Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Общие сведения о ретикулоцитах 12
1.2. Основы эритропоэза и стадии созревания ретикулоцитов 13
1.3. Ручные методы исследования ретикулоцитов 17
1.4. Автоматизированные методы исследования ретикулоцитов 19
1.5. Физиологические вариации при подсчете ретикулоцитов 23
1.6. Клиническое применение результатов исследования ретикулоцитов 25
1.7. Лабораторная диагностика анемий 26
ГЛАВА 2. Клиническая характеристика исследованных пациентов и описание методов исследования
2.1. Клиническая характеристика исследованных пациентов 37
2.2. Метод подсчета ретикулоцитов с помощью световой микроскопии 41
2.3. Принцип работы гематологического анализатора GEN-S 41
2.4. Показатели исследования ретикулоцитов на анализаторе 46
2.5. Лабораторные методы, использованные для диагностики анемий 47
ГЛАВА 3. Характеристика автоматизированного метода исследования ретикулоцитов
3.1. Сравнение различных методов подсчета ретикулоцитов 49
3.2. Внутрисерийная и межсерийная воспроизводимость анализатора GEN-S по основным гематологическим и ретикулоцитарным показателям 53
3.3. Влияние условий и сроков хранения проб крови на показатели ретикулоцитов 56
3.4. Референтные величины показателей ретикулоцитов для взрослых мужчин и женщин 60
ГЛАВА 4. Результаты исследования показателей ретикулоцитов при анемиях различного генеза
4.1. Показатели гемограммы и ретикулоцитов у больных с железодефицитной анемией 62
4.2. Показатели гемограммы и ретикулоцитов у больных с Ви-дефицитной анемией 70
4.3. Показатели гемограммы и ретикулоцитов у больных с анемией при ХПН 78
4.4. Показатели гемограммы и ретикулоцитов у больных с аутоимунной гемолитической анемией 86
ГЛАВА 5. Заключение 93
Выводы 105
Практические рекомендации 107
Список литературы 108
- Автоматизированные методы исследования ретикулоцитов
- Принцип работы гематологического анализатора GEN-S
- Внутрисерийная и межсерийная воспроизводимость анализатора GEN-S по основным гематологическим и ретикулоцитарным показателям
- Показатели гемограммы и ретикулоцитов у больных с Ви-дефицитной анемией
Введение к работе
Актуальность исследования
Анемия является наиболее распространенным симптомом, сопровождающим течение различных заболеваний. Распознавание патогенетического варианта анемий базируется на данных лабораторного исследования и зависит во многом как от уровня и качества этих исследований, так и от правильной интерпретации полученных результатов.
Одним из основных гематологических тестов, оценивающих активность костномозгового эритропоэза, является исследование ретикулоцитов периферической крови. Оно используется в диагностике, классификации и мониторинге лечения анемии, оценке восстановления эритропоэза после химиотерапии и в динамике лечения реком-бинантным эритропоэтином. До настоящего времени основным методом оценки ретикулоцитов является микроскопический с подсчетом их относительного количества в суправитально окрашенном мазке крови. Однако указанный метод трудоемок, недостаточно стандартизирован, отличается низкой воспроизводимостью из-за подсчета небольшого числа ретикулоцитов. Коэффициент вариации по данным различных авторов составляет от 25% до 50% [79,112]. Кроме того, визуальная оценка ретикулоцитов является достаточно субъективной и зачастую не позволяет уловить слабо выраженные зернисто-сетчатые структуры [52], что необходимо для динамического мониторинга активности эритропоэза.
На протяжении последних 70 лет предпринимались попытки получения дополнительной информации о степени созревания ретикулоцитов при использовании микроскопического метода с целью более глубокой оценки состояния эритропоэза у больных анемией,
-7-однако они не нашли практического применения в клинико-диагностических лабораториях [10,88].
На современном этапе все больше внимания уделяется автоматизированному анализу ретикулоцитов, открывающему новые перспективы для оценки состояния эритропоэза.
Автоматизированные методы имеют значительно большую точность в подсчете, коэффициент вариации составляет около 6% [42]. Основными факторами повышения точности являются исследование большого числа эритроцитов (до 30 000 и более) и четкое улавливание незначительного количества РНК-содержащих структур в клетках. Современные гематологические анализаторы позволяют получить кроме классических относительного и абсолютного количества ретикулоцитов дополнительные показатели, характеризующие клеточный объем и степень зрелости ретикулоцитов. Большинство из этих показатели недостаточно изучено, во многом неясной остается их интерпретация при различных анемических состояниях [13,63,68].
Кроме того, до настоящего времени для новых ретикулоцитар-ных показателей не определены референтные величины и не изучено влияние условий и сроков хранения на стабильность проб крови.
Активное использование в клинике современных методов лечения (трансплантация почки и костного мозга, применение эритропо-этина и других факторов роста) требует внедрения новых, более доступных и дешевых способов оценки эффективности терапии на ее ранних этапах.
Все вышеизложенное определяет актуальность проблемы и позволяет обозначить цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования Изучить информативность результатов автоматизированного исследования ретикулоцитарных показателей периферической крови для оценки состояния эритропоэза и мониторинга терапии при различных видах анемий.
Задачи исследования
Провести сравнительный анализ результатов микроскопического и автоматизированного методов исследования ретикулоцитов в периферической крови.
Изучить влияние сроков и условий хранения проб крови на показатели ретикулоцитов.
Определить референтные величины показателей ретикулоцитов автоматизированного метода для взрослых мужчин и женщин.
Исследовать закономерности изменения ретикулоцитарных показателей в динамике проводимой терапии при железодефицитной, В12-дефицитной, аутоиммунной гемолитической анемиях и анемии при хронической почечной недостаточности.
Определить оптимальные сроки проведения исследования показателей незрелых ретикулоцитов в современной схеме диагностики и оценке эффективности лечения анемий различного генеза.
Научная новизна работы
Научная новизна настоящего исследования заключается в том, что впервые изучены и подробно охарактеризованы возможности автоматизированного метода исследования для оценки состояния эритропоэза в костном мозге.
Впервые изучено влияние сроков и условий хранения проб крови на результаты исследования незрелых форм ретикулоцитов.
Впервые определены референтные величины для показателей незрелых ретикулоцитов.
Впервые исследованы изменения ретикулоцитарных показателей при анемиях различного генеза до начала лечения и их значение для выявления степени выраженности неэффективного эритропоэза.
Впервые продемонстрированы закономерности изменения показателей ретикулоцитов, характеризующих клеточный объем и степень зрелости, в динамике терапии при различных видах анемий. Показана определяющая роль абсолютных величин ретикулоцитов и незрелых форм ретикулоцитов для наиболее полной характеристики степени восстановления нарушенного эритропоэза.
Впервые доказано, что при лечении анемий различного генеза повышение фракции незрелых ретикулоцитов и количества незрелых ретикулоцитов на 2-3 дня опережает увеличение общего количества ретикулоцитов в периферической крови.
Впервые предложены оптимальные сроки проведения автоматизированного анализа ретикулоцитов для мониторинга проводимой терапии.
Практическая значимость работы
В работе охарактеризованы преимущества автоматизированного анализа ретикулоцитов по сравнению с микроскопическим методом.
Установлены референтные величины ретикулоцитарных показателей для взрослых мужчин и женщин.
Определены оптимальные сроки и условия хранения проб крови для исследования ретикулоцитов.
Показатели ретикулоцитов, характеризующие объем клеток и степень зрелости, предоставляют дополнительную информацию о состоянии эритропоэза, что позволяет использовать их для ди-
- 10-намического мониторинга течения различных форм анемии и проводимой терапии.
Возможности современных многопараметровых гематологических анализаторов диктуют необходимость широкого использования в клинической практике результатов автоматизированного анализа ретикулоцитов.
Применение показателей исследования ретикулоцитов дает возможность более рационально подходить к диагностике и лечению больных с анемией различного генеза.
Основные положения, выносимые на защиту
Исследование ретикулоцитов на гематологическом анализаторе превосходит по воспроизводимости микроскопический метод подсчета ретикулоцитов, что позволяет более точно оценить состояние эритропоэза и выявить изменения, характерные для различных видов анемии.
Для повышения достоверности результатов исследования ретикулоцитов следует строго соблюдать сроки и условия хранения проб крови.
Показатели автоматизированного исследования ретикулоцитов (фракция незрелых ретикулоцитов, количество незрелых ретикулоцитов, средний объем ретикулоцитов и сферулированных эритроцитов) позволяют получить более точную информацию о состоянии эритропоэза.
Увеличение количества незрелых ретикулоцитов предшествует увеличению общего количества ретикулоцитов при повышении эритропоэтическои активности костного мозга, что дает возможность раньше оценить эффективность проводимого лечения.
Для оценки активности эритропоэза при мониторинге течения анемии и результатов лечения более рациональным является
использование всех дополнительных характеристик автоматизированного анализа ретикулоцитов, особенно их абсолютных значений.
Апробация работы Материалы диссертации доложены на совместной конференции
кафедры клинической лабораторной диагностики РМАПО МЗ РФ, кафедры иммунологии РМАПО МЗ РФ, Медицинского центра Банка России, Лабораторного центра Главного военного клинического госпиталя имени акад. Н.Н.Бурденко и клинико-диагностической лаборатории ГКБ им.С.П.Боткина 31 октября 2003 года, на научно-практическом симпозиуме «Принципы и способы лабораторного обеспечения внебольничной помощи и актуальные проблемы лабораторной медицины» 8.10.2001 года, на научно-практическом симпозиуме «Рациональное применение лабораторных тестов в диагностике и мониторинге наиболее распространенных форм патологии» 8.10.2002 года. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Реализация и внедрение результатов работы Результаты исследования внедрены в Медицинском центре Банка России, 574 Военном клиническом госпитале, 25 Центральном военном клиническом госпитале РВСН.
Клинические и лабораторные исследования, связанные с решением поставленных задач, проведены на базе Медицинского центра Банка России.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста,
иллюстрирована 41 рисунком и 20 таблицами. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Библиографический указатель включает 157 источников, из которых 34 отечественных и 123 зарубежных авторов.
Автоматизированные методы исследования ретикулоцитов
Из-за большого количества клеток, анализируемых проточными питометрами, имеет место явное улучшение точности в подсчете ретикулоцитов по сравнению с ручными методами [95,137]. Автоматизированные методы дают типичные коэффициенты вариации ниже 6% [43]. Сравнение проточного цитометрического метода подсчета ретикулоцитов с ручным методом при использовании нового метиленового синего указывает на отсутствие значительной разницы между средними значениями, полученными этими двумя методами [108,120,151] или слегка повышенные результаты при флюоресцентных цитометрических методах по сравнению с ручным методом [55,144]. Возможно это связано с наблюдением, сообщающем о том, что содержащаяся в ретикулоцитах РНК более стабильна, чем сформированный ретикулум [43]. Важным фактором увеличения точности автоматизированных методов является более четкое улавливание отличий рети-кулоцитов от зрелых эритроцитов [76]. У пациентов с ретикулоцито-зом около 9% коэффициент вариации для проточного цитометриче-ского метода составил 5,8%, для ручного метода — 27,2%, у пациентов с количеством ретикулоцитов около 1% для автоматизированного метода - 6,4%, для ручного — 47,3% [120].
Преимущества и недостатки флюоресцентных красителей, включая тиофлавин Т, акридин оранжевый, цианин БіОЗСб, пиро-нин Y, пропидиум иодид, этидиум бромид обсуждены во многих работах [31,108,64]. В настоящее время наиболее широко используется краска — тиазол оранжевый (1-метил-4(3-метил-2(ЗН) бензотиозалидин) метил (хинолин 4-метилбензол сульфонат). Эта краска имеет четкие преимущества перед другими, дает воспроизводимую интенсивность флюоресценции, сохраняющуюся более 60 мин. [108].
Некоторые авторы сообщают, что многоцелевые проточные ци тометры, использующие тиазол оранжевый, дают величину количест ва ретикулоцитов, превышающую в среднем в 1,5 — 2 раза результат референтного микроскопического метода [35,74,85]. Такая разница может быть частично объяснена высокой чувствительностью к минимальным количествам РНК. Кроме того, многие современные цитометрические методы могут давать завышенный результат вследствие аутофлюоресценции зрелых эритроцитов. По этой причине цитометры редко дают нулевую величину даже в пробах, в которых ручными методами ретикулоциты совсем не обнаруживаются [126,148]. Ложное увеличение количества ретикулоцитов, обусловленное влиянием лейкоцитов, становится существенным при субнормальном уровне ретикулоцитов или значительном лейкоцитозе. Данная ситуация характерна для хронического лимфолейкоза и некоторых зрелок-леточных лимфом, при которых малые лимфоциты и ядра клеток могут быть ошибочно включены в популяцию эритроцитов. С другой стороны, при серповидноклеточной болезни и холодовой агглютинации деформированные или аггрегированные эритроциты не попадают в популяцию эритроцитов, [64]. Патологически высокое количество тромбоцитов или наличие гигантских тромбоцитов также может повлиять на результат.
Показано, что при наличии микроскопически видимых телец Хауэлла-Жолли, автомат дает более высокое количество ретикулоцитов по сравнению с ручным методом [74,84]. Однако многие исследователи приходят к выводу, что эти тельца или совсем не влияют на счет ретикулоцитов [39,126,146], или их относительная концентрация так мала в большинстве случаев, что не оказывает существенного влияния [61,62]. Рекомендуется при необычно высоком содержании ретикулоцитов в первую очередь обратиться к клиническому анамнезу (например, спленэктомия у пациента).
Эритроциты, содержащие посторонние включения, например при малярии, по своим размерам и флюоресцентной активности схожи с ретикулоцитами [112]. Этот феномен предложено использовать для количественной оценки паразитов малярии [118,156].
Маловероятно, что растворимые вещества, способные к спонтанной флюоресценции (аскорбиновая кислота, цианкобаламин, фенолфталеин, адениндинуклеотид, билирубин) оказывают существенное влияние на результат флюоресцентного способа подсчета ретику- лоцитов [103]. Хотя сообщается об интерференции после внутривенного введения флюоресцеина при ангиографии сосудов сетчатки глаза [93].
Процентное выражение количества ретикулоцитов в большинстве случаев (особенно при ретикулоцитозе или ретикулопении) малоинформативно. Абсолютное количество ретикулоцитов — продукт процента ретикулоцитов и числа эритроцитов — является наименее сомнительным способом выражения результата и дает более значимые величины эритропоэтической активности. Так называемый «ре-тикулоцитарный индекс» рассчитывается по формуле: РИ = RET% х НСТ/0,45, где РИ — ретикулоцитарный индекс, RET% - процент ретикулоцитов, НСТ — гематокрит пациента в % [31,76]. Чтобы получить более достоверные результаты Хилман Р. и Финч К. предложили внести в подсчет ретикулоцитов поправку на гематокрит и время созревания [92]. Получаемый параметр был назван «ретикулоци-тарным индексом продукции» (RPI) и базируется на предположении, что между степенью анемии, скоростью продукции эритропоэтина и временем созрвания ретикулоцитов имеется прочная постоянная связь.
Для получения информации о степени созревания ретикулоцитов при использовании ручных методов более 70 лет назад Гейльмей-ер предложил градацию ретикулоцитов на 4 группы [88].
Принцип работы гематологического анализатора GEN-S
Унифицированным в России методом подсчета ретикулоцитов является подсчет относительного количества клеток, содержащих окрашенный зернисто-нитчатый материал, на 1000 эритроцитов. В качестве красителя используются бриллиантовый крезиловый синий, азур I или азур II [14,22]. Нами использован метод суправитального окрашивания бриллиантовым крезиловым синим на стекле с помощью готового красителя фирмы Sarstedt (Германия). Количество подсчитанных ретикулоцитов выражали на 100 эритроцитов (в %) и в абсолютном значении (х1012/л), используя для расчета число эритроцитов, полученное на анализаторе.
Для исследования клеток крови анализатор работает по принципу проточной цитометрии с использованием двух технологий:
Измерение импеданса (принцип Культера) используется для прямого определения количества и объема клеток крови — лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов.
Уникальная технология VCS применяется для дифференциального анализа лейкоцитов и исследования ретикулоцитов.
Измерение импеданса с подсчетом количества клеток и измерением их объема происходит в двух раздельных счетных камерах для лейкоцитов и эритроцитов с тромбоцитами одновременно по трем самостоятельным каналам в каждой камере. В лейкоцитарной камере в каждом из трех каналов оценивается около 8000 клеток. Результат выдается как средняя величина из двух близких по значению. По результатам измерения объема клеток строятся гистограммы.
Для исследования лейкоцитов и ретикулоцитов используется принцип проточной цитометрии с уникальной технологией VCS. Аббревиатура VCS составлена из начальных букв английских слов Volume — Conductivity - Scatter (Объем — Проводимость - Рассеяние). Технология VCS включает в себя одновременную детекцию клеток тремя методами в одной гидродинамически фокусированной кварцевой проточной кювете. Измерение объема клеток (V) происходит на основе измерения импеданса при прохождении постоянного тока. Этот параметр откладывается на оси Y графиков данных. Измерение электропроводимости клеток (С) проводится при прохождении тока высокой частоты (23 МГц). Величина измеренной проводимости зависит от объема и плотности внутренних структур клетки. По результатам измерения импеданса и электропроводимости математически рассчитывается структурная электропроводимость (СЭП) для каждой клетки. Эта величина откладывается по оси Z графика данных. Клетки с более высоким отношением размера ядра к размеру цитоплазмы (например, лимфоциты) имеют пониженные значения структурной электропроводимости, тогда как клетки с большей долей цитоплазмы (например, нейтрофилы) характеризуются повышенной структурной электропроводимостью. Определение рассеивающей способности клеток (S) осуществляется с использованием луча гелий-неонового лазера длиной волны 655 нм. Свет, рассеяный под средними углами, несет комбинированную информацию о размере клетки, ее гранулярности, поверхностной топографии и отражательной способности. В результате математической трансформации данных о среднеугловой рассеивающей способности и пике импульса импеданса образуется величина нормированной (на величину объема) рассеивающей способности (НРС), которая откладывается на оси X объемного графика.
Выходные сигналы с детекторов трех групп с помощью электронных схем комбинируются и анализируются, в результате чего выделяются популяционные кластеры клеток и тем самым происходит дифференцировка лейкоцитарной фракции клеток по пяти основным типам или анализ ретикулоцитов. Клеточные кластеры наглядно размещаются в цветной объемной диаграмме, так называемом VCS-кубе. По оси X — нормированная рассеивающая способность, по оси Y — объем клеток, по оси Z — структурная электропроводимость. Пример распределения клеточных популяций при анализе ретикулоцитов приведен на рис.1.
Определение гемоглобина осуществляется стандартным фотометрическим гемиглобинцианидным методом в проточной кювете.
В работе анализатора использовались следующие реактивы: разводящий раствор, лизирующий раствор для подсчета клеток и определения гемоглобина, промывающий раствор, два реактива для дифференциации лейкоцитов, два реактива для исследования ретикулоцитов, реактивы для окраски мазков.
Для исследования ретикулоцитов в приборе применяется не-флюорохромная краска новый метиленовый синий, осаждающая ре-зидуальную РНК внутри ретикулоцитов, что позволяет идентифицировать ретикулоциты и дифференцировать их от зрелых эритроцитов. Кроме краски используется стабилизирующе-фиксирующий реагент — закисленный гипотонический раствор, вызывающий набухание эритроцитов до сферической формы без их фрагментации и обеспечивающий выход гемоглобина во внешнюю среду. Этот реагент обладает также фиксирующим свойством, способствующим поддержанию сферической формы клеток, вызванной набуханием. Нативные красные клетки крови и ретикулоциты имеют неправильную форму, что обусловливает непредсказуемый характер информации об их рассеивающей способности под углами от 0 до 90 при действии светового пучка. Сферуляция красных клеток крови обеспечивает воспроизводимость информации о рассеивающей способности и создает основу для избирательного определения ретикулоцитов в образце. Удаление гемоглобина из округленных красных клеток крови усиливает четкость ретикулума и облегчает последующее цитометрическое определение ретикулоцитов.
Использование проточи о-цитометрическо го метода позволяет прибору исследовать популяцию ретикулоцитов, которая в зависимости от степени зрелости ретикулоцитов разделяется на 10 зон (рис.2).
Внутрисерийная и межсерийная воспроизводимость анализатора GEN-S по основным гематологическим и ретикулоцитарным показателям
Воспроизводимость прибора по основным гематологическим показателям хорошая и близка к опубликованным в литературе данным или превосходит их [1,12,30].
Результаты исследования межсерийной воспроизводимости, полученные при анализе трех уровней контрольного материала в течение 30 дней (всего 90 исследований), после обработки данных методом описательной статистики и подсчета коэффициента вариации приведены в таблице 4. Коэффициент вариации (V) колеблется по разным показателям от 1,1% до 9,8%. Для показателей количества ретикулоцитов (RET% и RET#) V уменьшается в зависимости от увеличения содержания ретикулоцитов: при низком содержании ретикулоцитов в пробах крови (0,9%) - он составляет 9,2%, при содержании ретикулоцитов 3% - V = 4,5%, при высоком содержании ретикулоцитов (10,9%) V = 2,5%. Наибольшей вариации подвержены показатели, характеризующие фракцию незрелых ретикулоцитов и количество незрелых ретикулоцитов. Для показателя IRF самый низкий V (6,1%) - характерен при высоком содержании ретикулоцитов - 10,9%, несколько выше V (7,1%) - при содержании ретикулоцитов 0,9% и самый высокий V (7,3%) - при содержании ретикулоцитов 3%. Для показателя HLR% сохраняется та же тенденция (9,4%, 9,8% и 8% соответственно). Для HLR# самый низкий V (6,5%) характерен при содержании ретикулоцитов 3%, несколько выше V (7%) - при ретикулоцитах 0,9% и самый высокий V (7,3%) - при высоком содержании ретикулоцитов - 10,9%. Наименьшая вариация характерна для средних объемов ретикулоцитов (MRV) — 2,7%, 1,8%, 2,8% соответственно и для сферулированных эритроцитов (MSCV) 1,1% для всех трех уровней ретикулоцитов. Результаты исследования внутрисерийной воспроизводимости прибора по показателям анализа ретикулоцитов в пробах крови трех пациентов с содержанием ретикулоцитов 0,3%, 0,9% и 3% обработаны методом описательной статистики с подсчетом коэффициента вариации и приведены в таблице 5. Произведено всего 90 исследований, по 30 исследований каждой пробы. Воспроизводимость в серии для RET% и RET# также улучшается при увеличении содержания ретикулоцитов (V для RET% - 7,8%, 3,0%, 2,8% и V для RET# - 6,3%, 4,4%, 2,1%). Сохраняются основные тенденции, характерные для воспроизводимости изо дня в день. Лучшая воспроизводимость характерна для средних объемов клеток (MRV и MSCV), для которых V колеблется в пределах 0,4% - 1,3%. Появление новых, дополнительных показателей автоматизированного исследования ретикулоцитов требует пересмотра имеющихся требований к условиям и срокам хранения проб крови. По данным проведенных исследований и публикаций в регламентирующих документах, подсчет ретикулоцитов крови методом микроскопии должен быть произведен не позднее 12 часов после взятия крови из вены с антикоагулянтом и хранении ее в холодильнике при 2 — 8 С. Подсчет ретикулоцитов в окрашенном мазке крови следует проводить не позднее, чем через 1 — 2 часа после его приготовления [23]. Подсчет относительного и абсолютного количества ретикулоцитов на анализаторе GEN-S рекомендуется производить до 24 часов после взятия крови из вены с К3ЭДТА при хранении в условиях комнатной температуры или до 72 часов при хранении в холодильнике (2 — 8С) [40].
Однако до настоящего времени не изучено влияние условий и сроков хранения проб крови на дополнительные показатели исследования ретикулоцитов, характеризующие клеточный объем и степень созревания.
При хранении проб крови в холодильнике (табл. 6) все показатели ретикулоцитов в трех диапазонах практически не изменяются в течение 48 часов.
При хранении проб в условиях комнатной температуры (табл. 7) в течение 48 часов относительное и абсолютное количество ретикулоцитов несколько снижается, но эти изменения недостоверны (р 0,1). Показатели объема клеток достоверно снижаются с 24 до 48 часов хранения, а фракция незрелых ретикулоцитов и количество незрелых ретикулоцитов достоверно снижаются с 6-го до 24-го часа хранения. Подобная динамика характерна для проб крови во всех 3-х диапазонах количества ретикулоцитов.
Таким образом, по нашим данным, для получения достоверных результатов дополнительных ретикулоцитарных показателей пробы крови при хранении в условиях комнатной температуры должны исследоваться в течение 6-ти часов после взятия. При хранении проб крови в холодильнике при 4-8 С стабильность результатов сохраняется в течение 48 часов.
Показатели гемограммы и ретикулоцитов у больных с Ви-дефицитной анемией
Таким образом, анемия у исследованных больных ХПН на фоне гемодиализа имела характер нормоцитарной, нормохромной и сопровождалась дефицитом эндогенного эритропоэтина (эЭПО). Выявленный макроцитоз ретикулоцитов согласуется с увеличенным количеством незрелых ретикулоцитов, имеющих больший клеточный объем по сравнению со зрелыми формами и не противоречит нормальному среднему объему зрелых эритроцитов. Повышение относительного и абсолютного количества ретикулоцитов, а также их незрелых форм, характеризует наличие активного эритропоэза в костном мозге, несмотря на дефицит эЭПО. Возможно, это объясняется реакцией костного мозга на гемолиз и постоянные кровопотери, связанные с гемодиализом.
В ответ на проводимую коррекцию анемии рекомбинантным эритропоэтином (рЭПО) и препаратами железа отмечена положительная динамика эритроцитарных показателей. Ретикулоцитарный криз наблюдался на 8-й день терапии у большинства больных.
Показатели незрелых ретикулоцитов (IRF, HLR%, HLR#) максимально повысились на 6-й день лечения, опережая на 2 дня пик увеличения общего количества ретикулоцитов, следовательно, могут быть использованы для более ранней оценки биологического эффекта рЭПО на эритропоэз.
При исследовании крови пациентов с аутоиммунной гемолитической анемией (АИГА) и в контрольной группе практически здоровых лиц получены результаты, данные обработки которых методами описательной статистики и двухвыборочного t-теста с различными дисперсиями представлены в таблице 16.
Диагноз АИГА подтвержден повышенным содержанием в крови общего (43,6 ± 7,8 мкмоль/л) и непрямого (33,7 ± 6,4 мкмоль/л) билирубина, положительной пробой Кумбса, увеличением свободного гемоглобина в плазме до 32 ± 9 мг/дл. У всех исследованных больных АИГА до начала лечения выявлена макроцитарная, гиперхромная анемия с выраженным анизоци тозом, о чем свидетельствуют достоверное снижение HGB (71 ± 18 г/л), RBC (1,59 ± 0,27х1012/л), НСТ (18,5 ± 3,4%), повышение MCV (116,4 ± 10,1 фл), МСН (44,5 ± 4,7 пг) и RDW (20,7 ± 4,4%). Имел место значительный относительный и абсолютный рети-кулоцитоз (33,4 ± 5,2% и 0,53 ± 0,21х1012/л), характеризующийся увеличенным средним объемом (MRV) до 123,8 ±6,1 фл. Были также значительно повышены IRF до 0,76 ± 0,27, HLR% до 25,2 ± 3,6%, HLR# до 0,401 ± 0,121хЮ12/л. Сравнительный анализ результатов у исследуемых больных в динамике лечения преднизолоном в течение 16 дней (табл. 17) показал повышение RBC до 2,73 ± 0,37х1012/л, HGB - до 105 ± 16 г/л, НСТ - до 30,6 ± 4,0%. Средний объем эритроцитов и среднее содержание гемоглобина в эритроцитах несколько снизились (MCV до 112,0 ± 8,6 фл, МСН до 38,7 ± 4,3 пг), но остались выше нормальных значений. Отмечалось снижение относительного и абсолютного количества ретикулоцитов с 4-го дня (RET% - 27,1 ± 5,1%; RET# - 0,543 ± 0,25х1012/л) к 10-13-му дню наблюдения до -89 нормального уровня (ЯЕТ%-до 1,5±0,4%; ЯЕТ#-до 0,041±0,01х1012/л) (рис.31,32). Средний объем ретикулоцитов (MRV) и сферулированных эритроцитов (MSCV) оставались повышенными с незначительными колебаниями (рис.33,34). Отмечалось значимое снижение фракции незрелых ретикулоцитов (IRF) к 16-му дню лечения преднизолоном до 0,09 ± 0,007 (рис.35). Одновременно снижались HLR% - до 0,14 ± 0,01% и HLR# - до 0,004 ± 0,001 х 1012/л (рис.36,37). Резюме. Таким образом, аутоиммунная гемолитическая анемия у исследованных нами больных до лечения имела характер макроци-тарной, гиперхромной с выраженным анизоцитозом, значительным относительным и абсолютным ретикулоцитозом, что характеризует высокую эритропоэтическую активность костного мозга. Ретикулоци-ты отличались большим объемом (MRV). Следует подчеркнуть, что наиболее выраженные изменения касались относительного и абсолютного количества незрелых ретикулоцитов (HLR% и HLR#), значения которых при АИГА оказались наиболее высокими, что подтверждает повышенную активность эритропоэза. На фоне приема преднизолона отмечалась положительная динамика эритроцитарных показателей, увеличились HGB, RBC, НСТ, однако характер анемии оставался прежним. Имело место снижение RET% и RET#, но объемные характеристики оставались высокими. Отмечалось постепенное снижение IRF, HLR% и HLR# к 16-му дню наблюдения до нормального уровня, что позволяет считать их наиболее чувствительными индикаторами активности эритропоэза в динамике лечения аутоиммунной гемолитической анемии.
