Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Гормоны коры надпочечников, их биосинтез и метаболизм 15
1.2. Методы количественного определения стероидных гормонов 29
1.2.1. Подготовка биологических объектов к анализу 29
1.2.2. Методы иммуноферментного и радиоиммунологического анализа 33
1.2.3. Количественное определение кортикостероидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 35
1.3. Лабораторная диагностика различных заболеваний гипофизарно-надпочечниковой системы 38
1.3.1. Дифференциальная диагностика различных форм гиперкортицизма 39
1.3.2. Лабораторная диагностика больных с аденомами коры надпочечников 50
1.3.3. Лабораторная диагностика различных форм вирильного синдрома 64
Глава 2. Материалы и методы исследования 99
2.1. Характеристика групп больных 99
2.2. Методы исследования 104
Глава 3. Определение закономерностей хроматографического разделения стероидных гормонов и оптимизация регламента пробоподготовки 116
Глава 4. Особенности лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома 155
4.1. Лабораторная диагностика различных форм вирильного синдрома с помощью методов иммуноферментного и радиоиммунологического анализа 155
4.2. Информативность хроматографического исследования нарушений надпочечникового стероидогенеза при лабораторной диагностике различных форм вирильного синдрома 165
4.2.1. Особенности стероидогенеза у больных с врожденной гиперплазией коры надпочечников с дефектом 21-гидроксилазы (простая вирильная форма) 165
4.2.2. Особенности стероидогенеза у больных со стертой формой врожденной гиперплазии коры надпочечников с дефектом 21-гидроксилазы 168
4.2.3. Особенности стероидогенеза при стертой форме ВГКН с дефектом 11р-гидроксилазы 171
4.2.4. Особенности стероидогенеза при идиопатическом гирсутизме... 173
4.2.5. Особенности стероидогенеза у больных с синдромом поликистозных яичников 174
4.2.6. Критерии лабораторной диагностики недостаточности Пр-гидроксилазы по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов крови, полученных при стимуляции кортикотропином 181
4.2.7. Качественные характеристики стероидных профилей крови и мочи при вирильном синдроме 185
Глава 5. Лабораторная диагностика гормональной активности различных аденом коры надпочечников 199
5.1. Оценка гормональной активности аденом коры надпочечников методами иммуноферментного и радиоиммунологического анализа 199
5.2. Оценка гормональной активности аденом коры надпочечников методом ОФ ВЭЖХ 207
Обсуждение результатов 221
Выводы 243
Практические рекомендации 247
Список литературы 248
- Количественное определение кортикостероидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
- Лабораторная диагностика больных с аденомами коры надпочечников
- Лабораторная диагностика различных форм вирильного синдрома с помощью методов иммуноферментного и радиоиммунологического анализа
- Оценка гормональной активности аденом коры надпочечников методами иммуноферментного и радиоиммунологического анализа
Введение к работе
Заболевания, протекающие с нарушением функции гипофизарно-надпочечниковой системы, всегда привлекали пристальное внимание эндокринологов ввиду сложности их диагностики и лечения [31,39,50,55,64,108]. В последние годы в связи с развитием современных технологий и диагностических возможностей отмечается значительный рост частоты выявления больных с патологией коры надпочечников, как с опухолями, так и с неопухолевыми формами. Несмотря на достигнутые успехи в этой области, клиницисты часто сталкиваются с трудностями в дифференциальной диагностике различных форм вирильного синдрома ив ранней диагностике органического эндогенного гиперкортицизма.
Определение источника гиперпродукции андрогенов представляется трудной и важной задачей лабораторной диагностики. Отмечают многообразие форм гиперандрогении: надпочечниковая гиперандрогения (НГА), овариальная гиперандрогения (ОГА), смешанные формы гиперандрогении [53,55,71]. НГА наблюдается как самостоятельная патология и как сочетание с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ). Одной из причин НГА является явная или стертая форма врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН), которая встречается чаще, не имеет клинических маркеров и может протекать как синдром поликистозных яичников (СГДСЯ). Авторы отмечают как врожденные формы ферментной недостаточности надпочечникового стероидогенеза, обусловленные генетическим дефектом, так и вторичные формы ферментных нарушений биосинтеза стероидов [342,347]. У значительной части больных НГА может быть не связана с ферментными нарушениями биосинтеза стероидов [55].
Отсутствие клинических маркеров стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников, возможность развития вторичных форм ферментных нарушений биосинтеза стероидов, сочетание надпочечниковой
7 гиперандрогении (НГА) с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) осложняют поиск источника гиперпродукции андрогенов.
Определение базального уровня 17-гидроксипрогестерона в большинстве случаях не позволяет диагностировать стертую форму ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы [83,131]. Нет единой точки зрения по диагностическим критериям стертой формы ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы [42,131,160,218,282,354,357]. Особую сложность представляет диагностика дефекта Пр-гидроксилазы [304,355]. При стертых формах ВГКН с недостаточностью lip-гидроксилазы биохимические критерии диагностики заболевания не разработаны. У гетерозиготных носителей недостаточности lip-гидроксилазы не отмечено каких-либо биохимических критериев, даже при стимуляции кортикотропином [355]. Альтернативный путь образования андростендиона из 11-дезоксикортизола и функциональное снижение активности 11 Р-гидроксилазы в условиях гиперандрогении любой этиологии создают определенные трудности при диагностике дефекта lip-гидроксилазы [130,175,232,294]. Дифференциальная диагностика дефекта 21-гидроксилазы от других форм ВГКН возможна только с помощью получения полного стероидного профиля [291].
На основании согласительного симпозиума в 2003 году в г. Роттердаме по диагностическим критериям СПКЯ диагноз его ставится при исключении других причин гиперандрогении, в том числе ВГКН и синдрома Иценко-Кушинга (СИК) [301]. Повышение экскреции свободного кортизола с мочой и уровня кортизола в крови при различных формах функционального гиперкортицизма и сохранение в некоторых случаях регуляции гипофизарно-надпочечниковой оси при субклиническом СИК вызывает определенные трудности в диагностике на данном этапе заболевания и требует изучения не только секреции кортизола, но и промежуточных продуктов стероидогенеза [111,334,343]. В настоящее время недостаточно изучены нарушения надпочечникового стероидогенеза у больных с инциденталомами. Ряд авторов отмечают, что случайно обнаруженные опухоли нередко выявляются
8 у больных с ВГКН и ферментные нарушения могут способствовать их развитию [168,223,300]. Показания к оперативному лечению при инциденталомах во многом зависят от обнаруженных у больных нарушений надпочечникового стероидогенеза [19,110,336,346].
В связи с этим представляется актуальной разработка дополнительных биохимических критериев стертых форм ВГКН и субклинического СИК. Особую актуальность приобретает поиск дополнительных маркеров недостаточности 11 р-гидроксилазы для выбора тактики лечения данных больных. Методы иммуноферментного и радиоиммунологического анализа не позволяют одновременно проанализировать в одном образце биологического материала содержание различных кортикостероидов, что необходимо для диагностики субклинических форм заболеваний коры надпочечников. Функциональные тесты могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты.
В последнее время подчеркивается значение мультифакторного анализа сложных биологических образцов в норме и при патологии и его связь с нарушениями, возникающими на уровне генома [94]. В связи с этим, особое значение приобретают хроматографические методы анализа, которые наряду с качественным и количественным анализом индивидуальных компонентов, позволяют получать стероидные профили крови и мочи, являющиеся наиболее ценными диагностическими тестами для заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов [73,335,345,350,353,359,364]. Для быстрой оценки общего состояния здоровья человека разрабатываются методы получения «обзорных» или «скрининговых» хроматограмм с оценкой всего профиля определяемых соединений [94]. Безусловный научно-практический интерес имеет разработка методов количественного определения и качественных характеристик индивидуальных кортикостероидов и оценка их дифференциально-диагностической значимости. Существующие в настоящее время клинико-лабораторные технологиим определения стероидных
9 профилей не адаптированы к диагностике субклинических форм заболеваний гипофизарно-надпочечниковой системы. Для оценки нарушений надпочечникового стероидогенеза отсутствуют четкие критерии выбора лабораторных методик, сведения о диагностической значимости исследуемых параметров, референтные значения для них. Решение данных вопросов необходимы для усовершенствования диагностики и выработки адекватной терапии пациентов с заболеваниями коры надпочечников.
Цель исследования.
Изучить информативность обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии кортикостероидов, иммуноферментного и радиоиммунологического анализа для оптимизации существующих и разработки новых алгоритмов клинико-лабораторной диагностики заболеваний коры надпочечников.
Задачи исследования.
Разработать способ определения кортикостероидов в крови и моче на основе метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с учетом оптимизации регламента пробоподготовки и условий хроматографического анализа.
Изучить особенности надпочечникового стероидогенеза у больных с различными формами вирильного синдрома и у больных со случайно выявленными опухолями коры надпочечников на основании определения содержания кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ и в сопоставлении с традиционными методами иммуноферментного (ИФА) и радиоиммунологического анализа (РИА).
Установить информативные лабораторные биохимические критерии стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11 Р-гидроксилазы, синдрома поликистозных яичников и смешанных форм гиперандрогении.
Установить информативные биохимические критерии субклинического синдрома Иценко-Кушинга и функционального гиперкортицизма по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов в крови и моче.
Разработать алгоритмы лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома и случайно обнаруженных опухолей коры надпочечников.
Научная новизна исследования. С использованием качественного и количественного и определения кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получены новые данные о механизмах нарушений этапов биосинтеза кортикостероидов на ранних стадиях заболевания при различных формах вирильного синдрома и опухолях коры надпочечников.
Впервые по данным ОФ ВЭЖХ установлены биохимические критерии
для дифференциальной диагностики стертых форм ВГКН с дефектом 21-
гидроксилазы и 11 Р-гидроксилазы. Информативные лабораторные критерии
недостаточности различных изоферментов 11 р-гидроксилазы выявлены по
динамике уровней в крови 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона,
кортикостерона, соотношений кортизол/11-дезоксикортизол и
кортизол/кортизон при проведении пробы с кортикотропином у больных с вирильным синдромом и у больных со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников.
Получены биохимические критерии, свидетельствующие о недостаточности 11р-гидроксистероиддегидрогеназы-1 у больных с синдромом поликистозных яичников (увеличение экскреции свободного кортизона с мочой и снижение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон).
Установлена информативность определения экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой на пробе с дексаметазоном, соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче для диагностики субклинического синдрома Иценко-
Кушинга и для дифференциальной диагностики органического и функционального гиперкортицизма.
Впервые разработаны алгоритмы лабораторной диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников у больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами.
Практическая значимость работы.
Исследования качественных и количественных нарушений надпочечникового стероидогенеза методом ОФ ВЭЖХ позволяют на ранних стадиях диагностировать заболевания коры надпочечников. Разработаны информативные биохимические критерии диагностики стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11 Р-гидроксилазы, функционального гиперкортицизма, синдрома поликистозных яичников, смешанных форм гиперандрогении и субклинического синдрома Иценко-Кушинга. Показано диагностическое значение определения динамики уровней 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, кортикостерона и соотношений кортизол/ 11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон при проведении пробы с кортикотропином для выявления недостаточности lip-гидроксилазы. Разработан алгоритм оценки гормональной активности различных аденом коры надпочечников, позволяющий диагностировать субклинический синдром Иценко-Кушинга до проведения пробы с дексаметазоном и стертые формы ВГКН у больных с инциденталомами коры надпочечников. Алгоритм лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома позволяет диагностировать стертую форму ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с кортикотропином..
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Исследование качественного и количественного состава
кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой
высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет получить
специфические хроматограммы стероидных профилей при различных
12 заболеваниях коры надпочечников, установить на ранних стадиях нарушения надпочечникового стероидогенеза и метаболизма кортизола у больных с инциденталомами, дифференцировать стертые формы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11 р-гидроксилазы, органический и функциональный гиперкортицизм и способствует оптимизации тактики лечения больных с вирильным синдромом и со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников.
Общими информативными лабораторными критериями стертых форм ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11 Р-гидроксилазы по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой, снижение соотношения свободный кортизол / свободный кортизон, уменьшение соотношения кортизол / кортизон до и в результате стимуляции кортикотропином, качественные изменения стероидных профилей в крови и моче.
Недостаточность 11 Р-гидроксилазы диагностируется у больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами при проведении пробы с кортикотропином на основании увеличения в крови уровней 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, снижения прироста уровня кортикостерона и соотношений кортизол/11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон, полученных по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии, и по снижению прироста в крови уровня альдостерона, полученного методом радиоиммунологического анализа.
Информативными биохимическими критериями синдрома поликистозных яичников по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются увеличение экскреции свободного кортизона с мочой и снижение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон в моче, нормальные уровни в крови промежуточных продуктов стероидогенеза, а по данным традиционных методов анализа
13 - снижение в крови уровня глобулина, связывающего половые гормоны и увеличение уровней инсулина и С-пептида.
5. Наиболее информативными лабораторными критериями
субклинического синдрома Иценко-Кушинга по данным
высокоэффективной жидкостной хроматографии являются увеличение
экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой,
недостаточное понижение их экскреции на пробе с дексаметазоном,
повышение соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный
кортизол/свободный кортизон в моче, качественные изменения
стероидных профилей в крови и моче.
6. Алгоритмы лабораторной диагностики различных форм вирильного
синдрома и случайно обнаруженных опухолей коры надпочечников на
основании качественного и количественного определения
кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой
высокоэффективной жидкостной хроматографии и информативных
показателей, полученных методами иммуноферментного и
радиоиммунологического анализа, позволяют дифференцировать
стертые формы ВГКН и синдром поликистозных яичников,
диагностировать субклинический синдром Иценко-Кушинга до
проведения пробы с дексаметазоном, а стертую форму ВГКН с
недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с
кортикотропином.
Личный вклад автора. Участие автора в исследовании выразилось в определении основной идеи работы, личном участии в проведении лабораторных исследований, выполнении статистической обработки и анализа полученных данных.
Апробация работы.
Результаты исследования были доложены на заседаниях ассоциации эндокринологов Санкт-Петербурга и Ленинградской области (1999, 2001,
14 2004), на Российской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР В.Г. Баранова, «Актуальные вопросы эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2000 г.), 1У Всероссийском конгрессе эндокринологов «Актуальные проблемы современной эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2001), 1-ой и 2-ой Международных конференциях «Высокие медицинские технологии XXI века» ( Испания, Бенидорм, 2002 и 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая эндокринология-достижения и перспективы» (Санкт-Петербург, 2003), 111 Международном симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003 г.), на 22-м Всемирном Конгрессе «Патология и лабораторная медицина» (Южная Корея, 2003), 2-ой Международной конференции «Врачи мира пациентам» (Санкт-Петербург, 2003).
Реализация результатов исследования. Результаты проведенного исследования внедрены в лечебно-диагностическую работу клиник ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава, эндокринного отделения больницы Св. Преподобномученицы Елизаветы (СПб), в педагогический и научно-исследовательский процессы кафедры эндокринологии им. акад. В.Г.Баранова ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 56 работ, в том числе 10 - в центральных журналах, рекомендованных ВАК, в главе монографии «Синдром Иценко-Кушинга». Получены 3 патента на изобретение, 2 приоритета на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, содержащего 365 источников, из которых 113 - на русском языке. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 40 таблицами.
Количественное определение кортикостероидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
ВЭЖХ стала широко применяться для анализа стероидных гормонов, начиная с 70-х годов прошлого века, и в настоящее время является основным методом в медико-биологических и фармацевтических исследованиях [194,208, 240,245,246,251,278,279,321,332,333].
ВЭЖХ имеет ряд преимуществ по сравнению с иммунологическими методами анализа (ИФА и РИА) по количеству и качеству получаемой информации: за один анализ мы получаем информацию о глюкокортикоидной, минералокортикоидной и андрогенной функции коры надпочечников, получаем данные не только о конечных, но и о промежуточных продуктах биосинтеза стероидных гормонов, а самым главным преимуществом ВЭЖХ является возможность получения характеристических стероидных профилей при разной патологии. Некоторыми авторами был составлен атлас стероидных профилей для здоровых и больных людей [318,323].
ВЭЖХ имеет ряд преимуществ по сравнению с газовой хроматографией: для ВЭЖХ не обязательна процедура предварительной дериватизации, так как для определения кортикостероидов не требуются ни высокие температуры, ни большая летучесть веществ. Кроме того, ВЭЖХ удобно применять для разделения и идентификации метаболитов. В то же время ВЭЖХ имеет ряд недостатков: существуют трудности при анализе веществ, поглощающих в области ближнего УФ (тетрагидрокортизол, тетрагидрокортизон, андростерон): требуется детектирование их в коротковолновой области спектра, где поглощают многие растворители.
Ранее (в 70 - 80-х годах) XX века в качестве сорбента в ВЭЖХ широко применялся модифицированный силикагель различных марок. Элюентами служили смеси растворителей: хлороформ : метанол, хлороформ : этанол : вода, дихлорметан : метанол, н. гексан-изопропиловый спирт [279,291 ].
Однако в настоящее время нормально-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография для этих целей практически не применяется -ее заменила обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ). В большинстве случаев используются сорбенты с привитыми октадецилсилильными группами. Также используются колонки с 1,2-дигидроксипропиловым эфиром (DIOL), обеспечивающие наилучшее разделение стероидов [292]. Диольные фазы имеют преимущество при анализе малополярных стероидов (по сравнению с обращенной фазой порядок элюирования стероидов обратный). В качестве элюентов могут служить водные растворы метанола [251,292,333], ацетонитрила [194,205,292,332], тетрагидрофурана [292,323]. Использование градиентного режима элюирования значительно увеличивает скорость анализа, однако, в этом случае возникает проблема точного воспроизведения параметров удерживания аналитов [194,240,251,292,332].
Для анализа стероидных гормонов коры надпочечников требуются высокочувствительные детекторы. Обычно для этих целей используются ультрафиолетовый [208,240,332,350] и флуориметрический детекторы [292,350]. Возможность применения УФ-детектора определяется наличием хромофорного фрагмента в анализируемом соединении в виде А4-3-кето-сопряжения. Однако, для этих типов детекторов предел обнаружения 0,5-1,0 нг, в то время как РИА позволяет определять пикограммовые количества. С помощью флуориметрического детектора можно анализировать стероиды, полученные путем предварительной дериватизации серной кислотой, дансилгидразином, 9-антроилнитрилом.
Подобно ГХ, ВЭЖХ успешно используется в сочетании с масс-спектрометрией [338], электроспрей [194,251,344], термоспрей [291,317,325] и химической ионизацией [287], а также в сочетании с радиоиммунологическим анализом [213,321, 349,309]
Первые работы, посвященные ГХ стероидов, были опубликованы в 1960 г. Хювел и сотр. показали возможность разделения смеси стероидов на неподвижной фазе SE-30 [72]. Позднее были разработаны методы разделения этих веществ и их количественное определение, различные варианты дериватизации. В этот же период ГХ нашла применение как перспективный метод определения функционального состояния надпочечников.
Для разделения стероидных гормонов и их производных ранее использовались в основном стеклянные и металлические насадочные колонки [72, 317]. Неподвижная фаза наносилась на специально подготовленный белый диатомитовый носитель. Из неподвижных жидких фаз наибольшее применение нашли силоксаны (обычно диметилсилоксаны). Наилучшими разделяющими свойствами обладают капиллярные колонки ( 17-3 0 метров), которые в основном и применяются в настоящее время для научных исследований [72]. Неподвижные фазы химически прививаются к поверхности колонки, что значительно увеличивает их устойчивость и срок работы. С другой стороны, для клинического использования целесообразно применение насадочных колонок, так как они просты в изготовлении и удобны при использовании, хотя и менее эффективны [72]. В качестве газа-носителя обычно используется гелий [72,359].
Как уже упоминалось, ГХ анализу подвергаются стероидные гормоны после дериватизации. Выбор производного определяется и методом детектирования. В клинической диагностике в основном применяют метокситриметилсилильные (МО-ТМС) производные [72,359] Хроматографический анализ осуществляют в режиме программирования температур с ионизационно-пламенным детектором.
Получение производных позволяет расширить круг применяемых детекторов: детектор электронного захвата (ДЭЗ) селективен на галогенсодержащие вещества, фотопламенный - на фосфорорганические. Это повышает селективность до нескольких десятков пикограмм, что является очень важным в биоклиническом анализе, где имеют дело со сложными смесями и малыми концентрациями определяемых соединений ( нг/мл).
Лабораторная диагностика больных с аденомами коры надпочечников
Уровень утреннего кортизола в сыворотке крови обычно нормальный при субклиническом синдроме Кушинга, вечерние уровни кортизола часто повышены. Можно предположить субклинический СИК при вечернем уровне кортизола больше, чем 5 мкг/дл. Экскреция свободного кортизола обычно между 100-150 мкг/с. Уровни АКТГ в сыворотке крови часто низкие или меньше нормы (меньше 10 пг/мл). Для подтверждения подавления секреции АКТГ рекомендуется тест с КРГ. Если уровень АКТГ в сыворотке крови повышается меньше, чем на 150% от базального уровня после введения КРГ, секреция АКТГ считается подавленной. Уровни ДГЭА-сульфата обычно подавлены у этих пациентов, т.к. уровни этого гормона АКТГ зависимы. Результат ночного теста с дексаметазоном указывает на автономную секрецию кортизола. Для скрининга СИК рекомендуется ночной тест с 1 мг дексаметазона. Если на следующее утро уровень кортизола в сыворотке крови выше, чем 3 мкг/дл, у такого пациента возможен этот синдром. Если после ночного теста с 8 мг дексаметазона уровень кортизола в сыворотке крови больше 1 мкг/дл, то вероятность наличия СИК у этого пациента очень велика.
Исследователи обращают внимание на значение энзимов в патогенезе повышенной и нормальной активности аденом коры надпочечников [296,300,336]. Изучали активность P450scc, Р45011р , Р450альдо, Р450С21, Р45017 в опухолях пациентов с первичным альдостеронизмом, СИК, в опухоли, продуцирующей дезоксикортикостерон и в аденомах без гормональной активности. При СИК были значительно увеличены активности и количество Р45017 и Р450С21 в опухоли, у DOC продуцирующей опухоли активность и количество Р45017 и Р45011Р были снижены. [336].
Заболевания коры надпочечников могут быть первичными и вторичными в результате другого патологического процесса в организме. Причиной возникновения заболеваний коры надпочечников могут быть врожденные дефекты ферментативных систем на различных этапах гормонообразования, опухолевые, аутоиммунные нарушения, хронические инфекционные заболевания, а также инволюционные, компенсаторные процессы и изменения центральных механизмов регуляции функции коры надпочечников различной этиологии [167]. Этиология и патогенез опухолей коры надпочечников окончательно не выяснен. При различных физиологических и патологических процессах, связанных с нарушением гормональной регуляции, в корковом веществе надпочечников развиваются гиперпластические изменения [5, 95, 307]. Еще в 1955 году академик В.Г. Баранов высказал положение о том, что гиперплазия коркового слоя, аденома и рак могут быть проявлением единого патологического процесса, обусловленного первичным развитием их в результате длительного стимулирующего влияния АКТГ [5]. Различие между опухолью и опухолеподобным образованием может быть определено лишь после гистологического и гистохимического исследований, изучения отдаленных результатов хирургического лечения [5]. В работе Трофимова В.М. представлены данные в пользу общности патогенеза опухолевых и неопухолевых изменений в надпочечниках [4]. Однако, и в настоящее время нет единого мнения по этому вопросу. Ряд исследователей отрицают такую последовательность превращений в корковом слое и считают гиперплазию и опухоли самостоятельными формами заболевания, которые обусловлены различными вариантами патогенеза. Возникновение аденоматозных узлов, опухолей в корковом веществе надпочечников некоторые авторы рассматривают как эктазию коры, возникающую при ее перестройке, другие считают, что источником аденоматозного гиперпластического процесса являются клетки клубочковой зоны или сетчатой зоны.
Сущность пролиферации клеток коркового слоя состоит в последовательном образовании из них вначале аденоматозных узелков, а затем обособленных аденом, отграниченных капсулой. По-видимому, этому содействует причина вне самого надпочечника, вызывающая местный очаг пролиферации эпителия и последующий переход его в опухоль, которая приобретает автономность и в зависимости от иммунобиологического состояния организма в одних случаях может стать гормонально-активной, а иногда даже озлокачествляться. В других случаях она остается гормонально-неактивной, представляет собой образование с пролиферацией той или иной зоны или всех слоев коры без признаков полиморфизма и имеет строение светлоклеточной мономорфной аденомы [5].
Гормонально-неактивные опухоли коры надпочечников различны по своей природе [360]. Среди них различают доброкачественные и злокачественные новообразования. Наиболее часто обнаруживаются аденомы коркового вещества надпочечника.
В отличие от светлоклеточных, темноклеточные аденомы наиболее гетерогенны по своему строению и характеризуются не только тканевым, но и клеточным атипизмом (слабо, умеренно, резко выраженным). При резко выраженном клеточном атипизме аденомы построены из крупных и гигантских клеток, имеющие иногда 2 ядра. Для смешанноклеточных аденом характерно сочетание полей из темных и светлых клеток. Клеточный и ядерный атипизм связан с темными клетками, в основном слабо или умеренно выражен. Наличие тканевого атипизма в большинстве случаев дает основание предполагать, что опухоль доброкачественная, резкий ядерный и клеточный полиморфизм заставляет дифференцировать ее со злокачественной. Тем не менее, в некоторых статьях подчеркивается, что поведение опухолей, возникающих в эндокринных органах, иногда непредсказуемо и отличает их от опухолей других тканей. При этом как «спокойная» морфологическая картина новообразования надпочечников, так и наличие некоторого атипизма клеток в ряде случаев не позволяет точно поставить диагноз и приводит к ошибкам [234,235,254].
Для объективной оценки опухолей определяется также ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ), который меняется в зависимости от степени дифференцировки и функциональной активности опухолей и в темноклеточных аденомах выше, чем в светлоклеточных.
Одной из причин появления в надпочечниках гиперпластических процессов вплоть до образования аденом является активное участие их во многих физиологических и патологических процессах, протекающих в организме. Их можно отнести к проявлениям компенсаторного процесса и выявить при различных заболеваниях [298,299]. Гиперплазия может быть обусловлена нарушением холестеринового обмена, особенно у лиц, страдающих гипертонической болезнью. По данным некоторых исследователей, узелковые образования в коре надпочечников встречаются при гипертонической болезни в 30% случаев. При этом они могут образовываться за счет врастания соединительной ткани вглубь паренхимы коркового слоя и отщепления ее. Ряд авторов отмечают, что гиперпластические измененения в надпочечниках чаще обнаруживают у пожилых людей [5,82,86]. Существует мнение, что узелки являются частью процесса старения и возникают вторично, вследствие сосудистых нарушений и ишемии. Высокую частоту аденоматозной гиперплазии у пожилых людей показывают аутопсийные исследования, некоторые авторы считают их вариантом нормы. В то же время они чаще наблюдаются у пациентов с гипертиреозом и диабетом [259].
Лабораторная диагностика различных форм вирильного синдрома с помощью методов иммуноферментного и радиоиммунологического анализа
Особый интерес представляют данные о повышении активности фермента 11 р-гидроксистероиддегидрогеназы на фоне гиперандрогенных состояний [302]. Это, по-видимому, является одной из причин увеличения клиренса кортизола и компенсаторного повышения секреции АКТГ с увеличением продукции надпочечниковых андрогенов («андрогены порождают андрогены»). Однако, с другой стороны, Stewart и соавт. не обнаружили повышения активности указанного фермента при овариальных гиперандрогениях [329].
Весьма спорным остается вопрос и об активности фермента 5-альфа-редуктазы при гиперандрогенных состояниях, т.е. фермента, который вовлечен как в обмен кортизола, так и в метаболизм андрогенов. Большинство исследователей считают, что активность 5-альфа-редуктазы на фоне гиперандрогении повышена, однако Rodin и соавт. не подтвердили этих данных [302,308] . Кроме того, ряд авторов предположили, что энзим, ответственный за продукцию 17-гидроксипрогестерона (17-ОНР), т.е. 17-альфа-гидроксилаза, и энзим, катализирующий превращение 17-ОНР в андростендион, т.е. 17, 20-лиаза, имеют повышенную активность как в яичниках, так и в надпочечниках при СПКЯ. Эти ферменты являются взаимосвязанными компонентами энзимной системы цитохрома 17-Р-450. Учитывая данные, приведенные выше, нельзя исключить влияния АКТГ, ЛГ, ИФР-1 и инсулина на активность указанной системы. Тем не менее другие исследователи не смогли подтвердить изменение активности ферментов цитохрома 17-Р-450 при гиперандрогениях [85].
Согласно результатам последних исследований, проведенных при изучении стероидогенеза в яичниках и надпочечниках у женщин с СПКЯ на фоне нарушенной чувствительности к инсулину, было отмечено, что острая нагрузка данным гормоном приводит к увеличению продукции не только овариальных андрогенов, но и к повышению чувствительности сетчатой зоны коркового вещества надпочечников к АКТГ, а также к повышению уровня DEEA-S (нельзя исключить и оптимизацию ЛГ-индуцированного стероидогенеза в надпочечниках) [75].
Несмотря на всю противоречивость представленных данных, стоит отметить, что гиперандрогения как при овариальном нарушении стероидогенеза, так и при нарушении стероидогенеза в надпочечниках, как правило, имеет смешанный генез [247]. Нарушения со стороны других звеньев эндокринной системы (гипоталамо-гипофизарная область, система инсулин-инсулиноподобный фактор роста), видимо, также могут вносить свой вклад в развитие гиперандрогении смешанного происхождения.
Периферические ткани. Кожа и печень играют ключевую роль в метаболизме как овариальных, так и надпочечниковых андрогенов. В норме на «периферии» образуется за счет метаболизма андростендиона до 35% от общей концентрации тестостерона в периферической крови, 5% андростендиона из DHEA-S, 100% дигидротестостерона (ДГТ) из тестостерона [75].
Нарушение метаболизма андрогенов в печени и коже может приводить к выраженной гиперандрогении. Например, у здоровых женщин большинство андрогенов, образованных в надпочечниках и яичниках, метаболизируются в печени до неактивных продуктов. При этом у женщин с гиперандрогенией значительная часть андростендиона и тестостерона метаболизируются до дигидротестостерона в коже. Установлено, что повышение уровня андрогенов ведет к увеличению активности 5-альфа-редуктазы, т.е. фермента, который катализирует превращение тестостерона в ДГТ. Кроме того, избыточная андрогенизация у женщин может увеличивать число кожных рецепторов к ДГТ. Увеличение клиренса тестостерона при повышении 5-альфа-редуктазной активности, видимо, в определенной мере нивелирует степень нарушений со стороны репродуктивной системы при гиперандрогенных состояниях. Биологическая целесообразность этого процесса подтверждается клиническими наблюдениями безгирсутных форм СПКЯ (генетически обусловленное снижение активности 5-альфа- редуктазы), имеющих более выраженные и трудноподдающиеся медикаментозной коррекции нарушения репродуктивной функции при сравнении с гирсутными формами СПКЯ [75].
Овариальная ГА, индуцированное нарушение метаболизма андрогенов влекут за собой ингибирование продукции секссвязывающего глобулина в печени, что приводит к повышению свободного, биологически активного Т (в норме 98% тестостерона находится в связанном состоянии). Инсулин в высоких концентрациях обладает таким же эффектом, снижая, кроме того, продукцию белка, связывающего ИФР-1 . Нарушенный метаболизм половых стероидов на «периферии» отражается на повышении уровня Е1, который, как было указано выше, занимает не последнее место среди факторов, приводящих к нарушению секреции гонадотропинов .Выделяют несколько причин, влияющих на избыточную продукцию El: 1 -увеличение концентрации его предшественника-андростендиона; 2 - увеличение объема жировой ткани; 3 - гиперинсулинемия, приводящая к повышению ароматазной активности адипоцитов [75]. Жировая ткань является важным звеном в метаболизме половых стероидов, оказывая влияние на функцию репродуктивной системы. Однако вся совокупность нарушений жирового обмена достаточно часто приводит к изменениям не только репродуктивной функции, но и углеводного обмена. Одно из ведущих патогенетических звеньев ожирения заключается в увеличении продукции инсулина. Причина гиперинсулинемии при этом состоит в развитии инсулинорезистентности (ИР), т.е. состояния при котором «нормальный» уровень инсулина не обеспечивает «нормальную» биологическую потребность. При этом гиперинсулинемия непосредственно усугубляет инсулинорезистентность. Известно, что степень ИР во многом зависит от формы ожирения. Так, с практической точки зрения выделяют два типа ожирения: верхний и нижний . Верхний тип ожирения характеризуется преимущественным отложением жировой ткани в области плечевого пояса, живота и задней поверхности шеи. При нижнем типе ожирения избыточное отложение жировой ткани локализуется в области ягодиц и бедер. Соотношение «талия/бедра» (W/H) может служить одним из простых дифференциальных показателей этих форм (W/H больше 0,85 - верхний тип ожирения, W/H меньше 0,85 - нижний тип ожирения). Тяжелая степень ИР, а также «метаболический синдром» (повышение уровня АД, триглицеридов, холестерина, гиперинсулинемия, гипер- и дислипидемия (увеличение фракции ЛПНП и снижение ЛПВП) чаще проявляют себя при верхнем типе ожирения [21].
Таким образом, причины функциональной овариальной ГА многочисленны. Все многообразие патогенетических механизмов, предложенных для объяснения развития данного состояния, не вызывает удивления, так как тесное взаимодействие составных элементов репродуктивной системы между собой и с другими органами, видимо, отражается на их функции как в норме, так и при патологии. Яичники при этом выполняют роль «индикатора» нарушений гормонального гомеостаза. По мере прогрессирования этих нарушений, как правило, функциональные изменения в яичниках, т.е. изменения на уровне активности ферментных систем, сопровождаются анатомической перестройкой по типу поликистозных изменений, которые всегда вторичны.
Оценка гормональной активности аденом коры надпочечников методами иммуноферментного и радиоиммунологического анализа
Подготовка подвижных фаз: серию водных элюентов, содержащих 35, 37, 40, 42, 60, 90 % ацетонитрила, готовили в стеклянных цилиндрах на 100 мл смешиванием ацетонитрила и дистиллированной воды в определенных соотношениях. При подготовке подвижных фаз их предварительно дегазировали в вакууме масляного насоса (отдельно - воду и водно-ацетонитрильные растворы). Бидистиллированную воду получали путем повторной дистилляции воды в бидистилляторе или лабораторной установке для перегонки воды. Все растворы готовили только на бидистиллированной воде.
Подготовка биологических объектов к анализу смесей стероидных гормонов. В качестве реальных объектов были взяты сыворотка крови и моча больных с различными эндокринными заболеваниями (отбор производился в 9 часов утра, так как секреция кортикостероидов подвержена циркадной ритмике; анализу подвергалась моча, собранная за сутки. До анализа образцы хранились в холодильнике в замороженном виде (- 20С). На этапе подготовки образцов сыворотки крови и мочи для определения стероидов методом ОФ ВЭЖХ применяли жидкостную и твердофазную экстракции [179,217].
Жидкостную экстракцию сыворотки осуществляли по следующей схеме: экстракция кортикостероидов сыворотки пятикратным объемом метиленхлорида, промывка органического экстракта 0,1 н. водным раствором NaOH для отделения более полярных, чем кортикостероиды, веществ (фенольные эстрогены, нестероидные липиды и др.), окрашенных соединений, присутствующих в образце сыворотки крови. Процедура промывания щелочью выполнялась быстро и предпочтительно на холоду, чтобы избежать потери кортикостероидов. Далее экстракт промывали дистиллированной водой, сушили в течение получаса над безводным сульфатом натрия и выпаривали под током воздуха. Сухой остаток растворяли в 60 мкл 10%-ного раствора ацетонитрила для анализа.
Жидкостную экстракцию мочи осуществляли по следующей схеме: 2 мл мочи экстрагировали пятикратным объемом хлороформа, после чего экстракт промывали 1мл 0,1 н водного раствора гидроксида натрия (для удаления более полярных примесей и пигментов, присутствующих в пробе) и 2 мл дистиллированной воды. Органический слой высушивали в течение получаса над безводным сульфатом натрия и выпаривали под током воздуха. Сухой остаток растворяли в 60 мкл 10%-ном растворе ацетонитрила для анализа.
Количественный анализ проводили методом стандартной добавки. Расчет концентраций определяемых стероидов осуществляли с помощью компьютерной программы Мультихром. Для учета ошибки прибора использовался метод внешнего стандарта; в начале каждого рабочего дня хроматографировалась тестовая смесь кортикостероидов. Отношение площади тестового пика определяемого стероида в день калибровки к площади тестового пика в день анализа учитывалось при расчете концентраций. Для построения градуировочного графика калибровочные растворы сыворотки крови с добавкой стандартов подвергали той же обработке, что и реальные пробы.
Идентификацию соединений проводили на масс-спектрометре MALDI TOF voyager DE и ЯМР-спектрометре Brtiker DPX - 300. Радиоиммунологический метод количественного определения гормонов. Количественное определение содержания альдостерона, активности ренина плазмы (АРП), адренокортикотропного гормона (АКТГ) в сыворотке крови проводили радиоиммунологическим методом с помощью стандартных тест наборов фирмы Cis Bio International. Активность измеряли на у-счетчике Tracor Analy tic - 1190. Забор крови для определения АКТГ и ангиотензина-1 проводили в охлажденную пластиковую пробирку с консервантом ЭДТА, центрифугирование проводили в рефрижераторной центрифуге при t=+2C. Метод РИА основан на способности специфических белков связывать меченые гормоны и включает образование специфического прочного комплекса между белком и меченым соединением, вытеснение гормона из комплекса тождественным ему немеченым соединением, разделение свободной и связанной форм этого комплекса, выявление зависимости между количеством немеченого соединения и количеством связанной радиоактивности. Абсолютное содержание гормона определяли по калибровочной кривой, построенной по радиоактивности стандартных разведений гормона. Иммуноферментные методы анализа (ИФА). Иммуноферментный анализ проводили с помощью стандартных тест-наборов. Оптическую плотность измеряли на анализаторе STAT FAX - 2100 (США). Определяли следующие показатели: 1. Кортизол (К), тестостерон (Т), лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), дегидроэпиандростерон; сульфат (ДГЭА-С) определяли с помощью стандартных наборов фирмы Алкор БИО (Россия). 2. Свободный тестостерон (FT), 5 х-дигидротестостерон (ДГТ), дегидроэпиандростерон (ДГЭА), А4-андростендион (Ан), 17 гидроксипрогестерон (17-ОНП), глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ), инсулин, С-пептид, инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1) определяли с помощью наборов фирмы DRG International. Для оценки состояния системы гипофиз-кора надпочечников определяли базальный уровень кортикотропина (АКТГ) в 8 ч, суточный ритм секреции кортизола в крови в 8ч (Ку) и 20ч (Кв), выполняли пробу на подавление выработки кортизола с дексаметазоном. Определяли среднесуточную величину кортизола - Кср = (Ку+ Кв) / 2. Оценка показателя, отражающего отклонение циркадного ритма секреции кортизола, рассчитывалась по следующей формуле: коэффициент ритма (критма) = (Кв/Ку)хЮО.
Функциональные пробы с дексаметазоном. Дексаметазон, синтетический глюкокортикоид, тормозит секрецию кортикотропина в аденогипофизе, вследствие чего снижается уровень кортизола в сыворотке крови. Больным с инциденталомами коры надпочечников и больным с ожирением с розовыми стриями проводили функциональную проба с дексаметазоном. Использовалась «малая дексаметазоновая проба» с 2 мг дексаметазона [3].
Малый дексаметазоновый тест (с 2мг дексаметазона) используется для диагностики эндогенного гиперкортизолизма (тест отрицательный). У здоровых людей и при алиментарно-конституциональном ожирении тест положительный, прием дексаметазона приводит к снижению уровня кортизола в 2 и более раз от фонового содержания гормона [287]. На основании согласительного симпозиума в октябре 2002 г. в г. Анкона, Италия [118] явный синдром иценко-Кушинга исключается при подавлении уровня кортизола на пробе с дексаметазоном в утренние часы 50 нмоль/л.
