Содержание к диссертации
Введение 7
Глава I. Обзор литературы 9
Альгофлора загрязненных экосистем 9
Воздействие токсических веществ и нефти на водоросли 11
Разрушение водорослями токсических веществ 13
Воздействие фенола на водоросли 17
Биодеградация фенола 18
Биодеградация фенола бактериями 19
Биодеградация фенола микроводорослями 24
1.6. Биодеградация фенантрена 29
Биодеградация фенантрена бактериями 30
Биодеградация фенантрена грибами 35
Биодеградация фенантрена водорослями 36
1.7. Фитобиоремедиация 38
Глава П. Материал и методы исследования 41
П. 1. Среды и условия культивирования водорослей и бактерий 41
II. 2 Штаммы водорослей и бактерий, растения 42
II. 3. Методы очистки и клонирования 43
П.4. Регистрация роста культур водорослей и бактерий 44
11.5. Тестирование устойчивости водорослей и ассоциаций к токсическим 45
веществам
II. 5.1. Устойчивость к тяжелым металлам 45
П.5.2. Устойчивость к ароматическим углеводородам 45
П.5.3. Устойчивость к поверхностно-активным веществам 45
II. 5.4. Устойчивость водорослей и искусственных ассоциаций к мазуту 46
11.6. Тестирование разрушения фенола 46
П.6.1. Разрушения фенола бактериями 46
П.6.2. Разрушения фенола искусственными ассоциациями 46
П. 6.3. Разрушения фенола штаммами водорослей 47
П.6.3.1. Скрининг водорослей на способность разрушать фенол (5 мг/л) в среде 47
П.6.3.2. Разрушение фенола (10 мг/л) водорослей в среде ВВМ или Kuhl 47
II. 7. Тестирование разрушения фенантрена 48
II. 7.1. Скрининг на разрушение фенантрена природными ассоциациями, 48
бактериями и водорослями
П.7.2. Разрушение фенантрена искусственными ассоциациями 48
II. 7.3. Биотрансформация фенантрена штаммом водоросли Scenedesmus 48
obliquus ES-55
II.8. Регистрация изменения пигментации 49
П.9. Метод реплик 51
11.10. Аналитические методы 51
II. 10.1. Колориметрический анализ 51
П. 10.2. Новый метод определения снижения концентраций фенантрена 52
II. 10.3. HPLC анализ 53
П. 10.4. Метод газовой хроматографии / масс-спектрометрии (ГХ/МС) 53
П. 11. Моделирование искусственных ассоциаций и их апробация в пилотном 54
эксперименте
П. 11.1. Пробы воды 54
II. 11.2. Определение бактериальной микрофлоры из озера 54
II. 11.3. Селекция штаммов водорослей и бактерий 5 5
II. 11.4. Иммобилизация на носителях 55
П.11.5. Пилотная установка 55
Глава Ш. Результаты исследований и обсуждение 58
III. 1. Происхождение культур водорослей и цианобактерий, первый этап 58
отбора III. 2. Скрининг штаммов водорослей по признаку «выцветание хлорофилла» 60
при воздействии токсикантов
III. 3. Создание коллекции ES 62
Ш.4. Разнообразие проявления устойчивости штаммов водорослей к 63
загрязнению ароматическими веществами
Ш.4.1. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода Chlorella 64
Ш.4.2. Устойчивость к ароматическим веществам водорослей рода 65
Scenedesmus Ш.4.3. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода Stichococcus 66
Ш.4.4. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода 69
Klebsormidium
Ш.4.5. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода 70
Chlamydomonas
Ш.4.6. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов рода Kirchnerielia 70
Ш.4.7. Устойчивость к ароматическим веществам штаммов Chlorococcum 71
vacuolatum и Tetracystisfissurata
III. 5. Разрушение фенола 74
Ш. 5.1. Изучение разрушения фенола искусственными альго-бакгериальными 74
ассоциациями
Ш.5.2. Биодеградация фенола штаммами водорослей 76
III.5.2.1. Скрининг водорослей на способность к разрушению фенола 76
Ш.5.2.2. Способность штамма Chlorella vulgaris CALU-IS7 к разрушению 77
фенола
III. 5.2.3. Способность штамма Scenedesmus obliquus ES-5 5 к разрушению фенола 79
III.5.2.4. Способность штамма CA/orococc«/wvacMo/a^i//7iES-l5 к разрушению 80
фенола
Ш.5.2.5. Способность штамма Chlorococcum vacuolatum ES-18 к разрушению 82
фенола
Ш. 5.2.6. Способность штамма Kirchnerielia obessa ES-60 к разрушению фенола 83
Ш. 5.2.7. Способность штамма Klebsormidium flaccidum ES-29 к разрушению 84
фенола
Ш.5.2.8. Способность штамма Tetracystisfissurata ES-84 к разрушению фенола 84
III. 6. Разрушение фенантрена 86
III. 6.1. Скрининг природных ассоциаций, бактерий и водорослей на 86
способность к разрушению фенантрена
Щ.6.2. Разрушение фенантрена искусственными ассоциациями 87
Ш.6.3. Динамика снижения концентрации фенантрена штаммами зеленых 88
водорослей
Ш.6.4. Биодеградация фенантрена штаммом водоросли Scenedesmus obliquus 90
ES-55
Ш.6.4.1. Разрушение фенантрена в среде ВВМ 90
Ш.6.4.2. Разрушение фенантрена в среде Kuhl 92
Ш.6.4.3. Идентификация метаболитов 93
Ш.7. Изучение устойчивости клеток водорослей к загрязнению среды 96
мазутом
Ш.8. Биоремедиация воды озера-коллектора селектированным альго- 100
бактериальным консорциумом
Ш. 8.1. Анализ бактериального ценоза озера 100
111.8.2. Резистентность водорослей к сточной воде, селекция штаммов 101
водорослей
111.8.3. Селекция бактериальных штаммов 103
Ш.8.4. Ремедиация сточной воды озера в пилотной установке 104
иммобилизованными юдорослями и алканотрофными бактериями
Заключение 108
Выводы 112
Список литературы 113
Приложение 126
Введение к работе
Антропогенное загрязнение окружающей среды нефтепродуктами, и, в частности, ароматическими углеводородами является важной экологической проблемой. Некоторые ароматические загрязнители обладают токсическими, мутагенными или канцерогенными свойствами. Поэтому способы удаления этих веществ из окружающей среды являются предметом изучения многих отраслей науки, и в первую очередь микробиологии.
Классические методы очистки вод и почв, такие как экстракция, растворителями, адсорбция и химическое окисление являются очень дорогими и при этом могут образоваться опасные продукты (Altow et al., 1984). Биологические методы очистки (биоремедиация) в этом отношении более предпочтительны (Lop and Tar, 2000; Alexander, 1994)
При биоремедиации техногенных экосистем используют, как правило, биопрепараты на основе бактерий, мицелиальных грибов и дрожжей, а также высшие растения. Водоросли и цианобактерии в очистке вод от ксенобиотиков, таких как нефть и ароматические углеводороды до настоящего времени не нашли применения. Такая недооценка их использования связана с тем, что разрушение ароматических соединений этими организмами практически не изучено и лишь ограничено отдельными исследованиями (Narro et al., 1992; Semple et al., 1994).
Известно, что системы, включающие несколько организмов, являются более предпочтительными в биоремедиационных процессах (Alexander, 1994). Изучению нефтеразрушающих микробных консорциумов бактерий и цианобактерии (Abed et al., 2002; Cohen, 2002; Al-Awadhi et al., 2003) в последнее время начали уделять большее внимание, в то время как консорциумы бактерий и водорослей остаются до сих пор почти не исследованными.
Биоремедиация загрязненных нефтью экосистем ассоциациями микроорганизмов - нефтедеструкторов и устойчивых к загрязнению водорослей и цианобактерии позволит интенсифицировать процесс очистки. Кроме того, если эти организмы будут сами способны к разрушению ксенобиотиков, то внесут дополнительный вклад в биоремедиацию техногенных экосистем.
Целью настоящей работы было изучение разрушения компонентов нефтяного загрязнения с участием водорослей и цианобактерии из созданной нами коллекции.
Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:
создание коллекции водорослей из обитателей нефтеразрушающих ценозов;
испытание устойчивости штаммов водорослей к ароматическим и поверхностно-активным веществам;
испытание устойчивости штаммов водорослей к нефти (мазуту) в аксеничных культурах и в смесях с бактериями;
изучение биодеградации фенола и фенантрена альго-бактериальными ассоциациями;
изучение биодеградации фенола и фенантрена штаммами водорослей и цианобактерий;
практическое применение селективно-отобранных альго-бактериальных консорциумов для очищения воды из озера-коллектора сточных вод.
