Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 21
1.1 Альтернативная энергетика. Преобразование энергии биомассы в биотопливо 21
1.2 Анаэробная конверсия органических отходов сельского хозяйства и пищевой промышленности
1.2.1 Производство биогаза, общие характеристики 23
1.2.2 Микробный процесс образования биогаза 26
1.2.3 Современные методы оценки биологического разнообразия сообществ микроорганизмов 35
1.2.4 Технологические параметры анаэробного процесса деструкции биомассы
.2.4.1 Время удерживания субстрата 41
1.2.4.2 Температурный режим анаэробной конверсии биомассы 42
1.2.4.3 pН и щелочность как параметры анаэробной деструкции биомассы 44
1.2.4.4 Соотношение углерода и азота 47
1.2.4.5 Перемешивание 47
1.2.4.6 Соединения, ингибирующие процесс анаэробной конверсии биомассы 49 1.2.4.7. Факторы нестабильного анаэробного процесса 1.2.5 Газовые эмиссии 55
1.2.6 Типы биогазовых реакторов 55
1.2.7 Использование биогаза 58
1.3 Биотрансформация нитроароматических соединений 60
1.3.1 Нитроароматические соединения, производство, распространение
в окружающей среде 60
1.3.2 Метаболизм нитроароматических соединений в анаэробных условиях 64
1.3.3 Метаболизм нитроароматических соединений в аэробных условиях 68
Экспериментальные исследования 78
ГЛАВА 2. Материалы и методы 78
2.1 Анаэробная деструкция сельскохозяйственных отходов в лабораторных биогазовых установках 78
2.2 Анаэробная деструкция отходов спиртового производства в лабораторных биогазовых установках
2.2.1 Влияние дополнительно внесенного источника ионов Fe3+ на анаэробный процесс 79
2.2.2 Влияние снижения времени пребывания субстрата в реакторах на анаэробный процесс
2.3 Анаэробная конверсия отходов сельского хозяйства в опытно-промышленном биогазовом реакторе 81
2.4 Биотрансформация отходов предприятий, производящих взрывчатую продукцию
2.4.1 Метаболизм нитроароматических соединений в анаэробных условиях 82
2.4.2 Метаболизм нитроароматических соединений в аэробных условиях с последующей обработкой в анаэробных условиях 2.4.2.1 Источники и условия выделения аэробных микроорганизмов, способных осуществлять деструкцию ТНТ 82
2.4.2.2 Культивирование выделенных штаммов микроэукариот в отсутствие и в присутствии ТНТ 2.5 Измерение содержания сухого и сухого органического вещества 85
2.6 Измерение продукции и состава биогаза 85
2.7 Измерение общей концентрации органических кислот 86
2.8 Спектрофотометрические измерения 86 2.9 Газовая хроматография 86
2.10 Высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия 87
2.11 Ионная хроматография
2.11.1 Определение нитрит-иона и нитрат-иона 88
2.11.2 Определение органических кислот
2.12 Электронная парамагнитная резонансная спектроскопия 89
2.13 Выделение и очистка тотальной ДНК и РНК 89
2.14 Получение комплементарной ДНК 90
2.15 Амплификация генов 16S рРНК, hydA и mcrA 2.15.1 Амплификация гена 16S рРНК бактерий 90
2.15.2 Амплификация гена 16S рРНК архей 91
2.15.3 Амплификация гена hydA 91
2.15.4 Амплификация гена mcrA 92
2.15.5 Амплификация клонированных генов 2.16 Электрофорез в агарозном геле 93
2.17 Очистка амплифицированных генов 16S рРНК, hydA и mcrA 94
2.18 Клонирование генов 16S рРНК, hydA и mcrA 95
2.19 Рестрикционный анализ амплифицированной ДНК 96
2.20 Секвенирование фрагментов генов 16S рРНК, hydA и mcrA 96
2.21 T-RFLP анализ 98
2.22 Пиросеквенирование 101
Результаты исследований и их обсуждение 103
ГЛАВА 3. Анаэробная конверсия отходов сельского хозяйства в лабораторных биогазовых установках
3.1 Основные параметры работы биогазовых реакторов 103
3.2 Структура бактериального сообщества 110
3.3 Структура и динамика развития архейного сообщества 127
3.4 Структура и динамика развития метаногенного сообщества 138
3.5 Корреляция параметров анаэробного процесса со структурой микробного сообщества
ГЛАВА 4. Анаэробная деструкция органических отходов спиртового производства в лабораторных биогазовых установках 152
4.1 Влияние дополнительно внесенного источника ионов Fe3+ на
анаэробный процесс 152
4.1.1 Основные параметры работы биогазовых реакторов 152
4.1.2 Структура бактериального сообщества 156
4.1.3 Структура архейного сообщества 160
4.1.4 Корреляция параметров анаэробного процесса со структурой микробного сообщества 166
4.2 Влияние снижения времени удерживания субстрата в реакторах на анаэробный процесс 175
4.2.1 Основные параметры работы анаэробных реакторов 175
4.2.2 Структура и динамика развития водород-продуцирующего бактериального сообщества 182
4.2.3 Структура и динамика развития архейного сообщества 191
4.2.4 Структура и динамика развития метаногенного сообщества 197
4.2.5 Корреляция параметров анаэробного процесса со структурой микробного сообщества 204
ГЛАВА 5. Анаэробная конверсия сельско хозяйственных отходов в опытно-промышленном биогазовом реакторе 206
5.1 Основные параметры работы анаэробного реактора 206
5.2 Состав бактериального сообщества в реакторе 206
5.3 Состав метаногенного сообщества в реакторе 210
5.4 Корреляция параметров анаэробного процесса со структурой микробного сообщества 213
ГЛАВА 6. Биотрансформация отходов предприятий, производящих взрывчатую продукцию 218
6.1 Метаболизм нитроароматических соединений в анаэробных условиях 218
6.2 Метаболизм нитроароматических соединений в аэробных условиях с их последующей обработкой в анаэробных условиях 2 6.2.1 Выделение и идентификация аэробных микроорганизмов, способных осуществлять деструкцию ТНТ 222
6.2.2 Культивирование штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 в отсутствие и в присутствии ТНТ 2 6.2.2.1 Трансформация ТНТ в аэробных условиях роста 224
6.2.2.2 Трансформация ТНТ в статических и анаэробных условиях роста 2 6.2.3 Культивирование штамма Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 в отсутствие и в присутствии ТНТ 234
6.2.4 Окисление экзогенного NO2– в присутствии дрожжевых клеток Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 и Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 235
6.2.5 Последующая обработка трансформированных соединений в анаэробных условиях 240
6.3 Корреляция параметров 243
Заключение 251
Список сокращений и условных обозначений 256
Список литературы
- Современные методы оценки биологического разнообразия сообществ микроорганизмов
- Анаэробная деструкция отходов спиртового производства в лабораторных биогазовых установках
- Структура и динамика развития архейного сообщества
- Влияние снижения времени удерживания субстрата в реакторах на анаэробный процесс
Современные методы оценки биологического разнообразия сообществ микроорганизмов
Стремительное изменение климатических условий, интенсивное развитие производства, а также ограниченность запасов и рост стоимости ископаемых видов топлива диктуют современному энергозависимому обществу необходимость частичной смены традиционных источников энергоресурсов на другие. Современная альтернативная энергетика специализируется на поиске и применении нетрадиционных источников энергии, представляющих привлекательность как с экономической стороны, так и экологической, ввиду снижения риска причинения вреда окружающей среде. Перспективным альтернативным источником энергии является остаточная биомасса, представляющая собой возобновляемый ресурс. Существует ряд технологий, позволяющих перевести первоначальную энергию биомассы в топливо, в числе которых довольно привлекательным считается получение биогаза из различных органических отходов (Huber et al., 2006; Antoni et al., 2007; Ahn et al., 2009; Wirth et al., 2012).
К сырью, из которого можно получить биоэнергию, относят навоз с животноводческих ферм, помет домашней птицы, отходы мясокомбинатов, спиртового и молочного производства, растительная биомасса сельского хозяйства, различные бытовые и промышленные отходы, в том числе сточные воды предприятий, а также отходы муниципального хозяйства. Все эти органические отходы содержат запасенную химическую энергию, которая может быть высвобождена различными путями. К таковым можно отнести прямое получение тепловой или электрической энергии, то есть сжигание биомассы, химический или ферментативный гидролиз запасенных углеводов с последующим их сбраживанием в этиловый спирт, получение жидкого моторного топлива на основе растительных масел, животных жиров, липидов микроводорослей, а также получение газообразного топлива путем анаэробной конверсии различной биомассы (метаногенез) (Magbanua et al., 2001; Antoni et al., 2007; Ilori et al., 2007; Lee et al., 2009b; Weiland, 2010).
Биотопливо классифицируют в соответствии со структурой на твердое, жидкое и газообразное. К твердым видам относят дрова, древесную щепу, солому, пеллеты. К жидкому моторному биотопливу относят биоэтанол, производимый в результате микробной ферментации сахаров растительного происхождения (пшеница, кукуруза, сахарная свекла), биометанол, получаемый в результате биотехнологической конверсии морского фитопланктона, а также биодизель. Биодизель рассматривают как один из перспективных моторных видов альтернативного жидкого топлива, получившего широкое распространение во всем мире. Европа является одним из основных производителей и потребителей биодизельного топлива. Его производство основано на процессе, известном как переэтерификация масла или жира путем смешивания со спиртом (метанол, этанол) в присутствии катализатора. Сырьем для производства биодизеля могут выступать как масла различных растительных культур, так и липиды микробного и животного происхождения. К перспективным жидким видам топлива можно отнести биобутанол и диметиловый эфир. К газообразным видам биотоплива относятся биогаз и биоводород (Gngr-Demirci, Demirer 2004; Antoni et al., 2007; Weiland, 2010).
Биотопливо классифицируют также в соответствии с первоисточником, из которого получают тот или иной вид моторного топлива. Биотопливо первого поколения – это биотопливо, получаемое в результате конверсии пищевого сырья, в частности сельскохозяйственных культур в биодизель, биоэтанол. Биотопливо второго поколения – топливо, основным источником которого служат непищевые культуры, лигноцеллюлозная биомасса, сельскохозяйственные отходы. К биотопливу этого поколения относят биоэтанол из целлюлозного сырья, биодизель из ятрофы и использованных растительных масел, а также биогаз, получаемый в результате микробной конверсии отходов производства. Примером биотоплива третьего поколения может стать биодизель с использованием микроводорослей с высоким содержанием липидов. Биотехнологии с применением генетически улучшенных организмов позволяют сегодня производить биотопливо четвертого поколения, например, моторное топливо с применением генетически модифицированных цианобактерий (McKendry, 2002; Antoni et al., 2007; Yang et al., 2009; Weiland, 2010).
Накопление больших масс органических отходов и их применение без соответствующей обработки и обезвреживания создает реальную опасность загрязнения почвы, водоемов и воздуха данными веществами. Одним из эффективных способов утилизации органических отходов сельского хозяйства является их активная анаэробная обработка, позволяющая решать проблемы обезвреживания, концентрирования и деструкции отходов с получением возобновляемой энергии в виде выделяющегося биогаза (Edelmann et al., 1999; Linne, Jnsson, 2005; Antoni et al., 2007; Weiland, 2010).
Метаногенез как процесс превращения биомассы в энергию был открыт еще в 1776 году Вольтой. Именно тогда было проведено химическое исследование болотного газа и установлено наличие метана. Биогаз образуется в процессе конверсии биомассы при участии анаэробных микроорганизмов. В таблице 1 представлено сравнение состава биогаза, природного газа и свалочного газа (Monnet, 2003). В качестве сырья для производства биогаза выступают отходы сельского хозяйства, отходы перерабатывающего производства, отходы рыбного и забойного цеха, а также энергетические культуры, например, силосная кукуруза. Обработка отходов животноводства, отходов мясоперерабатывающего производства биогазовой технологией снижает риск заболеваний, вызываемых паразитами и патогенными микроорганизмами, содержащимися в непереработанных отходах, так как известно, что конверсия с получением биогаза при повышенных температурах приводит к снижению количества возбудителей. Наряду с продукцией биогаза в анаэробных условиях происходит и обезвреживание экологически опасных химикатов, загрязнителей почв, воды, что может являться альтернативой детоксикацией загрязненных объектов (Ahn et al., 2009; Weiland, 2010; Bezergianni et al., 2010; Wan et al., 2013).
Анаэробная деструкция отходов спиртового производства в лабораторных биогазовых установках
Clostridium известны своей способностью восстанавливать данный ксенобиотик в условиях отсутствия молекулярного кислорода (Ederer et al., 1997). В исследованиях с клеточными суспензиями отдельных штаммов клостридий редукция нитрогрупп ТНТ приводила к формированию ТАТ и других соединений, значительная часть из которых осталась неопределенной. Lewis с сотрудниками (Lewis et al., 1996) описал кометаболизм ТНТ различными штаммами Clostridium sp., изолированными из биореакторов, наполненных смесью почв и таких взрывчатых веществ как ТНТ, циклотриметилентринитрамин и циклотетраметилентетранитрамин. Внесение косубстрата в качестве источника восстановительных эквивалентов значительно ускоряло трансформацию исходного токсиканта. В результате исследований Hughes с сотрудниками (Hughes et al., 1998) при анаэробной конверсии ТНТ клеточными экстрактами Clostridium spp. обнаружены такие соединения как 2-амино-4-гидроксиламино-5-гидрокси-6 нитротолуол и 2-гидроксиламино-4-амино-5-гидрокси-6-нитротолуол. Позже Huang с коллегами предположили, что первоначальная реакция проходила при участии СО-дегидрогеназы, которая ответственна за формирование из исходного ксенобиотика таких продуктов как ГАДНТ и 2,4 дигидроксиламино-6-нитротолуол (Рисунок 7) (Huang et al., 2000).
Исследована роль Fe-гидрогеназы штамма Clostridium acetobutylicum в редукции ТНТ (Watrous et al., 2003). Восстановление исходного поллютанта выделенным ферментом вела к формированию гидроксиламинопроизводных. При сравнении исходного штамма с мутантным без участка гена, ответственного за синтез альтернативной Fe-Ni-гидрогеназы, выявлено отсутствие влияния данного фермента на превращение исходного ксенобиотика. Степень активности гидрогеназы в клеточной системе находилась в прямой зависимости от способности организма атаковать нитрогруппы данного нитроароматического соединения.
Штамм Desulfovibrio sp. был выделен благодаря его потенциальной способности утилизировать ТНТ в качестве единственного источника азота и накапливать толуол в ростовых средах (Boopathy, Kulpa, 1992). Исследователи предположили, что нитрогруппы ТНТ подвергаются конверсии до аминогрупп с формированием ТАТ, из которого далее отщепляются аминогруппы механизмом, описанным в ранних работах на примере анилина (Schnell, Schinck, 1991).
Preuss с сотрудниками (Preuss et al., 1993) выделили чистую культуру Desulfovibrio на среде, в которой в качестве источника углерода был пируват, а в качестве источника азота – только ТНТ. Была показана способность клеточных суспензий штамма осуществлять полное превращение ТНТ в ТАТ в условиях отсутствия восстановительных агентов, при этом данная реакция не заканчивалась восстановительным дезаминированием. Исследования также были направлены на раскрытие биохимии микробных ферментов, ответственных за восстановление ТНТ в ТАТ. В присутствии пирувата и водорода в качестве доноров электронов диамино-нитротолуолы трансформировались в ТАТ. Однако присутствие монооксида углерода ингибировало формирование ТАТ и способствовало аккумуляции 2,4 диамино-6-гидроксиламинотолуола. Данные наблюдения позволили исследователям предположить, что реакцию восстановления 2,4-диамино-6 гидроксиламинотолуола до ТАТ катализирует сульфит-редуктаза, так как имеются данные относительно чувствительности данного фермента к монооксиду углерода (Рисунок 7). Если трансформация 2,4,6-тринитротолуола анаэробными бактериями родов Clostridium и Desulfovibrio возможна с образованием ТАТ, то, следовательно, глубокая деструкция ТНТ в анаэробных условиях роста возможна исключительно через отщепление аминогрупп из сформировавшегося ТАТ. Показано, что биологическая трансформация ТАТ возможна только при строго нейтральных значениях рН и в анаэробных условиях (Preuss, Rieger, 1995). Hawari с коллегами посвятили внимание роли ТАТ как ключевого метаболита при анаэробной трансформации взрывчатого вещества (Hawari et al., 1998). Авторы предположили, что данное соединение является конечным продуктом, препятствующим дальнейшей минерализации ТНТ. Полное анаэробное восстановление ТНТ в ТАТ и взаимодействие последнего с активным илом легли в основу попытки проведения процесса биоремедиации в анаэробных условиях (Rieger, Knackmuss, 1995).
Метаболизм нитроароматических соединений в аэробных условиях Многими исследователями показано, что превращение ТНТ аэробными бактериями протекает через восстановление одной, редко двух нитрогрупп. Известны работы (Haidour, Ramos, 1996), в которых показано, что частично восстановленные формы 2,4,6-тринитротолуола, а именно нитрозо- и гидроксиламинопроизводные, реагируют между собой в аэробных условиях с формированием азокси-тетранитротолуолов и азо-тетранитротолуолов (Рисунок 8). Таким образом, в результате данных реакций образуются высокоустойчивые соединения, которые в дальнейшем не разрушаются микроорганизмами (Banerjee et al., 1999). Кометаболические превращения 2,4,6-тринитротолуола в большинстве известных случаев происходили при сочетании исходного ксенобиотика с глюкозой или другим легкометаболизируемым субстратом. В связи с этим внимание исследователей привлекла взаимосвязь между трансформацией ТНТ и нитробензола (Fiorella, Spain, 1997). Авторами показано, что бактериальный штамм Pseudomonas pseudoalcaligenes использовал нитробензол в качестве источника углерода и энергии и оказался способным восстанавливать нитрогруппы ТНТ с формированием таких метаболитов как 4-ГАДНТ, 4-АДНТ, 2,4-дигидроксиламино-6-нитротолуол и 2 гидроксиламино-4-амино-6-нитротолуол (Рисунок 8). Наряду с этими продуктами восстановления ТНТ в культуральной жидкости также накапливались метаболит желтой окраски и NO2– в небольших количествах.
Структура и динамика развития архейного сообщества
Помимо роли в гидролизе и ацидогенезе, представители класса Clostridia также участвуют в ацетогенезе и синтрофном окислении ацетата. Последний путь имеет особое значение в качестве альтернативного удаления ацетата, когда ацетокластический метаногенез подавляется, например, из-за присутствия высоких концентраций аммиака (Schnrer, Nordberg, 2008). Аммиак в ингибирующих концентрациях образуется при анаэробной конверсии сырья с высоким содержанием белка (например, отходов со скотобойни) или другого обогащенного азотом субстрата (например, птичьего помета). Синтрофное окисление ацетата, связанное с гидрогенотрофным метаногенезом, также становится благоприятным при повышенных температурах (Hattori, 2008), что было подтверждено анализом микробных сообществ в некоторых термофильных реакторах (Goberna et al., 2009; Sasaki et al., 2011; Rademacher et al., 2012). Большинство бактерий, участвующих в синтрофном окислении ацетата, относятся к клостридиям (Schnrer et al., 1996; Hattori et al., 2000; Westerholm et al., 2010; Westerholm et al., 2011), однако их фактическое разнообразие пока не известно.
Помимо нескольких клостридиальных филотипов, представители Bacteroidetes были обнаружены в изобилии в наших реакторах. Представителей филы Bacteroidetes обнаруживают как в анаэробных реакторах, утилизирующих шламы (Ariesyady et al., 2007; Rivire et al., 2009), так и в биогазовых реакторах, перерабатывающих растительную биомассу (Krause et al., 2008; Krber et al., 2009).
В заключение, состав бактериального сообщества в 11 реакторах в основном зависел от субстрата, а также от температуры в 2 реакторах, которая вызывала наиболее выраженные сдвиги в структуре сообщества. После перехода на термофильный режим переработки (55оС), бактериальное сообщество в биореакторе R 4.6, утилизировавшем навоз КРС и DDGS, развивалось в сходном направлении, что и бактериальные сообщества в реакторах R 3.1, R 4.19 и R 4.20 (Рисунок 11). 149 Метаногенное разнообразие на основе анализа гена mcrA сравнивали с данными, полученными после анализа гена 16S рРНК архей. В принципе, хорошие результаты были получены с применением обоих методов, однако среди клонированных фрагментов гена 16S рРНК отсутствовали представители семейства Methanobacteriaceae, и гены mcrA охватывали более широкий спектр метаногенов. Известно, что концентрации аммонийного азота в пределах 1.7 14.0 гл–1 ингибируют метаногенную активность (Chen et al., 2008). Метаногенное сообщество в реакторе R 3.1, в котором анаэробной конверсии с получением биогаза подвергали куриный помет и навоз КРС, почти полностью состояло из гидрогенотрофных метаногенных архей, принадлежавших роду Methanoculleus. Метаногены данного рода используют H2/CO2 и формиат в качестве метаногенных субстратов (Ollivier et al., 1986; Zellner et al., 1998; Cheng et al., 2008). Это указывает на почти полное ингибирование ацетокластического метаногенеза в данном реакторе. Причиной ингибирования ацетокластического метаногенеза, по-видимому, являлась высокая концентрация ЛЖК (в основном ацетата и пропионата, до 9.9 гл–1 и 4.1 гл–1 соответственно) и NH4+-N (до 5.9 гл–1) (Таблица 5). Таким образом, синтрофное окисление ацетата в качестве основного процесса его поглощения можно предположить в реакторе R 3.1, как было показано в работе Schnrer с сотрудниками (Schnrer et al., 1999), которые также наблюдали переход к синтрофному окислению ацетата при высоких концентрациях ЛЖК и аммиака. Преобладание Methanoculleus spp. в реакторе R 3.1 означает их способность доминировать и в экстремальных условиях роста. Кроме того, данные метаногены были обнаружены во всех 11 реакторах, что означает их повсеместную основную роль в гидрогенотрофном метаногенезе в биогазовых реакторах. Следующими мажорными филотипами в наших реакторах оказались представители рода Methanosarcina. Они являются ацетокластическими и метилотрофными микроорганизмами, некоторые из них также могут использовать H2/CO2 в качестве метаногенных субстратов. Реакторы R 4.19 и R 4.20 (с Jatropha) работали при повышенных концентрациях ЛЖК (до 3.6 гл–1) и NH4+-N (до 3.8 гл–1) по сравнению со всеми другими реакторами, но в более мягких условиях по сравнению с R 3.1 (Таблица 5). По-видимому, повышенные концентрации ионов аммония и ЛЖК в реакторах R 4.19 и R 4.20 стимулировали рост видов рода Methanosarcina, а не Methanosaeta (Karakashev et al., 2005). Кроме того, из-за высокой концентрации ионов аммония, синтрофное окисление ацетата могло протекать и в этих реакторах, но при более низких скоростях по сравнению с ацетокластическим механизмом, выполняемым Methanosarcina spp. (Schnrer, Nordberg, 2008). Метаногенные археи рода Methanosarcina были обнаружены как доминирующие метаногены в реакторах R 4.13 , R 4.14, R 4.15 и R 4.16 (с соломой и навозом КРС).
Присутствие Methanosaeta spp. указывает на протекание строго ацетокластического метаногенеза при низких концентрациях ацетата (Kendall, Boone, 2006), что было справедливо для реакторов R 4.8 (с кукурузным силосом и навозом) и R 4.6 (с DDGS и навозом) в мезофильных условиях. Присутствие Methanomethylovorans spp. означает, что конкретные метилированные соединения, такие как метиламины, диметилсульфид или метантиол, которые были образованы из обогащенной белком биомассы, преобразуются непосредственно в метан (Lomans et al., 1999).
Структура метаногенного сообщества, как и бактериального, также коррелировала с температурой. Так, в реакторе R 4.6 (с DDGS и навозом) повышение температуры до 55оС сопровождалось снижением распространенных Methanosaeta spp. и появлением Methanosarcina spp. Кроме этого, увеличение температуры вело к накоплению ЛЖК в реакторе, в частности ацетата.
Влияние снижения времени удерживания субстрата в реакторах на анаэробный процесс
В отдельных экспериментах нами было обнаружено отсутствие способности Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 и Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 к окислению ионов NH4+ в NO2– и/или NO3–. Кроме того, нами была протестирована стабильность нитрит-иона при различных значениях рН в отсутствие клеток дрожжей. Подкисление исходной синтетической среды до рН 4.0, используя HCl, с последующим внесением NO2– в концентрации 240 мкМ показали возможность окисления NO2– в NO3– и в абиотических условиях. Однако концентрация абиотически сформированного NO3– была гораздо ниже таковой, полученной биологическим путем. Так, после 10 ч экспериментального периода при убыли 19% NO2– только 6% от этого количества подверглось конверсии в NO3–. Повышенная скорость конверсии NO2– в NO3– и повышенный выход NO3– в присутствии дрожжевых клеток в сравнении с абиотической трансформацией NO2–, безусловно, являются результатом участия ферментативных систем наших штаммов в окислении NO2–. Однако некоторое количество NO2– превращалось в NO3– и абиотическим путем.
С использованием метода ЭПР-спектроскопии нам также удалось обнаружить образование внеклеточного NO в процессе трансформации ТНТ клетками Y. lipolytica и Geotrichum sp. (Рисунок 44). Спектры комплекса FeII(NO)(ДЭТК)2, образованные при взаимодействии ловушки NaДЭТК с железом и NO в наших системах, соотносятся с данными более ранних работ, в которых исследователи изучали процесс образования NO в других системах (Fujii, Berliner 1999; Ueno et al., 2002). Предположительно, выделение NO – процесс абиотический, в результате реакции NO2– в NO и NO3–, а также NO2– в NO и NO2 при пониженный значениях рН окружающей среды (van Cleemput, Baert, 1984; Cai et al., 2001).
Обнаруженные пути трансформации ТНТ в присутствии клеток дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 и Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 при варьировании условий роста.
Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 и Geotrichum sp. ВКПМ F-1037. В таблицах 23 и 24 отображены основные параметры анаэробной конверсии отходов сельского хозяйства в отсутствие и в присутствии метаболитов ТНТ. Продолжительность экспериментов составила 20 суток.
Как видно из таблиц 23 и 24, в общем, максимально возможное количество образующегося биогаза в отсутствие и в присутствии
Данные удельного выхода биогаза и содержание метана представлены как значения, полученные в течение всего экспериментального периода, тогда как значения рН, ЛЖК и NH4+-N – в последней точке отбора проб, когда микробные сообщества были проанализированы. метаболитов ТНТ отличалось незначительно и варьировало в диапазоне 843 870 мл с содержанием метана на уровне 52-59%. Значения рН, концентрация органических кислот и количество ионов аммония находились приблизительно на одном уровне на 20 сутки эксперимента. Все метаболиты ТНТ были подвержены эффективному анаэробному элиминированию. Так, на конец эксперимента ни один из метаболитов ТНТ, детектируемых в аэробных условиях, не был обнаружен в отсутствие молекулярного кислорода, что означает их полную конверсию при комбинации двух режимов. Кроме того, был зафиксирован повышенный выход биогаза в сравнении с экспериментами анаэробной трансформации ТНТ. Все это указывает на высокую эффективность сочетания аэробной и анаэробной трансформации исходного ксенобиотика и его метаболитов.
Определение состава бактериального и архейного консорциумов в трех анаэробных установках осуществляли путем T-RFLP анализа на 20 сутки эксперимента (пики на T-RFLP-грамме определяли в соответствии с T-RF клонов, полученных в вышеописанных экспериментах). Независимо от образца, наиболее распространенной и разнообразной бактериальной группой оказался порядок Clostridiales (до 81% от общей площади T-RF пиков). Это указывает на их ключевую роль как в гидролизе и ацидогенезе, так и в конверсии метаболитов ТНТ. Среди метаногенных сообществ преобладали представители двух родов – Methanoculleus (до 55%) и Methanosarcina (до 40%). Обнаружение представителей Clostridiales, Methanoculleus и Methanosarcina во всех образцах означает их основную роль в обезвреживании отходов различного происхождения.
6.3 Корреляция параметров
Загрязнение окружающей среды токсичными и устойчивыми к разрушению химическими соединениями, в частности 2,4,6 тринитротолуолом (ТНТ), происходит при производстве, транспортировке, хранении и применении взрывчатых веществ. метаболитами его частичного превращениия, представленные интермедиатами конверсии одной или двух нитрогрупп, относятся к токсичным, а также потенциально мутагенным веществам (Harter, 1985; Walker, Kaplan, 1992). ТНТ наносит вред человеку, попадая в организм в основном через пищеварительные и дыхательные пути (Leung et al., 1995). Несмотря на долгую историю изучения процессов деструкции ТНТ с использованием биологических методов обработки, связанной с внесением различных штаммов микроорганизмов в ТНТ-загрязненные места, данные попытки не привели к значительным успехам, так как трансформация исходного ксенобиотика затрагивала в основном его нитрогруппы без значительной степени минерализации (Boopathy, Kulpa, 1993; Funk et al., 1993; Stahl, Aust, 1995; Manning et al., 1995).
Выявление анаэробных и аэробных микроорганизмов, осуществляющих минерализацию и детоксикацию исходного ксенобиотика, а также интермедиатов его трансформации, представляет научный интерес как с фундаментальных позиций, а также с точки зрения внедрения разрабатываемых природоохранных технологий. В данной работе оценен потенциал трансформации ТНТ анаэробными микроорганизмами, и выявлены основные пути метаболизма ТНТ в анаэробных системах. Так, основными начальными метаболитами трансформации ТНТ в анаэробных условиях оказались гидроксиламино динитротолуолы и амино-динитротолуолы. Дальнейшая инкубация приводила к трансформации данных соединений в 2,4-диамино-6 нитротолуол и 2,4,6-триаминотолуол с постепенной их элиминацией. Не исключена возможность полной деградации образованных метаболитов неизвестными Clostridiales или их прочного связывания с растительной биомассой в анаэробных условиях, что может являться альтернативой очистки объектов, загрязненных ТНТ и его метаболитами. Далее нами был проведен поиск аэробных микроорганизмов, способных осуществлять деструкцию ТНТ (через механизм гидридного восстановления ТНТ).
