Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Географическая локализация и основные характеристики сфагновых болот 9
1.1. Распространение сфагновых болот в бореальной и тундровой климатических зонах 9
1.2. Условия формирования олиготрофных сфагновых болот и их физико- химические характеристики 10
1.3. Растительность сфагновых болот 14
1.4. Химический состав сфагновых мхов 16
1.4.1. Углеводы 16
1.4.2. Фенольные соединения 17
1.4.3. Липиды и жирные кислоты 18
1.4.4. Азотсодержащие вещества 18
1.4.5. Другие минеральные компоненты 20
1.5. Химический состав сосудистых растений сфагновых болот 20
Глава 2. Микробные сообщества сфагновых болот: состояние вопроса 21
2.1. Общие представления о микробных сообществах болотных экосистем 22
2.1.1. Численность, биомасса и разнообразие микроорганизмов в сфагновых болотах 23
2.1.1.1. Численность, биомасса и разнообразие грибов 23
2.1.1.2. Численность и разнообразие дрожжей в сфагновых болотах 26
2.1.1.3. Численность и разнообразие бактерий 27
2.1.1.4. Метаногенные архей в сфагновых болотах 33
2.1.1.5. Метанотрофные бактерии сфагновых болот 35
2.1.2. Азотофиксация в сфагновых болотах и азотфиксирующие бактерии 36
2.1.3. Оценка микробного разнообразия в сфагновых болотных экосистемах с применением молекулярных подходов 37
2.2. Микроорганизмы сфагновых болот, способные к деструкции природных полимерных соединений 40
2.2.1. Целлюлозолитические микроорганизмы в сфагновых болотах 41
2.2.2. Разложение ксилана и пектина в сфагновых болотах 43
Глава 3. Объекты и методы исследования 47
3.1. Объекты исследования 46
3.2. Анализ образцов с использованием метода FISH 47
3.3. Постановка экспериментов по инициации развития микробных сообществ, осуществляющих деградацию полимерных субстратов 50
3.4. Определение белка 51
3.5. Определение интенсивности дыхания 52
3.6. Получение чистых культур бактерий 52
3.7. Методы исследования морфологических, физиологических и хемотаксономических характеристик культур 53
3.8. Электронная микроскопия 54
3.9. Бактерии, использованные в качестве тест-культур 55
3.10. Фотодокументирование материалов и обработка данных 55
Заключение 118
Выводы 120
Литература 121
- Условия формирования олиготрофных сфагновых болот и их физико- химические характеристики
- Химический состав сосудистых растений сфагновых болот
- Численность и разнообразие бактерий
- Анализ образцов с использованием метода FISH
Введение к работе
Сфагновые болота являются одной из важнейших наземных экосистем бореальной и тундровой зон Северного полушария. На территории России болота занимают около 140 млн. га, причем наибольшие их площади сосредоточены в Западной Сибири (Вомперский и др., 1999). Торфяные болота являются крупнейшим депозитарием устойчивого органического углерода. Мировой пул углерода торфов составляет около 455 млрд. т (Gorham, 1991; Smith et al., 2004); не менее трети этого пула приходится на Россию (Вомперский и др., 1999). Накопление органического вещества в болотах вызвано низкой скоростью его разложения, что, в свою очередь, обусловлено кислой реакцией среды, аноксией, недостатком биогенных элементов, низкими температурами и наличием фенолсодержащих органических соединений, продуцируемых сфагновыми мхами (Заварзин, 2004).
Знания о микробных сообществах сфагновых болот ограничены. Важный вклад в их расширение внесли работы кафедры биологии почв факультета Почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова (Звягинцев и др., 1991; Добровольская и др., 1991; Добровольская и др., 2000; Головченко и др., 2002). В них было показано, что пул микроорганизмов в сфагновых болотах сравним с таковым в черноземных почвах, а численность бактерий в грамме торфа достигает 10 клеток. Однако культивировать на традиционно используемых в микробиологической практике средах удается не более 0.01% общего количества клеток, обнаруживаемых в торфе методом люминесцентной микроскопии (Добровольская и др., 1991), а доминантами среди культивируемых форм являются грамотрицательные микроаэрофильные бактерии (Головченко и др., 2002). Следующий этап изучения микроорганизмов северных болот был инициирован интересом к проблеме глобального изменения климата и роли болот в эмиссии метана в атмосферу. Как результат, были детально исследованы оказавшиеся своеобразными метанотрофные бактерии (Дедыш, 2005) и метаногенные археи этих кислых экосистем (Horn et al., 2003; Sizova et al., 2003; Kotsyurbenko et al., 2004; Brauer et al., 2006; Kotsyurbenko et al., 2007). Однако общее филогенетическое и функциональное разнообразие представителей домена Bacteria в сфагновых болотах до недавнего времени оставалось вне внимания микробиологов. Одним же из наименее изученных в составе микробного сообщества этих экосистем является блок, отвечающий за деструкцию органического вещества.
В большинстве экосистем деструкция природных полимеров осуществляется комплексом эукариотных и прокариотных микроорганизмов (Заварзин, 2004), причем в наземных экосистемах ведущая роль в этом процессе отводится грибам (Lynd et al., 2002;
Rice et al., 2006). Им же было посвящено основное внимание исследователей при изучении деструкции целлюлозы и гемицеллюлоз в сфагновых болотах (Низовцева и др., 1995; Семенов и др., 1995; Rice et al., 2006). Исследования показали, что мицелиальные грибы эффективно осуществляют деструкцию природных полимеров только при относительно низких величинах влажности и в условиях достаточного обеспечения кислородом и биогенными элементами, т.е. in situ их активность значительно подавлена. О природе бактерий, участвующих в процессах деструкции растительных остатков в сфагновых болотах, известно гораздо меньше. Оценка численности целлюлозолитических бактерий с использованием традиционных культуральных методов позволяла выявить не более 104 -105 клеток г'1 торфа (Waksman, 1929; Зименко, 1966; Загуральская, 1967; Наплекова, 1974; Добровольская и др., 2000). Ни для одного из полученных в этих исследованиях изолятов не была показана способность деградировать целлюлозу в кислых условиях среды. Таким образом, до сих пор остается неясным, какие группы бактерий участвуют в деструкции растительных полисахаридов в сфагновых болотах и какова их численность in situ.
Итак, бактерии - деструкторы растительных полисахаридов являются первичным звеном в цепи превращений органического углерода в сфагновых болотных экосистемах. Их первостепенная роль в цепи деструкции органического вещества и глобальность процессов аккумуляции органического углерода в сфагновых болотах послужили причиной выполнения данной работы.
Цели и задачи исследования.
Цель работы - определить структуру сообщества прокариотных организмов кислых сфагновых болот и выявить бактерии, осуществляющие процессы деструкции полимерных соединений углерода в этих экосистемах.
Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:
Оценить общее филогенетическое разнообразие и численность отдельных групп домена Bacteria в сфагновых болотах.
Оценить метаболическую активность и исследовать состав бактериальных сообществ, осуществляющих деструкцию целлюлозы и водорастворимых полисахаридов при низких значениях рН.
Выделить чистые культуры бактерий, способных осуществлять разложение природных полисахаридов, исследовать особенности их физиологии, установить их филогенетическую принадлежность и таксономический статус.
Научная новизна и значимость работы.
Впервые с применением метода FISH (fluorescent in situ hybridization) произведена оценка численности метаболически активных представителей отдельных филогенетических групп микроорганизмов, населяющих сфагновые болота.
Определен состав прокариотного комплекса, осуществляющего процессы деструкции растительных и микробных биополимеров в кислой среде при низких температурах. Впервые с использованием методов молекулярной диагностики микроорганизмов in situ выявлена специфика сообществ, деградирующих целлюлозу в олиготрофных сфагновых болотах и их принципиальное отличие от таковых в эвтрофных местообитаниях.
Описан и узаконен новый род бактерий семейства Sphingobacteriaceae -Mucilaginibacter gen. nov., включающий 2 новых вида - Mucilaginibacter paludis sp. nov. и Mucilaginibacter gracilis sp. nov. Бактерии этого рода способны деградировать пектин, ксилан, микробные полисахариды, ламинарии. Типовые штаммы новых видов депонированы в международных коллекциях микроорганизмов АТСС, DSMZ и ВКМ.
Проведено уточнение таксономического описания вида Chitinophaga arvensicola, в которое включена способность к росту и деградации ряда полисахаридов в диапазоне рН 4.5-5.5.
Выявлены аэробные бактерии филогенетической группы Actinobacteria, способные деградировать целлюлозу в диапазоне рН 4-6 и температуре 10-25С.
Практическая значимость.
Оптимизирована методика FISH для исследования микробных сообществ торфяно-болотных почв.
Создана коллекция бактерий - представителей различных филогенетических групп, способных деградировать целлюлозу, пектин, ксилан, ламинарии, крахмал, бактериальные экзополисахариды, пуллулан, фукоидан, хондроитин при низких значениях рН (3-5.5) и низких положительных температурах (0-15С).
Получены культуры бактерий - продуцентов экзополисахаридов, перспективных для медицинской и инженерной биотехнологии.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на российских конференциях:
«Болота и биосфера», 3 научная школа. 13-16 сентября 2004 г., г. Томск.
«Экологическое состояние континентальных водоемов арктической зоны в связи с промышленным освоением северных территорий», 21-25 июня 2005 г., г. Архангельск.
3. «Актуальные аспекты современной микробиологии», Всероссийская Молодежная школа-конференция, 1 -3 ноября 2005 г., г. Москва.
Публикации.
Материалы диссертации содержатся в 12 печатных работах: 8 экспериментальных статьях, 1 материалах конференции и 3 тезисах.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 137 страницах, включая 17 таблиц, 34 рисунков и списка литературы из 215 наименований, из них 61 на русском, 1 на немецком и 153 на английском языке.
Место проведения работы и благодарности.
Работа выполнена в отделе микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН с 2003 по 2006 годы под руководством д.б.н. С.Н. Дедыш, при финансировании в рамках программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», гранта РФФИ-НИИО 04-04-04000 и проекта ФЦНТП «Ведущие научные школы» №РИ-112/001/027.
Образцы торфа болот различного географического расположения были предоставлены автору к.б.н. Ю.Ю. Берестовской, к.б.н. И.С. Куличевской, к.б.н. А.В. Поляковой (ИНМИ РАН), сотрудницей Самарского государственного университета Т.А. Трофимовой, также получены самим автором.
Исследования с использованием метода FISH выполнены автором. Исследования ультратонкого строения клеток описываемых в работе бактерий были проведены совместно с к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН, г. Пущино) и к.б.н. Н.А. Кострикиной (ИНМИ РАН). Молекулярный анализ и определение филогенетического положения изолятов проводились д.б.н. С.Н. Дедыш в Макс-Планк-Институте микробиологии суши (Марбург, Германия). Анализ хинонов изолятов бактерий был проведен к.х.н. Б.П. Баскуновым (ИБФМ РАН, г. Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены к.б.н. A.M. Лысенко (ИНМИ РАН). Часть физиологических, биохимических описаний изолятов, а также исследований с использованием метода FISH проведены автором при участии к.б.н. С.Э. Беловой (ИНМИ РАН).
Автор выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы, а также искреннюю признательность д.б.н. С.Н. Дедыш и акад. Г.А. Заварзину за практическую помощь, постоянное внимание и ценные советы на всех этапах ее выполнения.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Условия формирования олиготрофных сфагновых болот и их физико- химические характеристики
Главным физико-географическим фактором образования болот является равнинный характер рельефа в сочетании с наличием ландшафтных депрессий (понижений). Их возникновение связано с особенностями тектонических процессов в земной коре. Потепление климата в начале второго тысячелетия нашей эры привело к развитию термокарстовых процессов и, как следствие, образованию различных форм термокарста: плоско-западинного, полигонально-западинного, полигонально-сетчатого и других видов. Эти процессы универсальны для всей бореальной зоны земного шара и приводят к появлению рельефных депрессий как на территории Евразии, так и в Северной Америке.
Главным климатическим фактором, определяющим формирование болот, является соотношение элементов водного баланса: осадков и испарения. Отрицательный баланс приводит к увеличению запасов почвенной влаги. Так, например, при ежегодном выпадении 500 мм осадков в год в таежной зоне бореального умеренно-холодного климатического пояса, величина испарения колеблется в пределах 300-360 мм. Большая теплоемкость воды и низкая температура болот в течение года приводят к конденсации влаги из воздуха. Факторами, ограничивающими испарение, являются сравнительно малый дефицит влажности, более низкие температуры воздуха и заболоченных почв, а также большая влагоёмкость мохового покрова.
Процесс заболачивания обусловлен также химическим составом воды, поступающей с атмосферными осадками и грунтовыми водами. Низкий минеральный фон в болотных экосистемах формируется эволюционно. Сначала, требовательные к высоким концентрациям макроэлементов растения «перекачивают» биогенные элементы из минерального горизонта в формирующийся органогенный профиль. Происходит сукцессия растительных ассоциаций от эвтрофных видов к олиготрофным (Бахнов, 1986). Доминирование олиготрофных видов начинается при уровне минерализации порядка 0.5-0.05 г-л 1 солей и электропроводности воды от 90 uS-cm 1 и ниже. Дальнейшее пополнение торфяной толщи биогенными элементами происходит главным образом экзогенно - с аэрозолями из воздуха и посредством фиксации атмосферного азота прокариотными организмами. В сформировавшихся сфагновых болотах рецикл биогенных элементов (азота, калия, фосфора) ограничен, а рецикл углерода практически полностью отсутствует.
Химический состав болотных вод зависит от генезиса болот и определяется характером подстилающих пород и их подвижностью. Важным компонентом минерального баланса олиготрофных болот является также величина притока микроэлементов с атмосферными осадками. Средние величины концентраций микроэлементов, привносимых с атмосферными осадками, крайне низки и составляют около 0.02 мг/л кальция, магния, калия, и 0.12-0.4 мг/л натрия, хлора и сульфата. Данные значения характеризуют химический состав континентальных осадков. С другой стороны, концентрации отдельных элементов в атмосферных осадках, формирующихся над океаном, могут существенно возрастать. Так, например, на территории Великобритании, они увеличиваются почти на порядок. По данным Proctor и Maltby (1998), максимальная величина накопления натрия, хлора и сульфата в осадках может достигать 8.8,18.5 и 48.2 мг/л, соответственно. Такой состав выпадающих осадков может менять сложившееся соотношение микро- и макроэлементов в болотных экосистемах, а также влиять на механизмы закислення олиготрофных сфагновых болот. Помимо этого, в тех болотных системах, где присутствует значительный приток сульфатов, возможно существование комплекса сульфатредуцирующих бактерий. Особенно актуально это для болот, расположенных вблизи промышленных центров и крупных городов.
Иначе влияют на минерализацию болотных вод грунтовые воды. Концентрация основных ионов в грунтовых водах сильно зависит от типа подстилающей породы, состава осадочных пород. Наименьшие величины общей минерализации при этом могут колебаться в пределах 100-140 мг/л. В итоге, минерализация болотных вод определяется подвижностью пластовых и грунтовых вод и степенью насыщения ими торфяной залежи, а также величиной экзогенного поступления. Диапазоны концентраций ряда ключевых катионов и анионов болотных вод четырех регионов Земного шара представлены в Таблице 1. Данные Таблицы 1 позволяют сделать вывод о том, что на территории Западной Сибири болотные воды богаче по составу минеральных веществ, чем болота Канады, США и Японии. Известно также, что на территории России минерализация западносибирских болот выше, чем европейских. Несмотря на разницу в величинах минерализации, концентрация микроэлементов и основных биогенных элементов в олиготрофных болотах в несколько раз ниже, чем в водах низовых болот (Vitt, Chee, 1990) или в автоморфных почвах.
Еще одним условием, а также следствием формирования верховых болот является состав их растительности. Для болот переходного и олиготрофного типа характерно доминирование в составе растительности мхов рода Sphagnum, которые определяют особый гидрохимический, биохимический и экологический режимы описываемых экосистем. Основные свойства олиготрофных сфагновых болот - низкие величины рН, замедленное разложение органики и образование фульватных темноокрашенных вод -связывают с особенностями химического состава и микробной деградации сфагновых мхов (Clymo, 1964; Kilham, 1982)
Механизмы закислення болотных вод детально расшифрованы Clymo (1967). Им было показано, что большинство уроновых кислот, содержащихся в гиалиновых клетках сфагновых мхов, существуют в свободной кислотной форме -СООН. При уменьшении или увеличении уровня болотных вод водород (катион Н+) из карбоксильной группы полиуроновой кислоты переходит в воду, замещаясь катионами щелочных металлов Ca2+, Mg2+, Na+ и K+ (рис. 1). При переходе в раствор иона водорода величина рН болотной воды понижается. Было показано, что скорости роста сфагнума соответствуют поддержанию рН на уровне 4.0 и хорошо объясняются механизмом ионного обмена (Clymo, 1964). Это утверждение связано с динамикой микробной деструкции уроновых полисахаридов гиалиновых клеток сфагнов в течение вегетационного периода. Очевидно, что в этом случае микробная деструкция полиуроновых кислот, входящих в состав сфагновых мхов, является еще одним механизмом поддержания уровня рН, характерного для олиготрофных болот.
Химический состав сосудистых растений сфагновых болот
В отличие от сфагновых мхов, высшие споровые и цветковые растения обладают сложной структурой тканей, в которые входит большое количество соединений различных классов. Главным отличием тканей высших растений от тканей мхов является присутствие лигнина, а также большого количества растворимых полисахаридов. В их число входят как пектины и ксиланы, так и крахмал, а также сахара и полиспирты (инулин, арабит и т.д.). Ткани сосудистых растений включают широкий круг разнообразных ароматических соединений, флавонов и флавоноидов.
Соотношение компонентов внутри клетки, клеточной стенки, вторичных структур сосудистых растений сильно варьирует в зависимости от их таксономического и филогенетического положения. Среди высших растений в сфагновых болотах доминируют растения семейства осоковых (Сурегасеае) и вересковых (Vacciniaceae). Первое семейство представлено только травянистыми формами, а второе - только полукустарниками и кустарниками с одревесневшими стволами и побегами. В структуре растительного покрова олиготрофных сфагновых болот эти растения составляют по проективному покрытию от 5 до 45%, а в составе торфа залежи по массе до 15% (Лисе и Березина, 1981). После отмирания, входящие в состав их тканей лигнин, крахмал, органические кислоты, ксилан и белки вовлекаются в микробную деградацию. Кроме того, важной функцией сосудистых растений является образование микоризы и обогащенной гетеротрофной микрофлорой прикорневой зоны этих растений. Немаловажной является роль высших растений в формировании физического каркаса торфяной залежи, который обусловливает ее относительную неподвижность и ригидность.
Изучение микробных сообществ сфагновых болот началось в 20-30-е годы XX века. Одним из первых микробиологов, кто обратил внимание на сфагновые болота, был Waksman. В 1929 году выходит его совместная статья с Stevens, в которой авторы указывают на роль микроорганизмов в формировании торфа (Waksman, Stevens, 1929). Два года спустя Waksman и Purvis (Waksman, Purvis, 1932) обращают внимание на микробные сообщества сфагновых болот и дают одними из первых задел для микробной экологии сфагновых болот. В России первыми исследователями микробиологии торфа были Д.А. Бегак, Н.М. Беликова, О.П. Максимова и И.С. Холкин (Бегак, 1926; Беликова, 1929; Максимова, 1934; Холкин, 1928).
Основными аспектами изучения микробного населения торфа были следующие: первый - генезис торфа и бурых каменных углей, второй - сельскохозяйственное освоение болотных угодий, мелиорация. Первый аспект ставил во главу исследования целлюлозолитическую активность микроорганизмов торфа и вопросы, связанные с деградацией гуминовых веществ. Второй аспект инициировал как исследования целлюлозолитическои актиности, так и изучение влияния различных агрохимических приёмов на микрофлору болот, а также исследования азотофиксации и аммонификации. Основная ценность этих ранних работ состоит в их концептуальной направленности на изучение функциональной роли микроорганизмов в болотах, тогда как их значение для оценки микробного разнообразия в этих экосистемах невелико в силу отсутствия в то время детальной таксономической классификации бактерий и грибов.
Сфагновые болота относятся к типу гидроморфных почв, сочетают в себе черты пресноводных водоемов и автоморфных почв и по этой причине могут характеризоваться как «амфибиальные ландшафты» (Заварзин, 2004). Это системы с высокой степенью обводнённости и выраженной стратификацией, делающей их сходными с цианобактериальными матами.
Низкая скорость разложения растительных остатков в сфагновых болотах приводит к накоплению большой массы полуразложившегося растительного материала с невысоким уровнем зольности. Это обусловливает существование болотных микроорганизмов в условиях избытка воды, органического субстрата и дефицита биогенных элементов. Стратификация торфяной залежи приводит к формированию спектра зон с различными значениями окислительно-восстановительного потенциала, концентрации растворимых газов, температуры и величины рН. По этой причине микробные сообщества сфагновых болот должны быть представлены большим разнообразием функциональных групп с характерными стратегиями существования: от облигатных аэробов до облигатных анаэробов, от мезофиллов до облигатных психрофилов, от ацидотолерантных нейтрофилов до облигатных ацидофилов и т. д. Это противоречит правилу Тинеманна для экстремальных экосистем, в соответствии с которым таксономическое разнообразие в болотах должно быть небольшим. Несоответствие этому правилу было ранее показано и для алкалофильных микробных сообществ (Zavarzin, Zhilina, 2000).
Наличие нерастворимых и водорастворимых углеводов в составе отмершей растительной массы предполагает возможность существования целого спектра аэробных и анаэробных путей первичной и вторичной деградации органического вещества и присутствия большого разнообразия микроорганизмов-гидролитиков, а также представителей микрофлоры рассеяния (диссипотрофов) и, вероятно, синтрофных микроорганизмов.
Необходимо отметить, что помимо главных продуцентов биомассы в болотах -растений - существует и второй блок первичных продуцентов - одноклеточных и многоклеточных водорослей и цианобактерий. В сравнении с биомассой растений, биомасса водорослей незначительна, однако, при отмирании они поставляют легко гидролизуемые полимеры - альгинаты, фукоиданы, ламинарины и способны поддерживать высокую скорость оборота органики, обеспечивая быстрый и локальный рецикл органического углерода в водных экосистемах. Численность отдельных групп микроводорослей в болотах, например, диатомовых, может достигать порядков 10 -105 клеток в 1 грамме сырого торфа (Cochran-Stafira, Andersen, 1984). Главным ограничением распространения водорослей в болотах является их зависимость от света в диапазоне 500-700 нм и воздушной концентрации кислорода, что обусловливает приуроченность к верхним слоям (0-20 см) торфяной залежи.
Численность и разнообразие бактерий
В ранний период изучения микрофлоры сфагновых болот оптимальным методом анализа бактериальных сообществ считался метод высева на дифференцирующие среды. Сапротрофные бактерии учитывали на мясо-пептонном агаре, аммонификаторов на крахмало-аммиачном, олиготрофов на голодном агаре или с добавлением почвенного экстракта, целлюлозолитиков - на среде Гетчинсона. Результатом таких исследований было определение численности различных физиологических и таксономических групп. Так, исследуя микрофлору почв Западной Сибири, Загуральская (1967) разделяет выделенные бактерии на ряд групп: спорообразующие, целлюлозоразрушающие, бациллы, жёлтопигментные, флуоресцирующие, актиномицеты, олигонитрофилы, миксобактерии. Такой подход позволяет оценивать как долю отдельных физиологических групп бактерий в составе культивируемого компонента микробных комплексов болотных почв, так и соотношение отдельных морфотипов. Однако, если при оценке вклада отдельных функциональных групп целесообразно использование дифференцирующих сред, то систематизировать таксономическое разнообразие бактерий таким способом невозможно.
За рубежом ранние исследования разнообразия микроорганизмов в торфяниках и болотных почвах проводились Waksraan et al. (1932), Boswell и Sheldon (1950), Кох (1954). Однако главным объектом этих работ были грибы, а при оценке разнообразия бактерий учитывался лишь функциональный аспект. Такой же подход был использован в 80-е годы Уильяме с соавторами (Williams et al., 1983), что позволило установить способность микробных сообществ верховых сфагновых болот к утилизации широкого спектра субстратов от глюкозы до метоксисалициловой кислоты и парафина.
Оценка численности бактерий методом посева имеет как недостатки, так и достоинства. Ещё в 1946 году Boswell и Gover показали, что отдельные колонии, выросшие на агаровых пластинках, не являются продуктом единичных клеток. Следовательно, при использовании метода посева происходит занижение истинной численности микроорганизмов, способных к росту на данных средах. Второй проблемой данного метода является разнообразие субстратных приоритетов. Универсальных сред, при использовании которых можно учесть весь трофический диапазон бактерий, не существует. Таким образом, при использовании для выделения и количественного учёта бактерий селективных питательных сред нет гарантии, что они позволят выделить узкий спектр организмов, не способных расти на других средах. Несмотря на перечисленные недостатки, способ учёта бактерий на селективных средах позволял выявлять ряд функциональных групп прокариотных организмов и определять их численность.
По различным оценкам, общая численность бактерий в болотах, выявляемая методом учёта на питательных средах, варьирует от 1 х106 до 5 108 КОЕ в 1 г торфа (Зименко, 1966; Загуральская, 1967; Головченко и др., 1993; Гродницкая и Сорокин, 2004; Головченко и др., 2005). Такой широкий диапазон значений объясняется как выбором объектов исследования (верховые, переходные и низинные болота), так и применением различающихся по составу компонентов питательных сред, а также способами пересчета (на объем или грамм сухого торфа). Несмотря на такие отличия, во всех исследованиях улавливается тенденция к снижению численности бактерий в олиготрофных болотах по сравнению с низинными. При изучении распределения бактерий по профилю торфяной залежи вплоть до подстилающих пород было показано, что их численность по данным метода посева остаётся постоянной, за исключением верхних слоев, где деструкция отмирающего растительного материала приводит к увеличению числа активных бактерий. Применение богатых органических сред позволило установить, что во всех типах сфагновых болот доминируют гетеротрофные бактерии. Численность бактерий сапротрофного комплекса варьирует в пределах от 180 до 3000 тыс. КОЕ в 1 г почвы в слое 0-10 см и от 60 до 70 тыс. КОЕ в слое 10-20 см (Загуральская, 1967; Зименко 1966). Однако, богатые среды могут лимитировать рост ряда олиготрофных бактерий, вызывая эффект так называемой «смерти, ускоренной субстратом» (Паников, 1989). Кроме того, использование богатых органических сред не позволяет выявить целый ряд бактерий гидролитического ряда и хемолитотрофных организмов.
В составе микробных сообществ сфагновых болот при использовании традиционных питательных сред легко выявляются бациллы - грамположительные, эндоспорообразующие бактерии. Их численность в верховых болотах оценивалась Загуральской (1967) в 9-268 тыс. КОЕ в 1 г торфа, Зименко (1966) - в 93-218 тыс. КОЕ. Численность бацилл в верховом торфе Васюганского болота (Томская обл.) оценивалась Головченко и соавторами (2005) в 0.1-10 млн. КОЕ в 1 г торфа, а в верховом торфе болот Тверской области эти организмы составляли от 5 до 30% клеток обнаруженных посевом бактерий (Головченко и др., 1993). По данным Добровольской (Добровольская и др., 2000; Добровольская, 2002), бациллы являются основным компонентом гидролитического комплекса бактерий в торфяных почвах переходного типа; их численность достигает значении 10J-10J КОЕ в 1 г почвы. Таким образом, диапазон численности бацилл в олиготрофных торфяниках по данным ряда исследователей составляет 103-107 КОЕ в 1 г торфа. Необходимо заметить, что в процитированной работе численность бактерий гидролитического блока оценивалась с применением метода реплик, который часто приводит к завышению численности. При оценке относительного обилия разных групп бактерий в верховом торфянике Западно-Двинского стационара оказывается, что минимальная величина этого показателя свойственна бактериям групп «бациллы» и «стрептомицеты» (Добровольская, 2002).
Оценка разнообразия и численности отдельных групп неспорообразующих грамотрицательных бактерий и актиномицетов в сфагновых болотах проводилась и российскими, и зарубежными исследователями (Жданникова, 1963; Зименко, 1966; Загуральская, 1967; Гантимурова, 1970; Christensen, Cook, 1970; Ishizawa, Araragi, 1970; Наплёкова, 1974; Given and Dickinson, 1975; Зименко, 1983; Williams and Crawford, 1983; Головченко и др., 1993; Добровольская и др., 2000; Добровольская, 2002; Гродницкая и Сорокин, 2004; Головченко и др., 2005). Как в исследованиях раннего периода, так и в более поздних работах было показано, что большую часть в сообществах прокариотных организмов олиготрофных сфагновых болот составляют грамотрицательные олигонитрофилы и грамположительные актиномицеты и бациллы. Исследования Загуральской, Жданниковой, Гантимуровой, Зименко показали, что основными группами неспорообразующих гетеротрофов в сфагновых болотах являются так называемые флуоресцирующие и пигментные бактерии. Такая односторонняя фенотипическая характеристика не позволяла сколько-нибудь точно характеризовать бактериальный комплекс. Многие бактерии способны образовывать пигменты как облигатно, так и факультативно, а наличие такого признака, как флуоресценция, вообще не даёт никакой информации о выделяемых организмах.
Christensen и Cook (1976) определили в сфагновом торфе наличие бактерий рода Mycobacterium, a Given и Dickinson (1975) - бактерий родов Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter, Cytophaga, Micrococcus, Chromobacterium, Clostridium, Streptomyces и Actinomyces. Ishizawa и Araragi (1970) идентифицировали в составе бактериальных сообществ сфагнового торфа представителей родов Micromonospora и Nocardia. Из уже перечисленных родов половину составляют представители грамположительных бактерий (по современной классификации Actinobacteria). Наличие актиномицетов в низинных торфяниках было показано Зеновой и соавторами (1991). В частности, в наиболее близкой к олиготрофным сфагновым болотам целинной низинной торфяной почве доминировали бактерии рода Streptomyces и Micromonospora.
Анализ образцов с использованием метода FISH
Исследовательская стратегия этой серии модельных экспериментов сводилась к следующему. Использование искусственных лабораторных сред для получения накопительных культур микроорганизмов, осуществляющих тот или иной процесс, страдает неполнотой воспроизведения условий реального местообитания и приводит к искажению состава формирующихся сообществ. Во избежание этого, изучение состава микробных сообществ, ответственных за деструкцию различных полимеров в кислых болотах, проводили путем селективной инициации их развития путем внесения определенного субстрата непосредственно в образцы торфяной суспензии, полученной путем экстракции из нативных образцов торфа. Последняя процедура была необходима для освобождения образцов от неразложившегося растительного материала, представляющего конкурентный субстрат для развития гидролитических бактерий. Процедура получения торфяной суспензии состояла в обработке образца торфа в гомогенизаторе, отжатии из него торфяной суспензии и фильтрации последней через стерильную стекловату для удаления грубых торфяных частиц. Полученную торфяную суспензию разливали по 10 мл в стерильные флаконы объемом 50 мл.
Ксиланолитические и пектинолитические сообщества получали путем внесения в полученную торфяную суспензию сухого берёзового ксилана, яблочного пектина (Fluka) или распущенной на волокна целлюлозы (2 г/л суспензии), соответственно. Инкубацию пектинолитического и ксиланолитического микробных сообществ проводили в аэробных условиях в течение 40 суток при 10С во флаконах объемом 50 мл, закрытых воздухопроницаемой плёнкой Parafilm "М" (Chicago, USA) для предотвращения испарения влаги. Мониторинг интенсивности процесса деструкции проводили с помощью измерения скорости образования СОг. Для этого, 1 раз в 3-5 дней флаконы плотно закрывали резиновыми пробками, измеряли концентрацию СОг, оставляли на сутки при соответствующей температуре (10С), после чего производили повторное определение концентрации и по разнице рассчитывали интенсивность дыхания на единицу объема суспензии в единицу времени.
Целлюлозолитические сообщества получали внесением целлюлозы в виде волокон фильтровальной бумаги в торфяную суспензию (2 г/л). Торфяные суспензии разливали во флаконы объёмом 50 мл. Объём суспензий был 10 мл, а высота столбика 1.5 см при площади поверхности -12 см2, что позволяло поддерживать аэробные условия в инкубационных флаконах. Для подавления развития мицелиальных грибов в одну серию флаконов вносили циклогексимид (30 мг/л) (Мамилов и др., 2000). С целью выяснения возможности стимуляции микробных сообществ внесением доступного N и Р в ряд флаконов с циклогексимидом и без него добавляли также (NtL SC и КН2РО4 (30 мг каждой соли на 1 литр). Сообщества инкубировали при 10 и 20С. Фиксацию образцов накопительных культур проводили смешиванием 500 мкл образца с 500 мкл абсолютного этанола. До анализа фиксированные препараты хранили при -20С.
Определение концентрации белка в образцах проводили с использованием метода Лоури (Stoschek, 1990; Gerhardt, 1981). Калибровочную кривую строили, используя лиофилизованного альбумина (Reanal, Будапешт). Измерение оптической плотности окрашенных растворов белка проводили на спектрофотометре Eppendorf Biophotometer AG при длине волны 595 нм. Пересчет концентрации белка проводили в соответствии с калибровочным графиком (Рис. 5).
Концентрацию углекислого газа в экспериментальных флаконах с торфом, а также чистыми и накопительными культурами определяли с использованием инфракрасного датчика Infralit 4 (Junikator DESSAU, Германия). Для определения концентрации СОг в воздушной фазе герметично закрытого флакона из него отбирали 0.5 мл газа хроматографическим шприцем объемом 500 микролитров (VWFTGI, Германия). Пробу закалывали в пробоотборник. Величину пика образца сравнивали с величиной пика стандарта (0.1 мл 100% СО2). Через сутки инкубации в соответствующих условиях процедуру повторяли. Скорость образования СОг (интенсивность дыхания) выражали в мкг С-СОг, пересчитывая на объем пробы. В случае с чистыми культурами интенсивность дыхания определяли по накоплению СОг в воздушной фазе флакона Получение.
Для посевов из торфяных образцов и сообществ были использованы среды, содержащие в качестве источников углерода торфяной экстракт, глюкозу, целлюлозу, ксилан (0.02 - 0.2%), а в качестве минеральной основы разбавленную среду ST5 (1:5 -ST5/5) (Reichenbach, 1991). В ряде случаев использовались также комплексные питательные среды R2A и NutrientAgar (Difco), разбавленные в 10-100 раз дистиллированной водой. В качестве гелеобразующих компонентов использовали агар-агар (15 г/л) и полисахарид микробного происхождения Gellan-Gum (Fluka) (10 г/л, MgSO rbO - 800 мг/л). Для определения филогенетической принадлежности и контроля чистоты изолятов использовали метод экспресс-гибридизации отобранных из колоний клеток с группо-специфичными олигонуклеотидными зондами.
Чистые культуры бактерий получали методом рассева на плотные питательные среды. Для получения чистых культур представителей родов Burkholderia и Chitinophaga в качестве минеральной основы использовали среду ST5/5, а источника углерода -целлобиозу, глюкозу, пептон и крахмал (500 мг/л). Для получения чистых культур бактерий рода Mucilaginibacter была использована минеральная основа следующего состава (среда МВ1): дрожжевой экстракт - 0.1 г/л, СаС1г-2НгО - 0.02 мг/л, MgS04-5H20 -0.04 мг/л, раствор микроэлементов SL6 (Pfenning, 1969) - 1 мл/л. Источники углерода и энергии, - глюкоза или фруктоза, - 500 мг/л.
Для проверки культур на способность к деструкции полисахаридов (за исключением целлюлозы) во всех случаях была использована среда следующего состава: дрожжевой экстракт - 0.1 г/л, СаС12-2Н20 - 0.02 мг/л, MgS04-5H20 - 0.04 мг/л, раствор микроэлементов SL6 - 1 мл/л. Концентрация полисахаридов была от 200 до 2000 мг/л. Культуры бактерий, способных к деструкции целлюлозы, получали высевом на целлюлозные среды следующего состава: микрокристаллическая целлюлоза (Aldrich, Германия) 2 г/л, дрожжевой экстракт - 0.1 г/л, СаСЬ НгО - 0.02 мг/л, MgSCVSIbO -0.04 мг/л, раствор витаминов - 10 мл/л (витамин В12 - 0.1 мг, биотин - 2.0 мг, тиамин-HCI-2H20 - 5.0 мг/л, Са-пантотенат - 5 мг/л, фолиевая кислота - 2 мг/л, рибофлавин - 5 мг/л, никотинамид - 5 мг, дистиллированная вода -1 литр).
Проверка на способность к гидролизу целлюлозы чистыми культурами проводилась двумя способами. Качественно - по появлению зон просветления вокруг колоний на целлюлозном агаре. Количественно - в жидких культурах при использовании сред идентичного состава, по интенсивности дыхания, сравнивая с контрольным вариантом, не содержащим микрокристаллическую целлюлозу.
