Содержание к диссертации
Введение
1 CLASS Обзор литератур CLASS ы. 10
1.1 Деструкция лигноцеллюлозного материала; 10
1.1.1 Общая характеристика лигноцеллюлозных субстратов .10
ГЛ. 1.1Строение лигнина. 11
1.1.1.2 Строение целлюлозы 15
1.1.2 Методы предобработки растительного сырья... 15
1.1.2.1 Химические методы предобработки. 17
1.1.2.2 Механическая обработка растительного материала 19
1.1.2.3 Ультразвуковое воздействие 20
1.1.3 Микробиологическая деградация растительных материалов 23
1.1.3.1 Биодеструкция целлюлозы 23
Г. Г.3.2 Биодеструкция лигнина 31
1.2 Основные закономерности гумифицирования растительного материала. 35
1.2.1 Общая характеристика гуминовых кислот 36
1.212 Описание механизмов образования гумусовых кислот 40
1.2.3 Технологические способы получения гуминовых кислот 45
1.3. Анализ литературных данных 49
2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Культуры микроорганизмов и условия их выращивания 50
2.2. Методы выделения основных компонентов лигноцеллюлозных субстратов 52
2.2.1. Выделение лигнина с 72%-ной серной кислотой в модификации Комарова 52
2.2.21 Определение целлюлозы методом Кюршнера; 53
2.2.3. Определение гидролизуемых Сахаров в растительном материале 54
2.3 Оборудование и методика ультразвуковой обработки 54
2.3.1 Устройство и работа ультразвуковой установки 54
2.3.2 Методика ультразвуковой подготовки растительного материала 56
2.4 Методика прессования микротаблеток 56
2.4.1 Методика сборки и наполнения пресс-формы 56
2.4.2 Процесс прессования 57
2.5 Определение массовых валовых содержаний химических элементов методом рентгенофлуоресцентного анализа 58
2.6 Определение массовой концентрации фенолов флуориметрическим методом 59
2.6.1 Устранение мешающего влияния продуктов метаболизма 59
2.6.2 Измерение массовой концентрации фенолов 59
2.7 Определение удельной поверхности и пористости методом низкотемпературной адсорбцией азота 60
2.8 Метод оценки биологической эффективности гуминовых веществ 60
2.8:1 Характеристика сортов льна 61
2.8.2 Характеристика гуминовых кислот 61
2.8.2.1-Выделение гуминовых кислот из торфа 61
2.8.2.2 Выделение и очистка гуминоподобных веществ из культуральной среды 62
2.8.3 Метод определения ростстимулирующей активности гуминовых веществ 62
3 Результаты и их обсуждение 63
3.1 Скрининг микроорганизмов, разрушающих лигноцеллюлозу 63
3.1.1 Исследование свойств грибного изолята 64
3.1.2 Исследование свойств бактериального изолята 66
3.2 Оптимизация условий культивирования 73
3.3 Оптимизация основного субстрата для биоконверсии 75
3.4 ИК-фурье-спектроскопическое исследование лигнинов 78
3.5 Исследование влияния ультразвукового воздействия на лигноцеллюлозный материал 84
3.5.1 Выбор оптимальных условий проведения ультразвуковой обработки 84
3.5.1.1 Влияние интенсивности ультразвука 85
3.5.1.2 Изучение влияния продолжительности обработки на состав шелухи семечек 87
3. 5.2 ИК- Фурье исследование предобработанного ультразвуком субстрата 89
3.6 Биоконверсия растительного материала 91
3.7 Определение удельной поверхности и пористости субстратов методом низкотемпературной адсорбцией азота 97
3.8 Выделение и исследование свойств гуминовых кислот 100
3.8.1 Спектральный анализ гуминовых веществ 102
3.8.1.1 Спектрофотометрическое исследование 102
3.8.1.2 ИК-спектроскопическое исследование гуминовых веществ 103
3.8.2 Исследование биологической активности гуминовых кислот 108
3.9 Разработка технологии получения комплексных препаратов гуминовой природы 125
Выводы: 127
Ітрактическиерек01ушндации 129
Список использованных источников 130
- Ультразвуковое воздействие
- Оборудование и методика ультразвуковой обработки
- Выделение и очистка гуминоподобных веществ из культуральной среды
- Исследование влияния ультразвукового воздействия на лигноцеллюлозный материал
Введение к работе
Актуальность проблемы и общая характеристика работы. В настоящее время большое внимание уделяется проблеме биоконверсии и, в частности, биодеградации одного из самых устойчивых к химическому и микробиологическому разложению биополимера - лигнина. Большинство почвенных микроорганизмов способны изменять структуру данного полифенольного соединения. Они синтезируют мультиферментный комплекс лигнолитического действия, который принимает участие в процессе деструкции субстрата.
Разработка экологически чистых биотехнологических процессов обработки, биоконверсии и утилизации лигносодержащих материалов, способствовала интенсификации исследований механизма воздействия микроорганизмов на лигнин и роли их ферментов при его деградации. Результаты этих исследований дали возможность оценить роль микроорганизмов в процесс делигнификации и установить корреляцию между эффективностью деградации лигнина, биосинтезом гуминовых кислот и особенностями механизма их образования.
Биотехнологические способы получения биопрепаратов содержащих гуминовые кислоты, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, являются наиболее перспективными по сравнению с химическими. Они могут обеспечить экологически безопасные процессы делигнификации и низкую себестоимость полученных продуктов [1,2]. Среди большого количества биопрепаратов, представленных на российском рынке, особый интерес представляют препараты гуминовой природы.
Одним из наиболее важных свойств гуминовых кислот является их физиологическая активность. В последнее время обнаружены антиоксидантные, антимутагенные, адаптогенные свойства гуминовых кислот[3,4]. Ранее неоднократно подчеркивалось разнообразие биологической активности гуминовых кислот разного происхождения (различных по составу, зольности, степени конденсированное™) [5]. Известно, что в регуляции интенсивности процессов роста растений определяющую роль играет гормональная система. При этом ростстимули-рующая активность гуминовых кислот обусловлена их способностью активно воздействовать на гормональный статус проростков. Данные, приведенные в литературе [4,6], указывают на стойкое накопление гормонов цитоки-ниновой природы в предобработанных гуминовыми веществами растениях в сравнении с контролем, в то время как существенных изменений в уровне абсцизовой кислоты не было выявлено. При этом важно подчеркнуть, что имеются сведения о повышении содержания цитокининов в обработанных гуминовыми кислотами растениях, а также наличии этих гормонов в самом препарате. Особое место в спектре действия цитокининов занимает их способность повышать стресс-устойчивость растений.
В связи с этим весьма перспективными являются биотехнологические способы получения гуминовых веществ с заданными свойствами путем их биосинтеза микроорганизмами в более короткие сроки. Поэтому исследования гуминовых кислот и их биологической активности представляют собой задачу научной и практической значимости.
В настоящее время изучаются метаболические возможности Bacillus для биодеградации промышленных отходов (фенолов) и пестицидов, а также для производства полисахаридов и меланинов [7-9]. Изучение бацилл, выявление новых продуктов, которые можно получать с их помощью, все больше расширяет область применения этих микроорганизмов. В целом этот род очень перспективен для промышленных целей, так как бациллы - это в основном непатогенные, быстро растущие на недорогих средах микроорганизмы.
Целью настоящей данной работы было выделение и изучение морфо-лого-биохимических свойств штаммов микроорганизмов, способных к биоконверсии лигносодержащих субстратов и синтезу гуминовых кислот.
Для проведения исследований по деструкции лигносодержащих субстратов были поставлены и решались следующие задачи: - произвести скрининг микроорганизмов и выделить штамм, наиболее полно воздействующий на лигносодержащие субстраты и способный синтезировать гуминовые кислоты;
- изучить деструкцию основных компонентов лигноцеллюлозного субстрата при культивировании изучаемого штамма;
- изучить возможность использования ультразвуковой предобработки субстрата в синтезе гуминовых кислот;
- исследовать ростстимулирующую активность синтезируемых гуминовых кислот в нормальных и стрессовых условиях;
- предложить схему получения гуминовых кислот в условиях in vitro.
Научная новизна.
Проведен скрининг микроорганизмов, осуществляющих биоконверсию лигноцеллюлозных субстратов. Осуществлен сравнительный анализ их основных морфологических, физиолого-биохимических свойств, субстратной специфичности. Выделен наиболее активный штамм, показавший в условиях in vitro способность синтезировать гуминовые вещества. На основании анализа секвенсов вариабельных участков 16 S рДНК установили, что изучаемый штамм микроорганизмов относится к виду Bacillus subtilis, с вероятностью 98%.
Установлено, что гуминовые вещества, синтезируемые микробиологическим путем, обладают такой же биологической активностью как гуминовые кислоты низинного торфа. Изучен процесс биодеструкции лигноцеллю-лозы растительного субстрата. Показано, что гуминовые кислоты образуются через стадию деметоксилирования лигнина.
Впервые проведены исследования по определению ростстимулирую-щей активности гуминовых веществ, синтезированных в условиях in vitro, при действии на семена льна сортов Новоторжский и Ленок. Установлено, что микробиологические гуминовые вещества обладают биологической активностью, как и гуминовые кислоты низинного торфа. Впервые выявлен положительный эффект действия синтезируемых веществ на семена льна, про являющийся в стимуляции прорастания семян и повышении устойчивости предобработанных семян к холоду.
Проведенные исследования расширили представления об использовании микроорганизмов рода Bacillus (Bacillus subtilis) в биоконверсии лигно-содержащих субстратов и для синтеза гуминовых веществ.
Практическая значимость работы состоит в том, что показана ростсти-мулирующая активность синтезируемых гуминовых веществ в растениеводстве. Вещества увеличивают дружность всходов проростков льна и повышают образование их биомассы на 30%. Это очень важно в стрессовых условиях: при резком изменении температуры в утреннее и ночное время.
Показано, что применение монокультуры в производстве гуминовых веществ позволяет получать гуминовые препараты с определенными свойствами.
Возможность микробиологического синтеза гуминовых кислот позволит решить проблему утилизации отходов различных отраслей промышленности: деревообрабатывающей, гидролизной и других.
Использование микроорганизмов-продуцентов гуминовых веществ позволит сократить расходы угля и торфа в качестве сырья в производстве удобрений. Показана эффективность предобработки ультразвуком растительного сырья.
Разработана схема получения гуминовых кислот in vitro.
Разработан курс лекций и практических занятий по дисциплинам «Общая биотехнология» и «Основы биотехнологии» для специальностей 070100 - Биотехнология и 072000 - Стандартизация и сертификация в рамках учебного плана Тверского государственного технического университета.
Апробация работы.
Основные положения диссертации докладывались на следующих конференциях и конгрессах: 15-ый Международный конгресс «Chemical and Process Engineering CHISA 2002» (Прага, 2002), IX региональная областная научно-техническая конференция молодых ученых «Каргинские чтения» (Тверь, 2002), II Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), Всероссийская заочная конференция «Катализ и сорбция в биотехнологии, химии, химических технологиях и экологии» (Тверь, 2003), X региональная областная научно-техническая конференция молодых ученых «Каргинские чтения» (Тверь, 2003), Международная научно-практическая конференция «Вавиловские чтения- 2007» (Саратов, 2007).
Публикации.
По результатам опубликовано 8 печатных работ, в том числе, Д статья в изданиях центральной печати рекомендованных ВАК, получено свидетельство на полезную модель. Изобретение может быть использовано в промышленности при решении проблем, связанных с переработкой отходов.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Библиография включает наименований 159, в том числе 27 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами, 38 рисунками.
Ультразвуковое воздействие
Физические методы предобработки подразделяют на механические и немеханические. К последним относятся у-облучение, облучение потоком электронов, обработка паром, микроволновым излучением (2400-2500МГц), воздействие высокого давления, ультразвука и охлаждения [1,30-33].
Механическая предобработка является универсальным способом предобработки растительных материалов, так как процесс протекает в одну стадию и не требует в большинстве случаев дополнительного отмывания сырья, в отличие от химической обработки, но является весьма энергоемким. В ре- зультате механической обработки происходит уменьшение частиц растительных материалов, частичное разрушение клеточных стенок, снижение упорядоченности целлюлозы, увеличение доступной поверхности для ферментов и в ряде случаев деградация лигнина.
Механическая предобработка применяется, как правило, для интенсификации процесса деградации растительного сырья в совокупности с химическим, биологическим или физико-химическим воздействием.Ультразвук - упругие колебания и волны звука в диапазоне частот 104-109 Гц. В основе всех ультразвуковых технологий лежат эффекты взаимодействия ультразвука со средой. Мощный ультразвук вызывает в жидких средах ряд специфических эффектов: кавитацию, интенсивные микро - и макропотоки, приводящие к быстрому и качественному перемешиванию компонентов среды, образованию стойких эмульсий, экстрагированию растворимых компонентов из находящихся в жидкости частиц, набуханию и разрушению этих частиц. Ультразвук применяется для проведения технологических процессов и ультразвукового контроля (определение свойств, состава и строения веществ), интенсификации производственных процессов - экстрагирования, эмульгирования, диспергирования, осветления, сушки [50,51].
Применение ультразвука с целью интенсификации процесса экстракции различных веществ из растительного сырья или усиления действия реагентов, а также самого ультразвука на конечный продукт исследуется доста точно широко [30-33,52-56]. Изучалось ультразвуковое воздействие на биологические объекты вообще, физиологические и химические основы его стимулирующего действия на сельскохозяйственные культуры, древесину и продукты ее переработки. Механизмом, ответственным за увеличение скорости экстракции веществ является кавитация, частичное разрушение клеток, усиление обтекания частиц потоками растворителя и, следовательно, массо-переноса. Кроме того, кавитация вызывает химические эффекты, приводящие к накоплению в среде гидроксил - радикалов и перекиси водорода [56]. Обработка древесины в воздушной среде, даже при значительном увеличении времени обработки с 15 до 35 минут, практически не влияет на количество определяемого лигнина и лигнина, способного растворяться в спирте. В то время как при обработке древесины ультразвуком в водной среде растворимость лигнина в спирте повышалась в 2,5 раза, по сравнению с лигнином из необработанной древесины [57,58].В работах Б.А.Янковского[54] также показано, что ультразвуковая обработка древесины сосны способствует извлечению лигнина, особенно в условиях водной среды. Нарушения структуры лигнина вызываются химическими эффектами, возникающими под влиянием кавитации в среде ультразвуковых колебаний.
Кавитация наиболее интенсивна на границе фаз «вода - твердое вещество», благодаря чему поверхность древесины испытывает постоянное воздействие сил сжатия и расширения вследствие появления и схлопывания ка-витационных пузырьков.
Вследствие этого под действием акустических колебаний, как в воздушной, так и водно - спиртовой среде, нарушаются анатомическая структура древесины, изменяются морфологические параметры ее элементов, особенно волокон, а также межмолекулярные связи ее компонентов. Согласно гистохимическим и спектральным (ИК-спектроскопия) исследованиям древесины после воздействия на нее ультразвука в среде воздуха и водно-этанольной смеси лигнин в древесине претерпевает значительные измене-ния[57,59]. Количество субъединиц лигнина с высокой молекулярной массой снижается с увеличением продолжительности воздействия ультразвука, тогда как количество с низкой молекулярной массой значительно возрастает [60].
Деструктивное действие ультразвука на продукты переработки древесины и саму древесину используют для получения из лигносульфонатов ванилина [56], усиления пропитки древесины, обеззараживания стоков после отбелки целлюлозы, а также увеличения белизны сульфатной целлюлозы в поле ультразвуковых волн в жидкой среде [58].
На живые клетки ультразвук оказывает комплексное воздействие. С одной стороны, под воздействием ультразвука изменяются свойства биополимеров, а с другой - ультразвук ускоряет ряд химических процессов. В результате воздействия ультразвука на живые клетки изменяются свойства полимеров: в поле интенсивностью (10Вт/см2, 0,6-0,8 МГц) в течение нескольких часов аминокислоты синтезируются из более простых веществ и сами испытывают существенные химические превращения. Низкие интенсивности ультразвука способны тоже изменить их свойства [61].
Ультразвук заметно влияет на структуру и функции белков и нуклеиновых кислот. Эти изменения зависят от размеров и формы молекул, от природы присутствующих в растворе посторонних веществ и параметров ультразвукового поля. Белки, имеющие компактную, глобулярную форму менее чувствительны к ультразвуку, чем фибриллярные белки [51]. В настоящее время изучена кинетика инактивации каталазы в растворах низко- и высокочастотным ультразвуком. Некоторые авторы [51] проводили обработку растворов фермента ультразвуком высокой частоты (2,6 МГц) и низкой частоты (20,8 кГц). В ходе исследований установлено, что в обоих случаях зависимость скорости инактивации каталазы от мощности излучения носит пороговый характер. При этом порядок константы скорости инактивации для указанных частот различается не сильно. Подтверждено, что превалирующую роль в ультразвуковой инактивации каталазы играют свободные радикалы НО и НОг , образующиеся в поле ультразвуковой кавитации [51]. Молекулы ДНК и РНК в ультразвуковом поле (10 Вт/см2; 0,8 МГц) в первые же минуты облучения распадаются на фрагменты примерно равной молекулярной массы. Воздействие в течение несколысих часов приводит к появлению в растворе свободных нуклеотидов.
Как химическое, так и механическое действие ультразвука на биомолекулы наблюдается во всех случаях, когда его интенсивность превышает порог кавитации. Если воздействию подвергаются низкомолекулярные частицы, то превалирует химическое действие. Когда же молекулярный вес частицы велик, основную роль играют механические силы [51].
Второй аспект ультразвукового воздействия связан с разрушением клеточной мембраны. Интерес представляет тот факт, что, если клеточные мембраны после ультразвукового воздействия сохранили свою структурную целостность, то их функциональные характеристики восстанавливаются в течение 10-60 минут. Часть клеток при облучении в ультразвуковом поле разрушается, но клетки, пережившие воздействие, не отличаются от контрольных. На этой особенности клеток основана активация культур в ультразвуковом поле [62,63].
Оборудование и методика ультразвуковой обработки
Электрические колебания частотой 30 кГц, генерируемые транзисторным генератором блока питания, преобразуются пьезострикционным преобразователем излучателя в механические упругие колебания соответствующей частоты, которые воздействуют на среду.
Прибор IKASONIG U 50 control выполнен в виде настольной установки и конструктивно представляет собой стойку, на которой размещен блок и рабочий излучатель (рисунок 5).
Концентратор излучателям имеет выход позволяющий устанавливать на него рабочие насадки различной конструкции, которые имеются в комплекте, обеспечивая его широкое использование.
Прибор регулируется вручную, но возможен и компьютерный контроль генерируемой мощности ультразвука. Благодаря сменным насадкам возможно получить следующий диапазон мощностей: от 12,5 Вт/см2 до 460 Вт/см2.
Ультразвуковой генератор комплектуется ультразвуковым излучателем, предназначенным для преобразования электрических колебаний генератора в механические упругие колебания и передачи их обрабатываемой среде.
Рисунок 8 - Ультразвуковая установка IKASONIC U 50 control 1 - кнопка пуска, 2 - зеленый светодиод, 3 - красный светодиод, 4 - резервный пуск, 5 - рельса для держателя, 6 - кабель, 7 - излучатель, 8 - концентратор излучателя, 9,10 - подготовительные устройства для излучателя, 11 -ручка настройки амплитуды %, 12 - ручка настройки цикла (пульсации/паузы), 13-корпус.
Прибор комплектуется двумя видами насадок: конической и трубчатой. Для обработки мелкодисперсных образцов и растительного сырья используется излучатель с конической насадкой, которая вводится в облучаемую сре ду своей рабочей частью, представляющей собой разветвленную поверхность - пятак. Излучатель с трубчатой насадкой позволяет производить обработку исследуемого вещества непосредственно в насадке или в пробирке, которая устанавливается в насадку. Геометрические размеры насадок рассчитываются для резонансной частоты излучателя в зависимости от их конфигурации, массы и применяемых материалов.
Методика ультразвуковой подготовки растительного материала
В рабочую пробирку или иной химический сосуд диаметром не более 50 мм наливается от 20 мл растворителя и погружается необходимая навеска растительного материала. Затем химический сосуд погружается в охлаждающую жидкость. В сосуд с приготовленной гетерогенной смесью вводится коническая насадка с пятаком. Производится настройка генератора на экспозицию ультразвукового воздействия и уровень интенсивности, после чего включается генератор.
Выделение и очистка гуминоподобных веществ из культуральной среды
Обработку семян льна проводили, путем замачивания их в течение суток. В качестве ложа для прорастания семян использовали один слой фильтровальной бумаги в чашках Петри. Семена проращивали при 20-22С в течение 7 суток. На второй день роста определяли энергию прорастания семян. В день завершения опыта определяли всхожесть, массу сырого вещества корешков и ростков - весовым методом. Контролем служили растворители вода и 0,05н КОН [145].
Отбор микроорганизмов - трансфоматоров лигноцеллюлозы представляет собой задачу, специфическую для каждого конкретного случая. Для проведения многих трансформаций могут быть использованы обычные коллекционные культуры. Исследование коллекционных культур - вполне оправданный дуть поиска, если речь идет об энзиматических превращениях, осуществляемых ферментами обычного метаболизма, широко распространенных среди микроорганизмов. Однако если трансформируемый субстрат представляет собой специфическое соединение или отношение к нему до конца не выяснено. В этом случае нужную культуру выделяют из природных источников [80].
Поэтому для трансформации лигноцеллюлозного материала был осуществлен отбор микроорганизмов из автохонной микрофлоры опилок территории деревоперерабатывающего предприятия. Для определения видового состава микроорганизмов, выделенных из опилок, использовали следующие питательные среды: агар Чапека, среда Гетчинсона, сусло-агар и агар с добавлением гидролизата рыбы [146]. В ходе исследований была выявлена вы о
сокая обсемененность (до 10 кл/г) отходов с доминированием грибных штаммов. Были обнаружены следующие микроорганизмы: Aspergillus, Peni-cillium, Fusarium, Clostridium, Alternaria, Bacillus, Cytophaga, Actinomyces, дрожжи.
Для получения микроорганизма - трансформатора лигноцеллюлозного материала производили отбор штаммов, интенсивно использующих этот субстрат. В качестве единственного источника углерода использовали измельченные опилки. Измельченный субстрат способствует значительному повышению содержания в среде питательных элементов, усилению массообмена. Выделенные микроорганизмы можно объединить в следующие группы: - не использующие лигноцеллюлозу,
- хорошо растущие, но слабо разрушающие растительный материал,
- хорошо растущие и активно разлагающие лигноцеллюлозный субстрат.
При изучении естественной микрофлоры исследуемых отходов дерево-перерабатывающей промышленности было выяснено, что наиболее активно на среде с опилками развиваются один бактериальный и один грибной штаммы.
Идентификацию выделенных штаммов производили на основании морфологических и физиолого-биохимических признаков [143, 146-151].
На среде Чапека колонии ограниченно растущие, на сусло- и картофе-ледекстрозном агаре растут быстро, достигая в диаметре 4-5 см. Мицелий белый. Поверхность колоний в начале белоснежная, затем коричневая (рисунок 10а). Обратная сторона колонии окрашена в темно-коричневый цвет. Споро-ношение густое. Конидии шаровидные, коричневые. Хорошо развиваются в температурном интервале 20-30С, растут в широких пределах рН от 4 до 8. Аэробы. Изучаемые грибы способны усваивать сахарозу, глюкозу, чистую целлюлозу, хуже лигноцеллюлозу.
Рисунок 10 - Колонии грибного изолята а) на агаризованной среде Чапека,
б) на жидкой среде с опилками При исследовании физиологических признаков культуры установлено, что грибной изолят синтезирует необходимые для роста витамины, наилучший рост наблюдается на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония.
Полученные морфологические характеристики автохонной культуры позволили предположить, что данный микроорганизм относится к роду As-pergillius [149-151].
Из литературных данных [1,18] известно, что Aspergillus sp. усваивают природные растительные субстраты, продуцируя весь комплекс целлюлоли-тических ферментов. Поскольку исследуемая культура была выделена из древесных отходов, в дальнейшем было проведено также изучение характера потребления лигноцеллюлозы. В качестве основного источника углерода были выбраны опилки. Культивирование осуществляли в конических колбах в течение 7 суток при температуре 29-30С (рисунок 106).
Высокое содержание целлюлозы и лигнина, (рисунок 11) после биоконверсии показывает, что в субстрате потребляется лишь его легкоусваеваемая часть.
Проведенный анализ показал, что выделенными штамм гриба не представляет особого интереса для і дальнейших исследований по. биоконверсии им лигноцеллюлозных субстратов. Поэтому дальнейшие исследования были сосредоточены на бактериальном штамме. Следующим этапом работы стало более глубокое изучение морфолого-биохимических свойств этого штамма.
Исследование влияния ультразвукового воздействия на лигноцеллюлозный материал
Ультразвуковое воздействие относится к физическим способам предобработки питательной среды. В качестве критериев, позволяющих считать условия предобработки оптимальными, были выбраны содержание лигнина, целлюлозы и накопление гуминовых кислот в ходе культивирования микроорганизмов на подвергнутом ультразвуковой предобработке субстрате.
В качестве оптимизируемых условий проведения процесса были выбраны интенсивность и продолжительность ультразвукового воздействия. Опыты с различной интенсивностью ультразвука проводились при равных исходных количествах субстрата (60 г/л). Использование большего количества шелухи затрудняет процесс перемешивания и теплообмена.
Выбор среды очень важен для определения оптимальных условий ультразвуковой обработки. На основе литературных данных[30,31] была выбрана дистиллированная вода, так как, во-первых, за счет водородных связей молекулы воды прочно связаны друг с другом, во-вторых, вода имеет низкий порог кавитации из-за большого поверхностного натяжения, в-третьих, дистиллированная вода содержит небольшое количество растворенных газов, «смягчающих» или даже препятствующих кавитационным эффектам [30], в-четвертых наибольшее извлечение лигнина из растительного материала происходит в условиях водной среды [59]. Причиной повышенного воздействия ультразвука водной среды на растительный материал является также микрорасслоение ткани и увеличение поглощения растворителя, что приводит к усилению эффекта кавитации.
Для изучения деструкции полимеров под воздействием ультразвука был исключен температурный фактор. Все опыты проводились при охлаждении ячейки с образцами водопроводной водой (12-14С). Интенсивность ультразвука варьировали от 230 до 460 Вт/см2.
Проведенные исследования показали, что пршувеличении интенсивности обработки происходит уменьшение содержания лигнина и целлюлозы (до 35,1%) и повышается выход гидролизуемых полисахаридов (до 35,7 %) в образцах в пересчете на абсолютно сухое вещество (рисунок 21).
Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что быстрее всего разрушаются вещества с наибольшей величиной относительной молекулярной массой (лигнин). Кинетические кривые для всех образцов сближаются на последних стадиях процесса, достигая одного и того же уровня масс. Эти результаты объясняются обычно тем, что с ростом относительной молекулярной массы макромолекулы понижается вероятность того, что она будет двигаться в изменяющемся акустическом поле как единое целое. Скорее всего, именно быстро движущиеся молекулы растворителя будут разрывать связь С-С при соударении с участком биополимера. Однако не исключена возможность разрыва связей С-Н. При этом места разрыва не зависят от прочности связи и имеют гауссово распределение. Тем не менее, где бы не разрывалась макромолекула, в результате образуются макрорадикалы.
Как представлено на рисунке 23, в течение 15 минут происходит деструкция лигнина, после чего содержание его постепенно увеличивается. Это вероятно связано с инициирующим действием ультразвука на полимеризацию лигнина. При этом инициирующими частицами могут быть образующиеся при кавитации радикалы Н или ОН (порознь или вместе), либо радикалы, образующиеся при деструкции полимера.
Одновременно происходит и уменьшение выхода твердого лигноцел-люлозного остатка до 92,6%.
Полученные результаты позволяют считать оптимальными условиями предварительной обработки субстрата, при которых достигается наилучшая деструкция растительного материала, интенсивность 368 Вт/см2 и продолжительность не более 15 мин. 3. 5.2 ИК-фурье исследование предобработанного ультразвуком субстрата
После проведения ультразвукового воздействия при оптимальных параметрах было проведено спектральное исследование субстрата. В ИК-фурье-спектрах изучаемых препаратов (рисунок 24), несмотря на их большое сходство, отражаются структурные различия в строении лигнина, обусловленные воздействием ультразвука. К наиболее существенным заметным отличиям относится положение валентных колебаний С-Н связей в метильных и метиленовых группах (2848 см"1). В спектрах также изменилось соотношение полос интенсивности полос при 1510 см"!и 1615 см"1. Возможно, это все связано с деметилированием сирингильных единиц лигнина.
После обработки появляется четко выраженная линия 1428см"1, определяемая скелетными колебаниями ароматического кольца и линия 1034 см"1, характерная деформационным плоскостным колебаниям С-Н связей в ароматическом кольце гваяцильного типа. Все это указывает на преобладание в необработанном материале сирингильных структур, а в озвученном гваяциль-ных структур. Очевидно, что ультразвуковое воздействие в водной среде вызвало нарушение связей между субъединицами лигнина.
В результате ультразвукового воздействия происходит деградация лиг-ниновой сетки, что способствует в дальнейшем увеличению доступной поверхности непосредственно целлюлозного ядра без снижения степени упоря-дочности. Частичное разрушение лигнина будет способствовать доступу ферментов к гликозидным связям полисахаридов, что должно привести к увеличению биоконверсии растительного субстрата.
