Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии 14
1.1.1. Сканирующая туннельная микроскопия 15
1.1.2. Атомно-силовая микроскопия 16
1.1.3. Артефакты зондовой микроскопии и способы их учёта 22
1.2. Применение СЗМ для исследования биополимерных объектов 24
1.2.1. Строение и состав биополимеров 25
1.2.2. Биополимеры бактериальных клеток 27
1.2.3. Биополимеры вирусных частиц 31
1.2.4. Белки и нуклеиново-белковые комплексы 34
1.2.5. Нуклеиновые кислоты 40
2 Экспериментальная часть
2.1. Применение АСМ для исследования пилей цианобактерий 45
2.1.1. Одноклеточная цианобактерия Symchocystis sp 45
2.2. Материалы и методы 46
2.3. Результаты и обсуждение 47
3. АСМ-исследования рибонуклеопротеидов 53
3.1. Изучение особенностей адсорбции ВТМ на слюду и графит 53
3.1.1. Введение 53
3.1.2. Материалы и методы 54
3.1.3. Результаты и обсуждение 55
3.1.4. Выводы 61
3.2. Изучение белка р50 и его комплексов с РНК 62
3.2.1. Введение 62
3.2.2. Материалы и методы 69
3.2.3. Результаты и обсуждение 70
4. Зондовая микроскопия ДНК 77
4.1. Материалы и методы 77
4.2. Результаты и обсуждение 78
4.3. Выводы 86
5 Теоретическая часть
5.1. Микромеханика РНК 87
5.2 Задача восстановления реального профиля объекта по АСМ-изображению 91
Заключение 94
- Применение СЗМ для исследования биополимерных объектов
- Нуклеиновые кислоты
- Изучение белка р50 и его комплексов с РНК
- Результаты и обсуждение
Введение к работе
Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) — относительно новая группа методов исследований свойств объектов различной природы с высоким пространственным разрешением. История СЗМ началась с изобретения в 1981 году сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) [1], Его изобретатели - швейцарские ученые Герхард Бинниг и Хайнрих Рорер - были отмечены Нобелевской премией по физике за 1986 год. Создание в том же году атомно-силового микроскопа [2], использующего в своей основе детектирование обменного взаимодействия атомов, значительно расширило применение зондовой микроскопии, так как на изучаемые образцы перестало накладываться условие их электрической проводимости. Разрешение таких микроскопов достигает доли нанометров, что позволяет наблюдать атомы. Получением изображений не ограничиваются возможности этих приборов. Например, с помощью атомно-силового микроскопа можно изучать взаимодействие двух объектов: измерять силы трения, упругости, адгезии, а также перемещать отдельные молекулы и атомы [3, 4], осаждать и удалять их с какой-либо поверхности.
Зондовая микроскопия помогает решать фундаментальные и прикладные задачи в физике, химии, биологии, медицине. В настоящее время СЗМ имеет более двух десятков модификаций и уже прочно вошла в арсенал физических методов, использующихся при изучении различных биологических объектов, прежде всего биополимеров и биополимерных структур. Общее для всех этих приборов является то, что заострённый зонд как-либо взаимодействует с поверхностью, и детектируется величина этого взаимодействия. При движении зонда относительно поверхности количественная величина взаимодействия меняется, что и позволяет восстанавливать форму поверхности с помощью физических законов и математических алгоритмов. Важными преимуществами этих методов по сравнению с традиционными методами электронной микроскопии являются возможность получения трехмерных изображений с разрешением вплоть до атомного, относительная простота приготовления образцов (например, не требуется контрастирования атомами тяжёлых металлов), отсутствие необходимости создания вакуума во время сканирования, возможность проводить исследование объектов в жидкости, в частности, изучать биологические объекты in vivo и др.
В данной работе представлены результаты исследований с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) двух наиболее важных классов природных биомакромолекул, белков и нуклеиновых кислот, а также комплексов и структур на их основе. Более точно, объектами изучения являлись одноклеточные цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 и
их пили - белковые отростки, с помощью которых они осуществляют движение к источнику света (или от него); вирус табачной мозаики (ВТМ), представляющий по сути самоорганизованную смесь РНК и белка; белок р50 и матричные рибонуклеопротеиды (мРНП) - структуры, присутствующие в каждой клетке и играющие важнейшую роль в её жизни; молекулы плазмидной ДНК.
Разработка новых способов секвенирования ДНК, создание биологических контейнеров для доставки лекарств в организм, разработка живых векторных вакцин, -вот далеко не полный перечень актуальных на сегодняшний день вопросов, для решения которых необходимы такие исследования. Изучение поведения биополимеров и биополимерных комплексов на поверхности подложки и особенностей их адсорбции востребовано для развития молекулярной электроники и дизайна молекулярных архитектур. Не менее актуально в настоящее время и решение фундаментальных проблем, связанных с изучением механизма трансляции в эукариотических клетках. Актуальность АСМ-исследований цианобактерий и их пилей (отростков) связана с тем, что цианобактерий используются как модельный объект для молекулярно-генетического изучения фотосинтеза растений.
Широкий спектр возможностей, предоставляемый зондовой микроскопией для изучения биополимеров, от получения трехмерных изображений до исследования локальных свойств объекта обуславливает большое количество работ по этой тематике, публикуемых ежегодно в ведущих научных журналах.
Большая часть результатов, получаемая с помощью АСМ, требует глубокого статистического анализа, для некоторых же из них бывает необходима дополнительная интерпретация с помощью компьютерного моделирования. В данной работе вопросами, рассмотренными теоретически, были моделирование молекулы РНК, адсорбированной на подложке, и анализ одного из артефактов АСМ - эффекта уширения. Поскольку моделирование этих процессов производилось исходя из достаточно общих предпосылок, полученные результаты применимы и за пределами данной работы.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационной работы было получение на основе экспериментов по зондовой микроскопии новых данных о биополимерах (нуклеиновых кислотах, белках) и их комплексах, а также разработка методики исследования ДНК с помощью сканирующей туннельной микроскопии (СТМ).
В соответствии с поставленной целью решаются следующие задачи исследования:
Охарактеризовать состоящие из белковых молекул пили (отростки) одноклеточной цанобактерии Synechocystis sp, РСС 6803, выяснить связь их морфологии, количества и геометрических характеристик с наличием фототаксиса.
Изучить особенности адгезии и адсорбции одного из представителей самого высокоорганизованного рибонуклеопротеида - вируса табачной мозаики (ВТМ) — на поверхностях слюды и графита, разработать новые методы нанесения частиц ВТМ для исследования в жидкости.
Охарактеризовать комплексы белка р50 и матричной РНК (мРНК) при различных массовых соотношениях белка к мРНК.
Разработать методику нанесения ДНК на подложку из графита для последующего решения задачи сканирующей туннельной микроскопии ДНК на графите, а также построить модель заряженной линейной полимерной молекулы, адсорбированной на подложку в условиях гидродинамического потока.
Научная новизна диссертации
L. Показана связь различных характеристик пилей с наличием или отсутствием фототаксиса, детально охарактеризованы пили одного из штаммов цианобактерии Synechocystis sp.
Впервые показаны некоторые особенности адгезии частиц ВТМ на поверхностях слюды и графита, разработаны способы модификации слюды для АСМ вирусов.
Впервые получены данные по морфологии и размеру комплексов белка р50 с мРНК при различных массовых соотношениях белка к мРНК, которые объясняют особенности трансляции в эукариотических клетках.
Разработан ряд методик иммобилизации биополимеров на проводящую подложку, позволяющих проводить СТМ-исследования ДНК.
Впервые адсорбция расправленной молекулы РНК на подложке интерпретирована с помощью модели заряженного биополимера, помещенного в гидродинамический поток.
Практическая значимость работы
Результаты диссертации позволяют продвинуться в решении следующих задач:
- создание новых прямых методов секвенирования ДНК на основе СТМ ДНК
на графите;
создание резистентных иммунной системе контейнеров для доставки лекарств на основе искусственных рибонуклеопротеидов;
определение разновидности штамма цианобактерии по её пилям (дополнительный критерий);
манипулирование отдельными молекулами ДНК, например, для молекулярного дизайна.
Кроме того, особенности и закономерности адсорбции частиц ВТМ на подложку, без сомнения, могут быть использованы в решении задач молекулярной электроники. Стоит также отметить, что результаты диссертации могут быть полезны в физике биополимеров, биофизике, молекулярной биологии и медицине.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях и школах:
Международный биофизический конгресс - 2005, Монпелье, Франция;
- научная школа NATO ASI «Functional Properties of Nanostructured Materials»,
Созополь, Болгария, 2005;
научная школа NATO ASI «From Cells to Proteins: Imaging Nature across Dimensions», Пиза, Италия, 2004;
Ill Международный симпозиум «Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур», Казань, Россия, 2004;
IV Международная конференция «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии», С-Петербург, Россия, 2004;
Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным
наукам «ЛОМОНОСОВ-2004», «ЛОМОНОСОВ-2005», Москва, Россия,
2004,2005;
научная школа NATO ASI "Soft Condensed Matter Physics in Molecular and
Cell Biology", Эдинбург, Великобритания, 2004;
Международная конференция «STM-2003», Эйндховен, Нидерланды, 2003;
Международная конференция «SPMP 2003», Керкраде, Нидерланды, 2003;
Международная конференция «SPM 2003», Нижний Новгород, Россия, 2003;
Конференция студентов и аспирантов, Дубна, Россия, 2002;
Международная конференция «SPM 2002», Нижний Новгород, Россия, 2002.
Личный вклад автора
Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии выполнены автором лично.
Автор принимал участие в приготовлении образцов бактериальных клеток, вирусов, нуклеиновых кислот, белков и их комплексов совместно с сотрудниками биологического факультета МГУ им. М.В, Ломоносова, НИИ ФХБ им. Белозерского, Института Белка РАН, ИБХ им. Шемякина и Овчинникова.
Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 работ.
Применение СЗМ для исследования биополимерных объектов
Высокое разрешение АСМ наряду с её широким спектром возможностей при исследовании поверхностей сделали эти методы привлекательными для изучения различных биологических образцов, что привело к созданию и развитию специальных методик и протоколов работы для АСМ биообъектов. Основными преимуществами АСМ по сравнению с традиционными методиками электронной микроскопии, такими как сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) и просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), являются возможность получения трёхмерных изображений, относительная простота приготовления образца (например, не требуется таких процедур, как ультрамикротомия, контрастирование атомами тяжёлых металлов), отсутствие необходимости создания вакуума во время сканирования, возможность проводить исследование объектов в жидкости, в частности, изучать биологические объекты in vivo, и ДР- В настоящем разделе особое внимание уделено применению АСМ к двум важнейшим классам биополимеров, белкам и нуклеиновым кислотам, а также бактериям, вирусам и нуклеиново-белковым комплексам. 1,2.1. Строение, состав и основные функции биополимеров Биополимеры - высокомолекулярные природные соединения, являющиеся структурной основой всех живых организмов и играющие определяющую роль в процессах жизнедеятельности. К биополимерам относятся белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды; известны также смешанные биополимеры - гликопротеиды, липопротеиды, гликолипиды и др. [18]. Нуклеиновые кислоты - высокомолекулярные соединения, образованные остатками нуклеотидов. Различают два главных типа нуклеиновых кислот дезоксирибонуклеиновые кислоты, или ДНК, в состав которых входит дезоксирибоза, а в качестве азотистых оснований аденин, гуанин, цитозин и тимин, и рибонуклеиновые кислоты, или РНК, в состав которых входит рибоза, а в качестве азотистых оснований аденин, гуанин, урацил и цитозин (рис. 1.9). Биологическая роль нуклеиновых кислот заключается в хранении, реализации и передаче наследственной информации, "записанной" в молекулах нуклеиновых кислот в виде последовательности нуклеотидов - т. н. генетического кода. При делении клеток -митозе - происходит самокопирование ДНК - её репликация, в результате чего каждая дочерняя клетка получает равное количество ДНК, заключающей программу развития всех признаков материнской клетки.
Реализация этой генетической информации в определённые признаки осуществляется путём биосинтеза молекул РНК на молекуле ДНК (транскрипция) и последующего биосинтеза белков с участием разных типов РНК (трансляция). Белки (или протеины) состоят из остатков 20 аминокислот, которые соединены пептидными связями в длинные цепи (рис. 1.10). Белки (ферменты и др.) осуществляют обмен веществ и энергетические превращения, неразрывно связанные с активными биологическими функциями. Белки входят в состав сложных клеточных структур -органелл. И хотя орган еллы содержат также другие вещества, белки особенно важны; они - основные структурообразователи и играют ведущую роль в выполнении физиологических функций. Примером клеточных органелл, изучаемых в данной работе, являются пили цианобактерий Synechocystis, состоящие из белка пилина. Последовательность остатков аминокислот (в случае белков) или нуклеотидов (в случае нуклеиновых кислот) определяет первичную структуру этих молекул. Кроме первичной, различают также вторичную структуру биополимеров. Она образуется благодаря возникновению системы водородных связей между комплементарными основаниями (у ДНК и РНК) или между С=0 группами остова полипептида с H-N группами своего или другого остова (у белков). Укладка вторичных структур одной поли пептидной цепи в глобулу называется третичной структурой, а объединение нескольких белковых цепей в "суперглобулу" называется четвертичной структурой белка [19]. Молекулы белка в структурном отношении бесконечно разнообразны - жёсткость и точность уникальной организации сочетаются в них с гибкостью и пластичностью [18]. 1.2.2. Биополимеры бактериальных клеток Поскольку АСМ обладает молекулярным разрешением для биологических поверхностей [20], она является перспективным методом, позволяющим исследовать особенности структуры поверхности бактерий различных таксономических групп при решении фундаментальных и практических задач физики биополимеров, биологии и медицины [21]. К настоящему времени с помощью АСМ охарактеризованы несколько десятков различных штаммов бактерий, среди которых Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Helicobacter pylori, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium longum, Arthrobacter globoformis, Bacillus sphaericus [22], Staphylococcus aureus [23], Bacillus cereus, Streptococcus pyogenes [24] и др. В данном разделе представлен обзор тех работ по АСМ бактерий, в которых особое внимание уделялось изучению белковых или полисахаридных поверхностей клеток. Нанесение бактериальных клеток на подложку для АСМ. В силу большого разнообразия бактериальных клеток, универсальной методики приготовления образцов бактерий не существует. Не только для разных видов, но и зачастую для двух разных штаммов одного и того же вида, например, различающихся по возрасту, требуется разработка своих уникальных методик их нанесения на подложку. Ниже описаны наиболее распространённые подходы к решению этой задачи. В качестве подложек чаще всего используются поверхности слюды, графита (как свежесколотые так и модифицированные), стекла, а также полистирольных или миллипоровских фильтров [25]. 5-10 мкл суспензии, содержащей бактериальные клетки концентрацией 108-10 /мл, наносят на выбранный субстрат и оставляют на несколько минут для адсорбции [21].
Точное значение концентрации и времени адсорбции зависят от свойств бактерии и подбираются в каждом случае индивидуально. Для АСМ-экспериментов на воздухе образцы оставляют высыхать при нормальных условиях. Приготовленные таким образом образцы можно исследовать с помощью АСМ даже спустя несколько лет - бактериальные поверхности хорошо сохраняются. Изучение in situ бактериальных клеток, которые помещали в водную среду после кратковременного высушивания, показало, что высушивание не уничтожает их [26]. АСМ-исследования в жидкой среде требуют более прочной иммобилизации бактерий на поверхности субстрата, для чего необходима её модификация. Чаще всего для этих целей проводят обработку поверхности пол и катионами или наносят на нее агар [27] или MRS (Man, Rogosa, and Sharpe) бульон [26]. Захват клеток порами мембран Millipore [28, 29] - ещё одна альтернативная техника, позволяющая готовить образцы для изучения с помощью АСМ. Хотя использование такого метода и не позволяет измерять высоты клеток, приводя к потере части топографической информации, он является наиболее удобным для проведения силовых измерений, определения механических и адгезивных свойств клеток. Наиболее распространённый вид поликатионной обработки - нанесение слоя поли лизина. В этом случае 10 мкл 10 гМ раствора полилизина наносят на свежесколотую слюду и оставляют до полного высыхания [30]. Полилизин адсорбируется на слюду и равномерно покрывает её поверхность, образуя монослой, состоящий из плотно упакованных глобул с шероховатостью 1,0 - 1,5 им. Модифицированная описанным способом поверхность слюды не является подходящей для разрешения отдельных молекул с помощью АСМ, но является достаточно гладкой для исследования клеток. Так как полилизин является биосовместимым материалом, он не должен влиять на бактерии. Модификация слюды полилизином использовалась при исследовании морфологии поверхности двух штаммов Е. Coli (JM 109 и К. 12 J62) [30]. Похожая техника фиксации бактерий на обработанной полилизином поверхности стекла была удачно применена при АСМ-исследовании Е. coli DH5a и Listeria ivanovii CIP 7842T как на воздухе, так и в растворе [31]. Ещё одно поликатионное покрытие для стекла - обработка полиэтиленимином - может быть использовано для исследования E-coli в жидкости в режиме контактной моды АСМ [32]. Для получения агарного покрытия [27] 200-500 мг раствора агара в 2-5 мл воды нагревали до полного растворения, после чего каплю этого раствора наносили на свежесколотую слюду и выдерживали 5-10 минут. Затем на поверхность субстрата наносили каплю суспензии, содержащей бактерии.
Нуклеиновые кислоты
Прямой и быстрый анализ отдельных макромолекул на уровне их первичной структуры, например секвенирование нуклеотидной последовательности ДНК, является достойной целью науки о полимерах. Исследование генетических молекул является едва ли ни самой важной задачей зондовой микроскопии биополимеров, поскольку с разрешением загадок, которые таит в себе молекула ДНК, связывают прорыв в современной науке, который в частности должен привести к улучшению социальной жизни человека [83]. В конце 1980-х начале 90-х годов зондовая микроскопия ДНК столкнулась с рядом проблем и затруднений. Сначала появился ряд публикаций, посвященных сканирующей туннельной микроскопии ДНК [16, 84-88], в которых авторы получали изображения молекулы нуклеиновой кислоты и различали отдельные пуриновые основания [85], элементы двойной спирали ДНК в разных формах или, по крайней мере, тип спирали и её периодичность [16, 84, 86-88]. Наибольшие затруднения при СТМ-исследовании ДНК на поверхности графита вызывали сложность иммобилизации на неё ДНК и предположительно низкая проводимость самой молекулы [85, 86, 88]. Вышеперечисленные факторы наряду с низкой воспроизводимостью полученных результатов и, как правило, отсутствием контрольных экспериментов поставили под сомнение возможность визуализации молекулы ДНК с субмолекулярным разрешением с помощью СЗМ. Кроме того, последовали работы [17], в которых методом СТМ было показано наличие «ДНК-подобных» дефектов на поверхности графита, наиболее часто используемой для туннельной микроскопии подложки. Так и оставшись нерешённой, проблема СТМ ДНК на проводящих подложках была вытеснена задачей АСМ ДНК на слюде, которая стала быстро развиваться в последнее десятилетие. После того, как молекулы ДНК стали надежно визуализировать с помощью атомно-силового микроскопа [89, 90], исследования ДНК с помощью СТМ практически прекратились. Проблема СЗМ-секвенирования ДНК оказалась отодвинутой на будущее, и теперь для её осуществления возлагают надежды на крио-АСМ - атомно-силовую микроскопию при низких температурах [91], а также крио-СТМ. В последние годы, благодаря совершенствованию этих методик, вновь начали появляться работы по СТМ ДНК.
Недавно было получено атомное разрешение на олигомерных молекулах ДНК, иммобилизованных на поверхности меди Cu(lll), с помощью СТМ при низких температурах (80К) и в ультравысоком вакууме (КГ10 Торр) [92]. В настоящее время существует немного типов подложек, используемых для атом носи ловой микроскопии (АСМ) ДНК. Самая распространенная - слюда - легко скалывается, образуя обширные участки атомарно-гладкой поверхности, покрытой ионами К+ или Na+ (для мусковита поверхностная плотность ионов 0,57 К+/км3), которые в воздухе электрически нейтрализуются отрицательным зарядом алюминиево-кремниевой решётки. Недостаток слюды как подложки состоит в том, что она не достаточно инертна: в воде ионы К+ (или, соответственно, Na ) диссоциируют с поверхности, что приводит к возникновению отрицательной поверхностной плотности заряда 0- ,=-0,0025 Кл/мг или 0,015 еЫм2 при нейтральном рН [93], которая препятствует адсорбции на нее одноименно заряженных молекул, в частности, молекул ДНК и РНК. Поэтому для нанесения нуклеиновых кислот на слюду её модифицируют либо ионами двухвалентных металлов [94, 95], либо производными силанов [61, 96, 97], либо специальными расправляющими агентами [98-100]. Кроме того, химический состав слюды может различаться для разных образцов, что делает эксперименты не всегда воспроизводимыми и затрудняет сравнение результатов, полученных в разных лабораториях. Наконец, подложки из слюды лишь ограничено применимы для СТМ [8,9,101]. На лишенной всех этих недостатков подложке из высокоориентированного пиролитического графита молекулы ДНК зафиксировать крайне трудно. В течение последних двух лет эта проблема начала решаться, и в настоящий момент разработан метод модификации графита с помощью нанесения на него раствора алкиламинов (СНз(СН2)иЫН2, п=П) в хлороформе. После высыхания на графите образуется монослой алкиламина, который схематично показан на рис. 1.11 (молекулы располагаются аминогруппами друг к другу). Иммобилизация ДНК происходит благодаря электростатическому взаимодействию разноимённо заряженных остова молекулы и функциональных групп молекул в монослое. Интересно, что адсорбированные на такую поверхность молекулы ДНК могут легко передвигаться типом атомно-силового микроскопа с одного места на другое [3]. Это говорит о достаточно слабой адгезии ДНК к поверхности. Молекула РНК, будучи в отличие от ДНК однонитевой, легко переходит во вторичную структуру, образуя многочисленные шпильки [102]. Поэтому на АСМ-изображениях она обычно выглядит в виде «звездочки» [79, 80]. В работе [48] был разработан способ, с помощью которого удалось расправить молекулы РНК, получив их на АСМ-изображениях в виде нитей. Во всех упомянутых работах, где не оговаривалось иное, в качестве подложки использовалась слюда (как модифицированная так и свежесколотая).
Размеры молекул ДНК и РНК на АСМ-изображениях обычно завышены в поперечном направлении и занижены по высоте. Первое связано с так называемым эффектом уширения [98, 59], имеющим место из-за конечного радиуса острия зонда, а второе - со взаимодействием молекул с подложкой [103]. Большое значение для верной трактовки получаемых изображений имеет изучение процессов адсорбции биологических образцов. Адсорбцию заряженного монослоя из раствора на слюду хорошо объясняет теория ДЛФО (Дерягина, Ландау, Фервея, Овербека) [93]. Согласно этой теории, общая сила, управляющая адсорбцией, складывается из электростатической силы отталкивания и вандерваальсовой силы притяжения: подложки и образца, а и 0 - поверхностные плотности заряда образца и подложки соответственно, ее и є0 - диэлектрические проницаемости раствора электролита и вакуума, Дс - дебаевский радиус, На - константа Гамакера. Адсорбция монослоя на заряженную подложку происходит, когда вандерваальсово притяжение начинает доминировать над электростатическим отталкиванием. Так как дебаевский радиус зависит , const _.„,., от концентрации электролита ес как AD =—: [93], то это происходит при концентрации электролита ес Єсо, где eCQ — некоторая критическая концентрация, при которой 1/ 1 = 1 1- Данная теория к адсорбции отдельных молекул применима лишь на качественном уровне. При адсорбции молекулы из капли раствора на плоскую подложку, она переходит из трехмерного состояния в двумерное. Потеря одной степени свободы сильно уменьшает количество энергетически выгодных конфигураций молекул на подложке. Существует два противоположных по смыслу способа адсорбции [95]: молекулы могут уравновеситься на подложке как в двумерном растворе перед тем, как зафиксируются на поверхности, или они не успевают уравновеситься на подложке, а сразу ей «захватываются». Во втором случае результирующая конформация молекулы напоминает собой проекцию истинной трехмерной конформации на плоскость подложки. Поскольку длина молекулы остается неизменной при таком переходе, то контуры молекулы на поверхности будут отличаться от строгой математической проекции. Меняя условия нанесения ДНК на слюду [95], можно получить как один из описанных, так и любой промежуточный случай адсорбции молекул. Например, отсутствие промывания образца при приготовлении часто приводит к адсорбции как из двумерного раствора [95]. Наряду с проблемой иммобилизации молекулы ДНК на подложку, важное значение имеет задача осаждения макромолекул на поверхность подложки в заданной конформации. Ранее в различных целях уже было предпринято несколько попыток осуществления контроля конформации молекул.
Изучение белка р50 и его комплексов с РНК
В 1964 году А.С. Спирин и сотрудники обнаружили, что на ранних стадиях развития зародышей рыб, когда синтез рибосомных РНК полностью отсутствует, вновь синтезированная мРНК не поступает в полисомы, а накапливается в виде комплексов с белками в форме рибонуклеопротеидных частиц. Эти частицы седиментировали при центрифугировании в градиенте сахарозы в виде ряда дискретных пиков с коэффициентами седиментации от 20 до 70S [127]. После фиксации формальдегидом и центрифугирования в градиенте CsCl до равновесия частицы распределялись в менее плотной зоне градиента, чем рибосомы. Величина плавучей плотности основного плотностного компонента этих частиц оказалась равной 1,4 г/см3, что соответствовало соотношению белок/РНК около 3:1 [128], т.е. существенно выше, чем у рибосом. Плавучая плотность частиц и, следовательно, соотношение белок/РНК, не зависели от их коэффициента седиментации, т.е. от размера РНК. Был сделан вывод, что белок в этих частицах более или менее равномерно распределен по длине РНК [129,130]. Несмотря на высокое содержание белка, РНК в обнаруженных частицах оказалась чрезвычайно чувствительной к действию эндорибонуклеаз, что свидетельствовало об ее поверхностном расположении. Сами частицы, в отличие от рибосом, оказались устойчивыми к удалению Mg2+. Поскольку эти частицы содержали высокомолекулярную гетерогенную по размеру нерибосом ну ю ДНК-подобную (информационную) РНК, для их обозначения был предложен термин информосомы [131]. В дальнейшем эти частицы стали называть матричными рибонуклеопротеидными частицами или, сокращенно, мРНП. В настоящее время это название стало общепринятым. Последующие работы, проведенные в разных лабораториях мира, показали, что вся нетранслируемая мРНК в цитоплазме самых разных эукариотических клеток из различных тканей и организмов находится в форме мРНП с перечисленными свойствами [128, 132-137]. Был сделан вывод, что информосомы являются универсальной формой существования свободной нетранслируемой мРНК в эукариотической клетке [131, 82]. Более того, не только нетранслируемая свободная мРНК, но и мРНК в составе полисом также оказалась в комплексе с белками и освобождалась после диссоциации рибосом в форме мРНП с близкими физикохимическими свойствами [138, 134, 136, 139]. Соответственно, цитогтлазматические мРНП стали разделять на свободные, нетранслируемые в данный момент мРНП, и транслируемые полисомные мРНП.
Цитоплазматические мРНП из различных источников характеризуются целым рядом общих свойств [82, 140]. Такими свойствами являются: 1) присутствие мРНК как основного компонента; 2) постоянное весовое соотношение белок/РНК, равное 3 для свободных мРНП и 2 для полисомных; это обуславливает уникальную плавучую плотность в CsCl, равную 1,39 -1,4 г/см3 для свободных мРНП и 1,45 г/см3 для полисомных транслируемых мРНП; 3) широкое седиментационное распределение, отражающее гетерогенность мРНК по размерам в большинстве клеток; линейная корреляция между коэффициентом седиментации частиц и мРНК, причем коэффициенты седиментации мРНП превышают коэффициенты седиментации мРНК в 2,5 - 3 раза; 4) чрезвычайно высокая чувствительность мРНК в составе мРНП к зндорибонуклеазам, свидетельствующая о поверхностном расположении мРНК в частицах. После обнаружения цитоплазматических мРНП основные усилия были направлены на разработку методов их выделения из различных источников и анализ их белкового состава. Было установлено, что мРНП из клеток различных тканей и организмов содержат два мажорных белка с молекулярными массами 49-56 кДа и 68-78 кДа [141, 142, 82, 143]. Эти белки были названы р50 и р70, соответственно. Кроме них мРНП содержали несколько минорных белков, набор которых мог различаться в зависимости от источника получения. Соответственно, с полной уверенностью к «истинным» мажорным универсальным белкам мРНП были отнесены только два: р50 и р70. Было установлено, что белок р70 связан с поли(А)-хвостом мРНК и обнаруживается только в полисомных мРНП [144-146]. Поэтому, р70 был назван поли(А)-связывающим белком, или сокращенно РАВР. Интенсивные исследования этого белка, начатые еще в середине 80-ых годов, продолжаются и в настоящее время. Интерес к белку р50 возник только в начале 90-ых годов, поскольку было показано, что он может ингибировать трансляцию мРНК в ретикулоцитах кролика [147]. Этот интерес обострился, когда выяснилось, что р50 принадлежит к мульти функциональному семейству белков, содержащих домен холодового шока [148, 149]. Мажорный белок цитоплазматических мРНП р50 Первые надежные сведения о р50 содержатся в ранних работах по анализу белков цитоплазматических мРНП из полисом ретикулоцитов млекопитающих (кролик) [142] и птиц (утка) [141, 150], очищенных методом центрифугирования в градиенте сахарозы. Белок р50 в этих препаратах обнаруживался как мажор, наряду с РАВР. Последующий анализ белков препаратов полисомных и свободных мРНП показал, что белок, совпадающий по электрофоретической подвижности при SDS-гель электрофорезе, обнаруживается как мажорный компонент в свободных и полисомных мРНП самых разных клеток млекопитающих [151,145]. Было также замечено, что в полисомных мРНП р50 присутствует наряду с другим мажорным белком РАВР, в то время как в свободных мРНП р50 является единственным доминирующим по количеству белком [152, 147], и его содержание в расчете на единицу массы мРНК в этом случае примерно вдвое превышает его содержание в полисомных мРНП [147, 153]. Таким образом, переход мРНК из свободного нетранслируемого состояния в полисомы сопровождается диссоциацией примерно половины р50 и присоединением РАВР. р50 оказался белком, наиболее прочно ассоциированным с мРНК.
Он в значительной степени сохранялся на мРНК в 2М NaCl, в условиях, когда РАВР полностью диссоциировал. р50 удалось отделить от мРНК только в З М LiCl. Этот белок имеет очень высокую изоэлектрическую точку около 9,5 и содержит большое количество Arg, Gly и Pro [153,149]. Было показано, что р50 влиет на активность мРНК в трансляции в бесклеточной системе: он стимулировал трансляцию при сравнительно низком соотношении р50/мРНК, близком к этому соотношению в полисомных мРНП, и сильно ее ингибировал при более высоких значениях этого соотношения, характерных для свободных мРНП [147, 154, 155]. Строение белка р50 Белок р50 и его ближайшие гомологи состоят из трех доменов (рис. 3.11). На N-конце находится небольшой домен, богатый аланином и пролином (А/Р-домен), далее идет домен холодового шока (CSD), а за ним протяженный С-концевой домен, состоящий из чередующихся кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислот, с размером каждого кластера примерно в 30 остатков. А/Р-домен может, по-видимому, влиять на внутриклеточную локализацию CSD-белков, так как недавно было показано, что он содержит участок связывания актина [156]. CSD способен специфично и неспецифично связывать ДНК [157, 158] и РНК [159, 160] и, вместе с С-концевым доменом, может влиять на распределение р50 между ядром и цитоплазмой в зависимости от стадии клеточного цикла [161]. CSD-домен состоит из пяти Р-тяжей, уложенных антипараллельно в р-баррель, на концах которого располагаются петли, соединяющие Р-тяжи (см. рис. 3.11). В CSD имеется два консенсусных мотива из 8 и 6 аминокислотных остатков, богатых ароматическими аминокислотами, названных РНП1 и РНП2. Наличие в каком-либо белке этих двух мотивов или хотя бы консенсуса РНП1 позволяет с большой вероятностью утверждать, что белок может связываться с РНК [162]. Мотивы РНП1 и РНП2 находятся на р2 и рЗ-тяжах CSD домена, соответственно. Характерной особенностью этого домена является присутствие чередующихся кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков (по четыре кластера каждого знака) и большое количество пролиновых остатков.
Результаты и обсуждение
Нами были разработаны методы модификации поверхности ВОПГ, позволяющие иммобилизовать на неё молекулы ДНК для исследования методами зондовой микроскопии. При химической модификации ВОПГ в жидкой среде окисление происходит только на дефектах кристаллической решётки, тогда как остальная часть поверхности остается немодифицированной. Так как количество дефектов ограничено, степень модификации оказывается достаточно низкой. Увеличение же количества дефектов приводит к г Данная работа выполнена совместно с лабораторией СЗМ Университета Наймегена, Нидерланды. деградации поверхности и делает невозможным исследования на ней биологических объектов с помощью АСМ и СТМ. Исходя из этих соображений, нами было предложено несколько способов модификации графита в парах различных алкановых производных, имеющих функциональные группы. Наиболее прочное связывание ДНК оказалось с поверхностью графита, модифицированного в тлеющем разряде в присутствии паров пентиламина (см. пункт 1 раздела «Материалы и методы»). Такая модификация оставляет поверхность достаточно гладкой - её шероховатость составляет 0,2-0,5 нм, а перепады высот-0,4-1 нм. Типичное АСМ-изображение молекул ДНК, адсорбированных на поверхности модифицированного графита на воздухе, представлено на рис. 4.1. Значение дисперсии для длины молекулы составляет 3-6 %, что свидетельствует о том, что они расправлены на подложке. Такие молекулы пригодны для картирования ДНК. АСМ-изображения молекул ДНК, иммобилизованных на поверхности графита напоминают их изображения на слюде (рис. 4.2), однако высота и ширина молекул различается для этих двух субстратов (см. таблицу 4.1): в случае ВОПГ ширина молекулы меньше, чем в случае слюды (все измерения ширины проводились на полувысоте). Высоты же молекул на изображениях, полученных на графите (1,6±0,3 нм), ближе к нативному диаметру двойной спирали ДНК in vivo (2 нм), чем на изображениях, полученных на слюде (0,7±0,1). Так как мы использовали одинаковые кантилеверы и режимы работы микроскопа для обеих подложек, мы объясняем такое различие влиянием подложки на ДНК: на поверхности слюды молекулы ДНК становятся более Как отмечалось выше, слюда приобретает отрицательный заряд в растворе, молекулы ДНК тоже отрицательно заряжены. Поэтому для иммобилизации молекул ДНК на слюду становится необходима модификация ее поверхности или присутствие двухвалентных ионов [94, 95].
Предлагаемый метод позволяет наносить молекулы ДНК без присутствия двухвалентных ионов. Это значительно расширяет его применение для исследования ДНК и ДНК-белковых комплексов. АСМ-изображения молекул ДНК, адсорбированных на модифицированную поверхность ВОПГ из раствора тридистилированной воды (с низкой ионной силой) визуально похожи на изображение, представленное на рис, 4.1, но контурная длина в этом случае на 8-20 % меньше, чем при адсорбции на слюду или графит из раствора 40 мМ NILtAc 10 мМ MgCb. В работе также была исследована модификация поверхности графита в парах стеариновой кислоты (СНз(СНг)]бСООН), додециламина (C12H25NH2) и октацециламина (C18H37NH2). По аналогии с вышеописанным способом модификации было предположено, что такая модификация также приведет к увеличению шероховатости поверхности, что позволит осаждать на нее ДНК для изучения методами зондовой микроскопии. Кроме того, стояла задача понять, как именно происходит модификация на молекулярном уровне. Для решения этой задачи применялась низкотоковая сканирующая туннельная микроскопия. Напомним, что использующийся в качестве подложки ВОПГ представляет собой слоистый кристалл, поверхность которого имеет гексагональную кристаллическую структуру. СТМ-изображение поверхности графита с атомным разрешением и схематическое изображение структуры графита представлено на рис. 4.4. Было известно, что стеариновая кислота, нанесенная из геля на поверхность графита, образует самоорганизующийся монослой вблизи поверхности [8], однако сам гель, находящийся на поверхности, имеет большую толщину и распределен неравномерно. Нами было обнаружено, что на поверхности ВОПГ, модифицированной в парах стеариновой кислоты (см. Материалы и методы) образуется похожий монослой (рис. 4.51), который не разрушается при воздействии на него водного раствора, что является важным аргументом для нанесения на него ДНК из раствора. Внешне похожие монослои образуются на поверхности графита также при модификации в парах додециламина и октадециламина (рис. 4.6). Алкановые производные самоорганизуются на поверхности кристалла в монослои, в которых углеводородные цепочки ориентируются вдоль кристаллографических осей подложки параллельно друг к другу, в то время как концевые группы выстраиваются в линию, образуя прямолинейные бороздки (рис. 1.11). Эти бороздки являются разделительной полосой, отделяющей ряды функциональных групп молекулы, которые могут быть как положительно так и отрицательно заряжены, от рядов гидрофобных углеводородных цепочек. На рис. 4.7а представлены АСМ изображения молекул ДНК, адсорбированных на модифицированной в парах октадециламина поверхности ВОПГ. Иммобилизация молекул ДНК на монослой алкиламина становится возможной благодаря электростатическому взаимодействию разноименно заряженных цепей ДНК с бороздками функциональных групп монослоя. Для того чтобы последовательно растянуть две молекулы на подложке с помощью атомно-силового микроскопа, кантилевер был приведен в контакт с подложкой во внутренней части кольца плазмидной ДНК, а затем перемещался во внешнюю по отношению к этому кольцу сторону. Последующее сканирование в режиме прерывистого контакта демонстрирует результат растягивания молекул ДНК (рис. 4.7, а-д).
Образцы ДНК, адсорбированные на поверхность ВОПГ, позволяют изучать их с помощью низкотоковой СТМ. К сожалению, туннельная микроскопия не позволяет так же тщательно отслеживать силу воздействия зонда на образец, как атомно-силовая микроскопия. Из формулы (1.1) легко получить характер зависимости зазора между зондом и образцом от плотности туннельного тока j, и напряжения и,: s ln(u,/j,). Для минимизации силы воздействия зонда на образец необходимо увеличивать величину этого зазора, а значит по возможности увеличивать напряжение туннелирования и уменьшать туннельный ток. В настоящее время наиболее чувствительные туннельные микроскопы позволяют работать в пикоамперном диапазоне токов при напряжениях порядка 1В и более. СТМ-изображения молекул ДНК, адсорбированных на модифицированном графите, представлены на рис. 4.8. Отдельные молекулы легко передвигались зондом по поверхности, в результате чего в некоторых областях толщина молекулы оказывалась завышенной. На двух последовательных изображениях (рис. 4.8 а,б) видно, как молекулы сметаются зондом и переносятся на новые места. обеспечат новые колоссальные возможности для прямого секвенирования ДНК. Кроме того, свободное манипулирование молекулами на подложке создаст возможность для развития различных двумерных молекулярных архитектур, таких, например, как создание электрических цепей на основе макромолекул. 4.3. Выводы Нами впервые получены СТМ-изображения молекул ДНК, адсорбированных на графите. Для достижения этой цели мы разработали ряд методов модификации поверхности графита, позволяющих производить адсорбцию молекул ДНК на поверхность. Было показано, что молекулы ДНК, адсорбированные на модифицированный графит, имеют размеры, которые ближе к нативным, чем при адсорбции на поверхность слюды. Кроме того, при такой модификации возможно нанесение молекул ДНК на графит из раствора тридистиллированной воды (т.е. без присутствия двухвалентных ионов), что расширяет применение метода для исследования ДНК и ДНК-белковых комплексов. Поверхность графита, модифицированная в парах октадециламина, позволяет манипулировать отдельными молекулами ДНК или их фрагментами с помощью зонда атомно-силового микроскопа, что необходимо при решении различных задач, требующих молекулярного дизайна.
