощью микроорганизмов, обладающих нитрилазной активностью, исследования в этой области продолжаются. Их основная цель - создание биокатализатора, использование которого позволило бы сделать этот процесс рентабельным [84, 87, 90, 95].

Суммируя изложенное выше, указываем следующее: потребность в акрилатных полимерах возрастает. Химические технологии получения акриловой кислоты имеют целый ряд недостатков. В то же время, литературные данные показывают возможность создания процесса получения акрилата аммония с использованием микроорганизмов. Мягкие условия синтеза, высокая чистота получаемого продукта, отсутствие токсичных отходов характеризуют эту технологию, как перспективную. Поэтому целью настоящей работы явилось создание высокоактивного биокатализатора, способного трансформировать акрилонитрил в аммонийную соль акриловой кислоты, и разработка на его основе технологии получения акрилата аммония.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Исследуемые объекты и штаммы микроорганизмов

Материалом для выделения штаммов-трансформаторов акрилонитрила служили:

образцы почв, взятые с территории производства акрилонитрила (26 проб);

активный ил очистных сооружений (5 проб);

пробы сточных вод производства акрилонитрила (56 проб).

Всего исследовано 155 неидентифицированных штаммов, выделенных из различных объектов окружающей среды.

Микроорганизмы хранили на агаризованной LB-среде (косяки, столбики) при температуре 4С с пересевами через каждые три месяца.

2.2. Среды

Стандартные среды, используемые в работе микробиологических лабораторий: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), перевар Хоттингера, LB-среда (г/л): пептон Bacto - 10.0; дрожжевой экстракт Bacto - 5.0; NaCl-10.0.

Выделение микроорганизмов проводили на синтетических средах следующего состава:

среда "СА" (г):

глицерин - 5.0

дрожжевой экстракт - 5.0

К₂НР0₄ -0.1

MgS0₄-7H₂0 -0.1

дистиллированная вода -1000,

рН среды 7.2±0.2.

дистиллированная вода -1000, рН среды 7.2±0.2.

В качестве селектирующего агента использовали акрилонитрил в концентрациях от 0.01 до 3.0 г/л.

Исследование спектра субстратов, утилизируемых выделенными микроорганизмами, проводили на жидкой среде "СС" (г):

Na₂HP0₄ 12Н₂0 - 6.0

КН₂Р0₄ - 2.0

MgS0₄ 7Н₂0 - 0.7

дистиллированная вода - 1000

Выращивание штамма Alcaligenes denitrifwans С-32 - продуцента фермента нитрилазы осуществляли на средах следующего состава: среда "АВ" (г):

Na₂HP0₄ 12Н₂0 -6.0

КН₂Р0₄ - 2.0

MgS0₄ 7Н₂0 - 0.7

кукурузный экстракт - 5.0

ацетат аммония - 5.0

дистиллированная вода -1000

ЬИБЛНОТ&і

среда "АС" (г): Na₂HP0₄ 12Н₂0 КН₂Р0₄ MgS0₄ 7Н₂0 кукурузный экстракт ацетат аммония дистиллированная вода

6.0

-2.0

-0.7

-10.0

-10.0

- 1000.

Для определения потребностей изучаемых штаммов в различных микроэлементах использовались смеси Дрюса и Пфеннига [10].

Изучение влияния рН на нитрилазную активность интактных клеток проводили с использованием 0.1 М буферных растворов: цитрат-фосфатного (рН 4-6); фосфатного (рН 4.0 - 8.0); трис-солянокислого ( рН 8-12); NaOH -глицинового (рН 9.0 - 12.0).

При исследовании условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония, а также для определения нитрилазной активности клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 использовали 0.01 М калий-натрий фосфатный буферный раствор, рН 7.5.

2.3. Исследуемые соединения

Нитрилы, использованные в работе в качестве субстратов и индукторов нитрилазной активности штамма Alcaligenes denitrificans С-32, приведены в таблице 1.

Таблица 1

Нитрилы, использованные в работе

2.4. Методы выделения микроорганизмов, способных трасформировать акрилонитрил в акрилат аммония

Выделение микроорганизмов проводили общепринятыми методами прямого высева и адаптивной селекции [7]. Адаптивная селекция проводилась в двух вариантах: методом накопительной культуры и методом ступенчатой адаптации к повышающимся концентрациям селектирующего агента акрилонитрила в концентрациях от 0.01 до 3.0 г/л.

Навеску почвы или активного ила (1.0 г), аликвоту сточной воды (1 мл) суспендировали в 10 мл стерильного физиологического раствора и выдерживали в течение 1 ч. Далее 5 мл надосадочной жидкости помещали в колбы Эрленмейера объемом 300 мл, заполненные на 1/6 часть средой "СВ," и культивировали при 28С и круговом перемешивании на качалке (160 об/мин). Ежедневно в течение 30 суток половину культуральной жидкости стерильно удаляли из колбы, а оставшуюся часть вновь доводили до первоначального объема (50 мл) средой аналогичного состава, постепенно уменьшая количество глюкозы и пептона. В качестве селектирующего агента был использован акрилонитрил. Его концентрация в среде увеличивалась ступенчато от 0.01 до 3.0 г/л. Полученные через 30 суток образцы высевали на агаризованную среду вышеуказанного состава. Выросшие колонии дважды рассевали на питательной агаризованнои среде для проверки на чистоту, после чего анализировали на способность трансформировать акрилонитрил в акриловую кислоту.

Для выделения микроорганизмов методом накопительной культуры 1.0 мл сточной воды, 1.0 г образца почвы или активного ила вносили в 50 мл среды "СА", содержащей акрилонитрил в качестве селектирующего агента в концентрации 3.0-5.0 г/л. Образцы инкубировали в течение двух недель при 29 ± 1С и постоянном перемешивании. Периодически, один раз в 3-4 суток, 10.0 мл культуральной жидкости стерильно пересевали в свежую среду аналогичного состава. Параллельно проводили хроматографический анализ метаболитов, накапливающихся в среде в процессе утилизации нитрилов, отбирая из колб пробы в объеме 2-3 мл. Отобранные образцы центрифугировали и надосадочную жидкость исследовали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). При наличии в пробах акриламида или акриловой кислоты соответствующую культуральную жидкость после нескольких последовательных 10-кратных разведений в стерильном

физиологическом растворе высевали на МПА. Выросшие колонии подвергали дальнейшему изучению.

С целью оценки способности выделенных штаммов утилизировать акрилонитрил, микроорганизмы высевали на жидкую или агаризованную среду "СВ", содержащую в качестве селектирующего агента акрилонитрил (3 г/л). Культивирование осуществляли в течение 2 суток при 29±1С и постоянном перемешивании. Вследствие высокой летучести акрилонитрила, его вносили в среду выращивания непосредственно перед засевом. Для уменьшения отлета нитрила в процессе культивирования чашки помещали в герметичные полиэтиленовые пакеты, а колбы герметизировали полиэтиленовой пленкой. Через двое суток бактериальную суспензию разделяли на центрифуге при 6000 об/мин в течение 20 мин. Осажденные клетки отмывали 0.01 М фосфатным буфером, рН 7.5±0.2, и анализировали на способность трансформировать акрилонитрил.

2.5. Идентификация культур

Идентификацию микроорганизмов проводили на основе изучения физиолого-биохимических и морфолого-культуральных свойств, используя тесты, предложенные в определителе бактерий Берджи [12].

2.6. Определение концентрации микробных клеток

Рост клеток и величину микробной нагрузки оценивали по значению оптической плотности раствора на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 540 нм в кювете с толщиной оптического слоя 5 мм, а затем пересчитывали на сухой вес (г/л) по предварительно построенной калибровочной кривой (для исследуемого штамма Alcaligenes denitrificans С-32 1 ед ОД соответствовала 0.58 г/л по сухому весу клеток).

2.7. Изучение нитрилазной активности выделенных штаммов микроорганизмов

2.7.1. Определение нитрилазной активности интактных клеток штаммов-продуцентов нитрилазы

Исследуемую суспензию клеток центрифугировали на лабораторной центрифуге T23D при 6000 об. мин ~¹ в течение 20 мин. Осажденные клетки отмывали 0.01 М фосфатным буфером, рН 7.5+0.2, и ресуспендировали в 1 мл этого же буфера до оптической плотности 1.0. В суспензию вносили акрилонитрил до концентрации 10.0 г/л. Трансформацию акрилонитрила проводили на водяной бане при 20С и постоянном перемешивании. Реакцию останавливали через 15 мин внесением в реакционный раствор 6Н НС1 в объеме 0.05 мл. За единицу нитрилазной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 ммоль акриловой кислоты в единицу времени (1 мин). Удельная нитрилазная активность выражалась числом единиц нитрилазной активности, приходящихся на 1 г сухого веса клеток. Общая нитрилазная активность определялась как число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мл культуральной жидкости (ед/мл). Концентрацию клеток оценивали по оптической плотности суспензии.

Количественное определение образовавшейся акриловой кислоты проводили методом газовой хроматографии (стальная колонка 1 = 2 м, d = 5 мм, сорбент - Инертон NAW HMDS с 15 % Reoplex - 400, газ-носитель - азот) и спектрофотометрическим методом при длине волны 255 нм.

2.7.2. Изучение возможности использования нитрилов для роста клеток
штамма Alcaligenes denitrificans С-32

Исследуемые соединения вносили в среду "СС", создавая концентрацию 1 г/л. Бактерии, подращенные на МПА, суспендировали в стерильном физиологическом растворе. Клеточную суспензию инокулировали в среду с исследуемыми соединениями. Посевная доза составляла 0.1 ед оптической плотности. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/6 часть средой, при температуре 29±1С и постоянном перемешивании. Через 48 часов инкубации, взяв за основу критерий роста, оценивали способность исследуемых субстратов выступать в качестве единственного источника углерода и азота.

2.7.3. Изучение индуцирующей способности нитрилов

Способность различных нитрилов и є-капролактама выступать в роли индуктора нитрилазы штамма Alcaligenes denitrificans С-32 оценивали на среде "АВ".

Исследуемые соединения вносили в среду культивирования, создавая концентрацию 1 г/л. Бактерии, подращенные в течение суток на МПА, суспендировали в стерильном физиологическом растворе. Клеточную суспензию инокулировали в среду с нитрилом или є-капролактамом, создавая концентрацию микроорганизмов, соответствующую 0.1 ед оптической плотности. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/6 часть средой, при температуре 29±1С и постоянном перемешивании в течение 48 часов. Периодически отбирали пробы культуральной жидкости в объеме 2.0 мл для оценки роста клеток и нитрилазной активности.

2.7.4. Исследование влияния состава питательной среды на рост и нитрилазную активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32

Оптимизацию состава среды культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проводили на среде "АВ", последовательно меняя в ней каждый из компонентов.

Клетки штамма в течение суток подращивали в бактериологических пробирках с 10 мл мясопептонного бульона. Полученную культуральную суспензию вносили в колбы объемом 300 мл, содержащие по 50 мл среды "АВ" и исследуемые соединения в концентрации 0.1 - 20.0 г/л. Культивирование осуществляли при температуре 29±1С и круговом перемешивании.

Рост культуры оценивали по изменению оптической плотности в образцах культуральной жидкости, а нитрилазную активность - в реакции трансформации акрилонитрила в акрилат аммония.

2.8. Исследование условий культивирования штамма Alcaligenes denitrificans С-32

2.8.1. Изучение физиологических параметров роста штамма Alcaligenes denitrificans С-32

Оптимизацию температурного режима культивирования клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 проводили на среде "АС". Клетки штамма, выращенные на МПБ в течение 24 часов, вносили в колбы Эрленмейера, заполненные на 1/6 часть средой. Засевная доза, определяемая по оптической плотности, составила 0.1 ед. Культивирование проводили в течение двух суток при перемешивании, соблюдая определенный

температурный режим: 20,25, 30, 35 и 42С. Через 48 часов оценивали рост и нитрилазную активность клеток.

При определении оптимального значения рН для начального роста штамма С-32 среды "АВ" и "АС" перед инокулированием культурой подтитровывались 1 Н растворами NaOH или НС1. Культивирование проводили в тех же условиях, оценивая через 24 и 30 часов рост и нитрилазную активность клеток.

2.8.2. Изучение процесса роста клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в ферментере с периодическим режимом культивирования

Для оптимизации культивирования использовались аппараты Multigen (модель F-2000) и АК-203, 210 объемом 2.0, 3.0 и 10.0 л., соответственно. Стерилизацию ферментеров вместе со средой "АС", проводили в автоклаве при 1.0 атм, температуре 121 С в течение 1 ч. Сульфат магния в виде 10 % раствора стерилизовали отдельно и вносили в аппараты перед началом ферментации. Посевной материал готовили выращиванием культуры в колбах Эрленмейера со средой "АВ" в течение суток. Полученную таким образом 24 часовую культуру инокулировали (100 мл на 1 л среды) в ферментер.

Выращивание биомассы проводили в следующих условиях:

объем культуральной среды - 1000 мл;

скорость перемешивания - 600 об. мин ^_1;

аэрация -1:2 мин"¹;

температура -31±1С;

рН -7.4±0.2. Культивирование проводили при контролируемом значении рН и

небольшом избыточном давлении воздуха. Для подтитровки использовали 30

и 50 % растворы уксусной кислоты. При изучении влияния аэрации на рост и
ферментативную активность клеток этот параметр изменяли. Для этого
использовали разные системы аэрации. Первая система обеспечивала
распределение подаваемого воздуха в среде с помощью механического
перемешивания, вторая система кислородообеспечения

пневмосатурационная. Периодически из аппарата отбирали пробы культуральной жидкости для определения концентрации клеток, чистоты культуры и нитрилазной активности. Чистоту культуры оценивали по высевам из отобранных проб на плотную питательную среду и данным микроскопического анализа мазков. По достижению стационарной фазы роста клеток (48-72 ч) ферментацию останавливали. Отделение биомассы проводили центрифугированием на лабораторной центрифуге T23D при 6000 об.мин"¹ в течение 20 мин.

Наработанную в процессе ферментации биомассу хранили в замороженном виде.

2.9. Изучение процесса трансформации акрилонитрила в акрилат аммония с использованием штамма Alcaligenes denitrificans С-32

2.9.1. Оптимизация условий реакции гидролиза акрилонитрила

С целью оптимизации условий реакции было изучено влияние температуры, рН, солевого состава реакционного раствора, микробной нагрузки, концентрации акрилонитрила; определены условия, необходимые для остановки реакции трансформации.

Клетки штамма Alcaligenes denitrificans С-32, полученные аэробным культивированием на среде "АС", отмывали 0.01 М фосфатным буферным раствором, рН 7.5±0.05 и ресуспендировали в буфере того же состава, создавая концентрацию клеток 0.1-5.0 г/л. Для проведения реакции

трансформации по 1 мл суспензии переносили в пластиковые пробирки, добавляли акрилонитрил и помещали пробирки на водяную баню. Реакцию проводили при постоянном перемешивании. Остановку процесса гидролиза осуществляли внесением в реакционный раствор соляной кислоты. Условия трансформации изменяли в зависимости от изучаемого параметра. В случае исследования влияния солевого состава среды на нитрилазную активность клеток использовали фосфатный буфер, физиологический раствор, водопроводную и дистиллированную воду.

2.9.2. Исследование основных технологических параметров процесса получения акрилата аммония с использовнием штамма Alcaligenes denitrificans С-32

Биомассу штамма Alcaligenes denitrificans С-32, полученную в процессе аэробного культивирования на среде "АС", суспендировали в водной среде, рН 8.5±0.5, в количестве 0.3 - 30.0 г/л по сухому весу. Полученную суспензию вносили в термостатируемый стеклянный реактор с мешалкой. Акрилонитрил добавляли в реакционный раствор в начале реакции трансформации, дробно или непрерывно на протяжении всего процесса так, чтобы его концентрация не превышала 0.1 - 2.0 %. Гидролиз акрилонитрила проводили при температуре от 20 до 50 С при постоянном перемешивании. Время реакции варьировали от 30 мин до 24 часов. Концентрацию компонентов реакционной смеси определяли методами ГЖХ и ВЭЖХ. По окончании микробной трансформации клетки отделяли центрифугированием на лабораторной центрифуге T23D при 6000 об.мин"¹ в течение 20 мин.

Методические особенности отдельных экспериментов приведены в соответствующих главах.

Результаты экспериментов обрабатывались статистически с использованием критерия Стьюдента.

Акриловая кислота. Ее свойства и области применения. Способы получения акриловой кислоты

В настоящее время в химической и микробиологической промышленности производится широкий спектр карбоновых кислот, использующихся в различных областях. Непредельные кислоты - большая группа карбоновых кислот, в молекулах которых два атома углерода связаны между собой двойными связями. Эти кислоты и их производные используются как мономеры при полимеризации или сополимеризации для получения широкого спектра полимеров различного назначения [11].

Акриловая кислота (пропеновая, этиленкарбоновая) - непредельная кислота, представляющая собой бесцветную жидкость с резким специфическим запахом, растворима в воде, спирте, хлороформе, бензоле, токсична [17]. При хранении полимеризуется, ингибитор полимеризации -гидрохинон. При УФ облучении или в кислых водных растворах (рН «1) образует полиакриловую кислоту. Соли и эфиры акриловой кислоты называются акрилатами.

Область использования акриловой кислоты и ее производных (солей и эфиров) все более расширяется: акриловая кислота служит сырьем для производства синтетических волокон, ионообменных смол, каучуков, пластмасс [14]. Ее водные растворы с последующей полимеризацией применяются для загущения клеевых систем, для получения звукопоглощающих материалов, как связующее средство в производстве изделий с высокой плотностью из тонкодисперсной технической керамики, для прививок на пленки с целью придания им гидрофильных свойств. Аммонийная соль акриловой кислоты в виде сополимера с этилакрилатом и метилметакрилатом используется в текстильной промышленности для шлихтования синтетических нитей и пряж; при производстве обоев - в качестве загустителя при их печати; в кожевенной - в качестве загустителя для выделки натуральных кож.

Материалы на основе полимеров и сополимеров акриловой кислоты нашли широкое применение в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства [1]: в изготовлении резинотехнических изделий, электроизоляционных материалов, герметиков, в производстве лакокрасочных материалов высокой ударопрочности, в печатной промышленности, как растворители для типографской краски и отделки печатных плат, в оптике, как полимерная красящая композиция для волоконооптических датчиков и при изготовлении оптических изделий (видеодисков, призм, линз), в медицине в качестве гидрофильных мембран, биологически активных полимеров, при изготовлении препаратов для лечения глаукомы, контактных линз, искусственных зубов и зубных протезов, в экологосберегающих технологиях, при очистке сточных вод и укреплении поверхности горных отвалов, для предотвращения выветривания, пылеобразования и водной эрозии почв. Анионные полимеры, представляющие собой сополимеры акриламида и акриловой кислоты или ее солей широко используются как флокулянты и суперабсорбенты (средства гигиены, кондиционеры почвы). Высокомолекулярные сополимеры включены в рецептуры буровых растворов при нефте- и газодобыче.

Основным промышленным способом получения акриловой кислоты является окисление пропилена на многокомпонентных катализаторах [3, 16]. Процесс протекает в две основные стадии, при высокой температуре и требует достаточно сложного аппаратурного обеспечения:

На первой стадии происходит окисление пропилена кислородом воздуха в акролеин в присутствии водяного пара и азота в стационарном слое окисного катализатора при температуре 160-180С. Затем смесь газов поступает в следующий реактор, где происходит окисление акролеина до акриловой кислоты на катализаторе второй стадии при температуре 220С. Реакционные газы из второго реактора поступают в абсорбер, где происходит абсорбция продуктов реакции циркулирующим водным раствором кислот. Помимо акролеина, основными побочными продуктами являются ацетальдегид, уксусная, пропионовая и малеиновая кислоты, диоксид и оксид углерода. Несмотря на то, что продукты окисления проходят несколько стадий разделения и очистки, получаемая акриловая кислота относится к эфирному сорту, и может использоваться только для синтеза различных эфиров, таких как метилакрилат, бутилакрилат. Для получения высокоочищенного продукта полимерного сорта необходима дополнительная стадия ректификации. К недостаткам описанного процесса можно отнести характерные особенности химических синтезов: высокие энергозатраты, необходимость специального оборудования, нескольких стадий очистки и образование побочных продуктов и отходов.

Одним из первых методов получения акриловой кислоты является метод Реппе, основанный на гидрокарбоксилировании ацетилена, но высокая токсичность и сильные коррозионные свойства катализатора - карбонила никеля, ограничивают возможность его широкого использования [9].

Другие химические способы получения акриловой кислоты, такие как жидкофазное окисление акролеина кислородом в ароматическом растворителе, взаимодействие уксусной кислоты и формальдегида (или его производного), характеризуются низким выходом продукта, дороговизной катализатора, сложностью выделения синтезированной акриловой кислоты.

Кроме химических методов существуют комбинированные способы получения акриловой кислоты. Так в патенте [21] описано получение акриловой кислоты и ее эфиров из молочной кислоты и лактатов. На первом этапе ферментационным методом получают соли молочной кислоты с помощью микроорганизмов рода Lactobacillus, затем концентрируют их и этерифицируют. На последнем этапе, используя химический катализатор и нагрев до 80С, проводят дегидратацию сложных эфиров молочной кислоты с выделением эфиров акриловой кислоты. Для выделения свободной акриловой кислоты может быть введена дополнительная стадия. Этот метод также не лишен недостатков. Прежде всего это низкий выход целевого продукта, приводящий к дополнительным затратам на концентрирование, выделение и очистку от побочных продуктов.

Таким образом, современным способам получения акриловой кислоты присущи особенности, характерные для химических производств. Возможное решение проблемы - это использование биокаталитического способа, так как известно, что биологические каталитические системы превосходят химические по селективности и эффективности. Биотехнологические процессы протекают в мягких условиях (невысокая температура, атмосферное давление, рН среды близкое к нейтральному), обладают малой энергоемкостью, невзрывоопасны и реализуются с использованием достаточно простого оборудования.

Методы выделения микроорганизмов, способных трансформировать акрилонитрил в акрилат аммония

Получение концентрированных растворов акрилата аммония с использованием клеток штамма Alcaligenes sp. ВКПМ В-6706 можно осуществлять, добавляя акрилонитрил в раствор до концентрации 2 % [6]. По мере гидролиза субстрата в реакционную среду вносили новые порции акрилонитрила. Данные, представленные авторами, свидетельствуют, что в результате 9 часовой биотрансформации был получен 14% раствор акрилата аммония. Но, видимо, из-за инактивации фермента, скорость гидролиза резко замедлилась, и реакцию остановили.

Описывая характеристики процесса гидролиза мононитрилов с применением интактных клеток штамма Alcaligenes sp. AK866N, японские иссследователи подчеркивают, что важной особенностью используемых ими бактерий является толерантность к высоким концентрациям мононитрила. К сожалению, авторы не приводят конкретных примеров трансформации акрилонитрила [88].

Решать проблему повышения устойчивости биокатализатора к ингибирующему действию субстрата и продукта реакции ученые пытаются двумя путями: во-первых, это поиск новых штаммов; во-вторых, создание защищенных форм биокатализатора (иммобилизованные клетки).

Согласно литературным данным, наиболее близки к реализации в промышленных масштабах технологии получения акрилата аммония, разработанные Armitage с соавторами [84, 91]. Главным преимуществом новой нитрилазы, продуцированной клетками штаммов Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 или Rhodococcus rhodochrous NCDMB 40833, является высокая активность при низких концентрациях субстрата (константа Михаэлиса (Кт) по отношению к акрилонитрилу меньше 500 мкМ). Это выгодно, так как при низких концентрациях акрилонитрила в реакционной среде не инактивируется фермент нитрилаза, а скорость гидролиза остается высокой.

Другим важным преимуществом является высокое значение константы ингибирования (К{) по акрилату аммония, что позволяет получать аммонийную соль акриловой кислоты вплоть до 50 % концентрации. Большое численное значение отношения Km /Kj, показывает возможность трансформации остаточного акрилонитрила в концентрированных растворах акрилата аммония [83]. Авторы штамма Rhodococcus rhodochrous NCTMB 40757 показали возможность иммобилизации клеток или экстракта из них в полиакриламидные гранулы, без потери нитрилазной активности [91]. Микроорганизмы, иммобилизованные в поперечно сшитых полимерных гранулах, сохраняли свою активность в течение 17 суток при комнатной температуре. В литературных источниках приводятся примеры использования клеток, инкапсулированных в полимерные гранулы, для осуществления непрерывного и повторяющегося ступенчато-периодического процессов. Процессы проводили при 20С. При непрерывном синтезе с использованием иммобилизованного катализатора концентрация акрилата аммония возрастала в реакторе до 35%. Затем в автоматическом режиме в реактор раздельно подавали акрилонитрил и воду, поддерживая концентрацию акрилата аммония между 33 и 35%, а концентрацию акрилонитрила - между 2.4 и 3.6%. Во время опыта поток реакционной смеси непрерывно выводился из реактора для поддержания постоянного рабочего объема. Гранулы возвращались в реактор, а продукт поступал в резервуар, содержащий иммобилизованный ферментный материал, для остаточного гидролиза акрилонитрила. Конечный раствор содержал 39% акрилата аммония, концентрация акрилонитрила была ниже уровня обнаружения. К сожалению, время, в течение которого проводился опыт, и объемы полученного раствора акрилата аммония авторами указаны не были. Повторяющийся ступенчато-периодический процесс с использованием иммобилизованных клеток осуществляли так же, как и при использовании интактных клеток. Полимерные гранулы помещали в реактор и суспендировали в воде. Затем добавляли акрилонитрил до концентрации 1.2%. Когда концентрация акрилонитрила в реакционной смеси снижалась до 0.9%, автоматически добавлялась очередная порция акрилонитрила. В результате была достигнута концентрация акрилата аммония 45%, а концентрация акрилонитрила падала практически до нуля.

Образовавшийся раствор акрилата аммония выводили из реактора и фильтровали для удаления иммобилизованного катализатора, который вновь возвращался в реактор для повторного использования. Количественные характеристики процесса, кроме концентрации начального и конечного продукта, авторами не уточняются.

Несмотря на несомненные достижения в развитии биотехнологии получения акрилата аммония с помощью микроорганизмов, обладающих нитрилазной активностью, исследования в этой области продолжаются. Их основная цель - создание биокатализатора, использование которого позволило бы сделать этот процесс рентабельным [84, 87, 90, 95].

Суммируя изложенное выше, указываем следующее: потребность в акрилатных полимерах возрастает. Химические технологии получения акриловой кислоты имеют целый ряд недостатков. В то же время, литературные данные показывают возможность создания процесса получения акрилата аммония с использованием микроорганизмов. Мягкие условия синтеза, высокая чистота получаемого продукта, отсутствие токсичных отходов характеризуют эту технологию, как перспективную. Поэтому целью настоящей работы явилось создание высокоактивного биокатализатора, способного трансформировать акрилонитрил в аммонийную соль акриловой кислоты, и разработка на его основе технологии получения акрилата аммония.

Изучение параметров роста клеток штамма AIcaligenes denitrificans С-32 на питательной среде, содержащей перевар Хоттингера

Известно, что основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются источники углерода и азота. От 10 до 60 % стоимости продуктов микробной ферментации может приходиться на компоненты среды и, прежде всего, на источник углерода. Для снижения затрат в микробиологическом производстве обычно применяют среды, приготовленные на основе растительного сырья, при этом чаще всего используют крахмал, мелассу, декстрины, глюкозу, лактозу и им подобные вещества.

На начальном этапе исследования было установлено, что клетки штамма С-32 хорошо растут на богатых питательных средах, содержащих пептиды. Проведенные работы по идентификации штамма показали, что он не использует в качестве питательного субстрата углеводы и многоатомные спирты, а это значительно затрудняло работу по оптимизации среды для получения высокого урожая клеток. Поэтому, используя в качестве питательной среды бульон на переваре Хоттингера, мы исследовали некоторые доступные вещества на их способность служить дополнительным ростовым субстратом. С этой целью в колбы Эрленмейера, заполненные на 1/6 часть бульоном Хоттингера, вносили одно из исследуемых соединений в концентрации 3 г/л. Среду инокулировали клетками штамма С-32, создавая концентрацию, соответствующую 0.1 ед оптической плотности, и посев инкубировали в течение 36 часов при температуре 29±1С и постоянном перемешивании. В качестве контроля использовалась среда, содержащая перевар Хоттингера без дополнительных источников углерода. Результаты экспериментов приведены в таблице 5.

Из данных, приведенных в таблице 5 видно, что хорошими дополнительными субстратами для роста клеток являются этиловый и пропиловый спирты, а также уксусная и пропионовая кислоты. В то же время бутиловый спирт и этилацетат не используются штаммом Alcaligenes denitrificans С-32 как ростовые субстраты. Сравнивая урожай клеток и изменение рН среды в конце культивирования, мы предположили, что остановка роста культуры, может быть связана с защелачиванием среды из-за неравномерного потребления источника углерода по сравнению с другими компонентами среды. использовать короткоцепочечные одноатомные спирты и одноосновные кислоты в качестве источника углерода, мы увеличили количество дополнительного субстрата до 9 г/л, внося его в среду культивирования порциями. Это позволяло также избежать излишнего сдвига рН среды в щелочную область.

В этих экспериментах в колбы Эрленмейера, заполненные на 1/6 часть бульоном на переваре Хоттингера, содержащим этиловый спирт или уксусную кислоту в концентрации 3 г/л, инокулировали суспензией клеток штамма С-32, создавая концентрацию, соответствующую 0.1 ед оптической плотности. рН среды доводили до значений 7.4±0.2 2Н раствором NaOH. Посевы инкубировли при температуре 29±1С и постоянном перемешивании. Через 24 и 48 часов по мере снижения концентрации дополнительного источника углерода в среду вносили его очередную порцию так, чтобы рН среды было выше значений 7.4±0.2. Общее количество внесенного субстрата составило 9 г/л. Результаты эксперимента представлены в таблице 6.

Из приведенных в таблице 6 результатов видно, что при внесении дополнительного количества источника углерода выход биомассы значительно возрастает, при использовании этилового спирта или уксусной кислоты на 3.1 или 2.4 г/л, соответственно, по сравнению с урожаем клеток, полученном при росте на среде, содержащей перевар Хоттингера без дополнительных источников углерода (контроль).

Анализ состава среды культивирования показал, что этиловый спирт под воздействием ферментной системы клеток штамма С-32 постепенно превращается в уксусную кислоту, которая и усваивается микроорганизмами. Поэтому в дальнейших экспериментах мы использовали только уксусную кислоту.

Как описано в 4 главе, клетки штамма Alcaligenes sp. С-32 за счет проявления нитрилазной активности могли расти на синтетической среде "СС", содержащей нитрилы, используя их как единственные источники углерода, азота и энергии. Для дальнейшей работы нами был выбран ацетонитрил, как наименее токсичный и легкодоступный нитрил.

При исследовании кинетики роста и изменения состава среды культивирования было установлено, что продуктом трансформации ацетонитрила при росте культуры является ацетат аммония, который и выступал в роли ростового субстрата (рис. 1). Эти результаты хорошо согласуются с результатами описанного выше эксперимента, где было показано увеличение урожая клеток после внесения в бульон на переваре Хоттингера уксусной кислоты. Известно, что ацетат аммония является стандартным сырьем, которое широко используется в микробиологической промышленности для культивирования многих штаммов-продуцентов. Это позволило заменить высоколетучий нитрил аммонийной солью уксусной кислоты

Оптимизация условий трансформации акрилонитрила в акрилат аммония клетками штамма Alcaligenes denitrificans С-32

Описанные в литературе биокаталитические способы получения акрилата аммония представлены в виде исключительно лабораторных экспериментов [6,71, 88, 90]. Перейти к опытно-промышленным испытаниям авторам не позволяли характеристики использованных ими штаммов и технологические недоработки изучаемого процесса. К их числу можно отнести низкую удельную нитрилазную активность клеток штамма Rhodococcus rhodochrous NCEMB 40757, высокую микробную нагрузку, необходимую для получения концентрированных растворов акрилата аммония, которая может достигать 50% от общего объема реакционной смеси, что приводит к сильному загрязнению растворов клеточными компонентами. Узкий интервал значений рН, а, именно, 7.6±0.1, в котором активна нитрилаза клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Л, приводит к необходимости подтитровки щелочью. Все это усложняет проведение процесса, делая его немасштабируемым [83,90,93].

Нитрилазы, описанные в литературе, термостабильны, но способов получения акрилата аммония при высоких температурах не представлено. Это связано с тем, что на стабильную, устойчивую работу фермента в процессе синтеза влияют сразу несколько факторов. Один из них -токсичность субстрата, максимально проявляющаяся при длительном воздействии на клетки. Негативные влияния усиливаются при высоких температурах и повышении концентрации конечного продукта трансформации - акрилата аммония.

Сказанное выше определило необходимость в начале разработки процесса получения концентрированных растворов акрилата аммония с использованием клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 исследовать возможность получения этих растворов при различных температурах. Для этого, в термостатируемый реактор помещали дистиллированную воду, доводили рН до 8.0±0.2 и вносили биомассу штамма Alcaligenes denitrificans С-32, создавая микробную нагрузку 20 г/л. Затем в реакционную смесь вводили акрилонитрил, дробно добавляя его, по мере трансформации. Трансформацию проводили при температурах 30, 35 и 40С в течение 7 часов. Периодически отбирали пробы и анализировали их, определяя концентрацию исходного акрилонитрила и конечного продукта - акрилата аммония. Полученные данные представлены нарис. 7.

Анализ кривых накопления акрилата аммония в зависимости от температуры (рис.7) показал, что хотя при 40С скорость трансформации наибольшая, накопления продукта реакции выше 35% не происходит. При 35С максимальная концентрация акрилата аммония составила 40%, при 30С - 49.8%. Это практически максимальная концентрация конечного продукта, так как водные растворы акрилата аммония с концентрацией выше 50% получить невозможно из-за ограниченной растворимости этой соли в воде. В то же время для синтеза всех известных марок полимеров, где в качестве мономера или сомономера используется акриловая кислота, достаточен 30 % раствор акрилата аммония.

Таким образом, показано, что высокая термостабильность нитрилазы клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 позволяет получать концентрированные растворы акрилата аммония при температурах 30-40С. Режимы проведенных синтезов нельзя полностью использовать в качестве модели для опытно-промышленных испытаний, так как высокая микробная нагрузка делает процесс немасштабируемым.

Поэтому следующие серии экспериментов были проведены при минимальной микробной нагрузке. Чтобы убедиться, что нитрилазная активность клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32 сохраняется при высоких концентрациях акрилонитрила в реакционной среде, мы проводили синтез при однократном его введении. Для этого интактные клетки суспендировали в дистиллированной воде, рН 8.0, создавая микробную нагрузку 0.5 г/л. К водной взвеси клеток при перемешивании в один этап добавляли 6.1% (концентрация, близкая к пределу растворимости в воде) нитрила акриловой кислоты. Гидролиз проводили при 30С.

В результате за 5 часов реакции акрилонитрил был полностью трансформирован в акрилат аммония. Концентрация последнего достигла 10.05%. Тем самым было показано, что, во-первых, нитрилазная активность клеток штамма не зависит от концентрации субстрата в реакционной среде (табл. 19) и, во-вторых, при однократной загрузке субстрата можно получать 10% растворы акрилата аммония.

Для многих марок анионных полимеров вполне достаточно использовать растворы акрилата аммония с концентрацией 18-20 %, поэтому в дальнейшей работе нами разрабатывался процесс получения именно таких растворов. В лабораторных условиях мы отработали процесс с упрощенной схемой подачи акрилонитрила, минимизируя микробную нагрузку так, чтобы общее время реакции не превышало 8-10 часов. Для этого, в термостатируемый 3-х литровый реактор, представляющий собой емкость с мешалкой, загружалась дистиллированная вода, рН 8.0±0.2, биомасса штамма Alcaligenes denitrificans С-32, полученная в промышленных условиях (ОАО "Биосинтез", г. Пенза). Микробная нагрузка составляла 2 г/л (по сухому весу). Акрилонитрил подавали порционно, по мере его трансформации. В результате за 6 часов был получен 19.5 % раствор акрилата аммония. Температура процесса 36±1С.

Похожие диссертации на Биокаталитическое получение акрилата аммония

Биокаталитическое получение акрилата аммонияПолтавская Светлана Викторовна

Сравнительное изучение процессов стабилизации атомов отдачи азота-13 в системах жидкость-газ, влияние параметров системы. Получение [13N]-аммония Федорова Ольга Сталлитовна

Исследование сорбционных методов извлечения рения из промывной кислоты и разработка технологии получения высокочистого перрената аммонияЗахарьян, Семен Владимирович

Технологические основы получения обесфторенного фосфата аммония Олефиренко Вадим Иванович

Получение азотных удобрений на основе карбамида, нитрата аммония и аммонийных солей дикарбоновых кислотКулдашев, Тулкин Неъматович

Разработка способа получения ультрадисперсных порошков молибдена азотно-водородным восстановлением парамолибдата аммонияЕдренникова Елена Евгеньевна

Разработка технологии получения гранулированных NPK-удобрений методом окатывания на основе сульфата аммония и хлорида калия, содержащего примеси флотореагентовФедотова, Ольга Александровна

Технология получения гранулированного карбамида и сложного удобрения на его основе - карбасульфата аммонияСолдатов Алексей Владимирович

Разработка основ технологии получения чистых фосфатов (NH4 , Na, K, Ca) из технического фосфата аммония (аммофоса)Искулов, Владимир Феликсович