Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 5
1.1. Полимерные микросферы как носители биолигандов для создания тест-систем 5
1.2. Синтез полимерных суспензий методом затравочной полимеризации 14
Глава II. Экспериментальная часть 37
1 Исходные вещества 37
2 Методы исследования 38
Глава III. Результаты и их обсуждение 46
1. Состояние проблемы по синтезу полимерных суспензий биомедицинского назначения 46
2. Синтез затравочных полистирольных частиц методом полимеризации стирола в отсутствие эмульгатора 54
2.1. Проблемы удаления остаточного мономера из объёма полимерных микросфер 64
3. Затравочная полимеризация мономеров различной природы 69
3.1. Рентгеноэлектронное исследование межфазного слоя полимерных микросфер 90
4. Создание тест-систем на фибронектин 102
5. Получение антительных диагностических тест-систем 116
Заключение 125
Выводы 128
Список литературы 129
- Полимерные микросферы как носители биолигандов для создания тест-систем
- Синтез полимерных суспензий методом затравочной полимеризации
- Синтез затравочных полистирольных частиц методом полимеризации стирола в отсутствие эмульгатора
- Рентгеноэлектронное исследование межфазного слоя полимерных микросфер
Введение к работе
Полимерные микросферы нашли широкое применение в качестве носителей биолигандов при создании диагностических тест-систем, принцип работы которых основан на специфической иммунохимической реакции между антителом и антигеном. В этом случае полимерные микросферы должны содержать на поверхности специальные метки (флуоресцентные, хромофорные), быть окрашенными, иметь функциональные группы для ковалентного связывания с соответствующими группами биолиганда, либо на их поверхности должны содержаться специально добавленные лиганды для аффинного связывания с биолигандом и т.д. Кроме того, они должны обладать биологической, химической и коллоидной устойчивостью в физиологических растворах и биологических средах, иметь узкое распределение частиц по размерам и содержать специфический биолиганд на поверхности в определенной оптимальной концентрации для обеспечения высокой чувствительности реакции.
Сочетание таких свойств требует специального подхода к их синтезу, в процессе которого многие из выше указанных требований должны быть удовлетворены.
Выполнение высоких требований к полимерным микросферам, особенно возросших в последние годы в связи с решением сложных биологических проблем, требует нахождения пути к регулированию формирования состава межфазного слоя частиц, который определяет их устойчивость, возможный способ иммобилизации биолиганда.
Для решения этого вопроса необходимо систематическое исследование свойств частиц полимерных суспензий различной природы и изучение влияния состава их межфазного слоя на устойчивость частиц, иммобилизацию биолигандов и чувствительность биохимической реакции.
4 Цель работы состояла в синтезе полимерных суспензий с определенным
* строением межфазного слоя частиц для их использования в качестве
носителей биолигандов и создания систем различного биомедицинского
назначения.
*
Полимерные микросферы как носители биолигандов для создания тест-систем
Экспресс-диагностика все шире входит в повседневную практическую работу клинико-диагностических лабораторий, вытесняя громоздкие и трудоемкие методы анализа. Наибольшее развитие получили диагностические системы, основанные на реакции латекс- агглютинации, РЛА, протекающей между антигеном и антителом.
Антитела продуцируются в ответ на появление антигенов, обычно белков, являющихся чужеродными для данного организма. Эта нормальная реакция организма привела к созданию иммунологических методов, которые используются для диагностики различных заболеваний и физиологических состояний. Тесты на присутствие ожидаемого белка в биологических образцах проводятся путем добавления в образец антитела, если определяют антиген, или антигена при определении антитела. Если определяемый белок присутствует в тестируемом образце, то возникает реакция антиген-антитело, которая может определяться по преципитации или агглютинации комплекса антиген-антитело. Антиген обычно имеет несколько активных участков для связывания с антителами. Способность антител соединять антигенные частицы в крупные конгломераты обуславливается наличием по крайней мере двух активных центров, расположенных на поверхности молекулы. Одна активная группа соединяется с одной антигенной детерминантой, другая - с аналогичной детерминантой другой антигенной частицы. Наличие двух активных центров у молекул антител обеспечивает возможность соединения неограниченного числа антигенных частиц в конгломераты. При избытке антигена или антитела крупные конгломераты вообще не возникают вследствие заполнения реагирующих участков молекул избыточным количеством второго компонента. Вследствие этого, реакции антиген-антитело максимально проявляются только в определенном диапазоне концентраций обоих реагентов, в так называемой зоне эквивалентности.
Полимерные микросферы обладают рядом преимуществ перед биологическими носителями, которые заключаются в возможности варьировать поверхностные свойства и размер микросфер в широком диапазоне значений с сохранением узкого распределения частиц по размерам, вводить функциональные группы, необходимые для связывания с лигандами на стадии синтеза, в устойчивости при хранении, а также в возможности наполнена микросфер добавками, придающими им новые специфические свойства.
Достоинством полимерных микросфер является и воспроизводим ость их физико-химических свойств в различных производственных партиях, что позволяет стандартизовать полученные тест-системы и производить диагностические наборы в промышленном масштабе. Большое разнообразие свойств полимерных суспензий позволяет иммобилизовать на поверхности полимерных микросфер практически любые биологические вещества, начиная от антител и кончая вирусами, что дает возможность создавать практически любые диагностические тест - системы.
Биологическая инертность полимерных суспензий позволяет полностью исключить возможность перекрестных неспецифических реакций с исследуемыми образцами, а также обеспечивает длительную сохранность готовых тест-систем. Однотипность техники постановки реакции латекс- агглютинации, делает обучение персонала легким и несложным Нельзя не отметить быстроту и удобство остановки реакции (2-10 мин.) отсутствие необходимости в специальном оборудовании и приспособлениях, возможность проведения больших партий анализов, невысокую стоимость и надежность метода. Этот метод позволяет проводить исследование не только в лабораториях, но и в полевых условиях. Для исследований может быть использован любой материал от больных - сыворотка крови, слюна, моча, мокроты и т.д., а также из объектов окружающей среды — вода, смывы, почва, животные, аэрозоли и т.д. Впервые метод латексной агглютинации был предложен в 1956 году [1] и использован для определения ревматоидного фактора с помощью полистироль ных частиц, покрытых у-глобул ином человека. В последующие годы метод латексной агглютинации получил широкое распространение как в клинических диагностических тестах, так и в биохимических и иммунологических исследованиях. Особенно широкое применение РЛА наблюдается в инфекционной иммунологии [2-8].
Исследования по латексной агглютинации диагностических тестов широко освещаются в научной и медицинской литературе [9-23]. Метод РЛА используют в диагностике беременности [24], ревматоидного фактора [21,25,26], холеры [27], туберкулеза [28] и др. При наблюдении реакции ЛА визуальным способом анализ проводят на стеклянных или полистирольных пластинках, в пробирках или 96-луночных микропланшетах с образными лунками, в которых смешивают равные объемы тестируемых сывороток в последовательных двукратных разведениях и латекс-теста и через определенное время (от нескольких минут до 18 часов) наблюдают реакцию. При положительной реакции на пластинках образуются видимые невооруженным глазом агглютинаты, которые затем увеличиваются в размере, а в пробирках выпадает осадок. В микропланшетах агглютинация проявляется в виде равномерного покрытия частицами поверхности лунки, тогда как в контроле на дне лунки образуется точечный латексный преципитат [29].
Главное неудобство визуального наблюдения ЛА состоит в том, что часто бывает трудно точно определить конечную точку агглютинации, так как белый цвет полимерной суспензии или осадка плохо воспринимается глазом. Окрашивание латекса в голубой, красный, желтый, зеленый и другие цвета позволяет преодолеть этот недостаток и облегчает наблюдение РЛА [30-32].
Результат РЛА носит только качественный характер. Для получения полуколичественных результатов - для оценки степени агглютинации используют титры. То есть в реакции агглютинации по выявлению антител количество антител в иммунной сыворотке или в других жидкостях оценивается их титром. Под титром антител понимают то наибольшее разведение сыворотки или иной жидкости, при котором реакция антиген-антитело все еще учитывается.
Для количественной оценки агглютинации применяют различные оптические методы : турбидиметрию [33,34] (по изменению оптической плотности измеряют потерю интенсивности светового луча, прошедшего через суспензию частиц),световое рассеяние, нефелометрию [35,36] (в этом случае анализируется интенсивность света, рассеянного под углом 0 к падающему потоку ( обычно Э 90 ); автоматический иммуноанализ (РАСІА), основанный на подсчете количества полимерных частиц, не подвергшихся агглютинации в процессе реакции, с использованием автоматического счетчика, который считает частицы только в определенном диапазоне размеров, подстроенном под диаметр индивидуальных латексных частиц, и игнорирует частицы большего или меньшего размера [37-39].
Интенсивность рассеянного или проходящего света зависит от многих факторов, в том числе от концентрации, размера и формы частиц. В применении к РЛА эти два метода дают возможность количественного определения степени агглютинации по калибровочным кривым, полученных либо из данных по титрованию, либо из кинетических измерений.
Таким образом, метод латексной агглютинации по чувствительности и специфичности превосходит многие классические серологические реакции и уступает иногда лишь методам "третьего" поколения, например, радиоиммунологическому исследованию. В то же время при тщательной отработке методики получения латексных диагностикумов, соблюдении оптимальных условий их приготовления и постановки самой реакции метод латексной агглютинации по чувствительности и специфичности может приближаться к самым современным иммунологическим методам, в том числе радиоиммунологи- , ческому и иммуноферментному [40-42]. Так, например, растворимый поверхностный антиген гепатита В (HBsAg) и чумного микроба выявляется в конечной концентрации до Ю"4 текограмм/ мл, возбудители чумы и бруцеллеза могут быть обнаружены при концентрации до 10 микрочастиц/мл.
Синтез полимерных суспензий методом затравочной полимеризации
Полимерные суспензии с узким распределением частиц по диаметрам нашли применение в медицине и биологии для создания тест-систем, в которых полимерные микросферы выполняют функции носителя биолиганда. Вопрос о создании дешевого и эффективного метода получения таких суспензий является актуальным. Перспективными методами являются два процесса: безэмульгаторная и затравочная полимеризации. Их выбор среди других способов синтеза полимерных суспензий обусловлен возможностью получать полимерные микросферы с небольшим содержанием эмульгатора, направлено регулировать свойства и строение межфазного адсорбционного слоя частиц. Полимеризация мономеров различной природы в отсутствие эмульгатора подробно описана в обзорах [65-85] и монографиях. Показано, что основной проблемой синтеза полимерных суспензий этим методом является обеспечение устойчивости реакционной системы, полученной полимерной суспензии при хранении и использовании. Практически не описано в литературе затравочная мапоэмульгаторная полимеризация мономеров, поэтому остановимся на ней подробнее. Имеющиеся в литературе данные убедительно свидетельствуют о том, что используя этот метод, путем варьирования природы мономеров и способов их добавления в реакционную систему, можно получить полимерные суспензии с заданным комплексом свойств, которые не могут быть достигнуты традиционной эмульсионной полимеризацией. При затравочной полимеризации мономеров процесс полимеризации локализуют в предварительно полученных затравочных частицах, исключая возможность образования новых частиц. При малоэмульгаторной затравочной полимеризации, с одной стороны, нужно обеспечить устойчивость реакционной системы в процессе, а с другой - не повышать концентрацию эмульгатора.
Одним из путей повышения устойчивости реакционных систем в процессе синтеза полимерных суспензий является использование карбоксильного сомономера, способного при ионизации участвовать в образовании факторов устойчивости в межфазном слое частиц. Для обеспечения высокой концентрации карбоксилатных групп в поверхностном слое частиц было предложено предварительно синтезировать высококарбоксилированный затравочный латекс, а затем провести на его частицах безэмульгаторную сополимеризацию в сочетании с нейтрализацией карбоксильных групп в ходе реакции. Так как затравочный высококарбоксилатный сополимер должен выполнять роль стабилизатора, его поверхностно-активные свойства должны быть максимально приближены к свойствам низкомолекулярных ПАВ. Сравнение сополимеров с алифатическими кислотами, соли которых широко используются в качестве эмульгаторов при эмульсионной полимеризации виниловых идиеновых мономеров, было проведено путем сопоставления их по удельной свободной энергии взаимодействия с водой. AGB=AGn+\GF (і), где AG1 - свободная энергия растворения, кДж/моль, AGW - свободная энергия испарения, кДж/моль, По аддитивности термодинамических параметров функциональных групп органических соединений были рассчитаны значения свободной энергии взаимодействия с водой различных мономерных звеньев. При этом свободная энергия взаимодействия сополимера с водой рассчитывали по формуле: ЛСС = І GN, (2) где AG; - свободная энергия взаимодействия с водой і - го мономерного звена, Ni - мольная доля і - го мономерного звена в сополимере.
Локализация затравочного сополимера в межфазном адсорбционном слое при ориентации карбоксильных групп на границе раздела фаз возможна, если сегменты затравочного сополимера обладают высокой подвижностью. Это достигают регулированием молекулярной массой сополимера на первой стадии полимеризации передатчиком цепи. На примере синтеза затравочного бутадиенметилметалкрилаткарбоксилатного латекса было показано, что оптимальная величина характеристической вязкости растворов сополимера должна находиться в интервале 0,2-0,Здл/г. Полимеризация на первой стадии проводится до 95-100% конверсии первой порции мономеров и получаемый затравочный латекс имеет диаметр частиц в интервале 800-1200 А0. На второй стадии к определенному количеству затравочных частиц добавляют мономеры и проводят набухание затравочных частиц в мономере в течение 30-60 мин., затем добавляют 2-3%-ый раствор щелочи (натриевой или калиевой) из расчета проведения 60-70% - ой нейтрализации карбоксильных групп, т.е. 60-70% эквимолярного количества по отношению к с ополимеризо ванным звеньям метакриловой кислоты. При этом затравочный сополимер переходит на поверхность ПМЧ, а мономер переходит в ядро ПМЧ. После проведения реакции нейтрализации карбоксильных групп, содержание мономеров в ПМЧ увеличивается до такой степени, что его практически не остается в виде отдельной фазы (капель). Содержание эмульгатора в реакционной системе на второй стадии процесса составляет величину порядка 0,3-0,5 масс, в расчете на 100 масс, мономеров. Устойчивость реакционной системы и готового латекса при таком малом содержание эмульгатора достигается в результате локализации на поверхности ПМЧ ионогенных групп макромолекул затравочного сополимера. Легкость перехода молекул затравочного сополимера на поверхность ПМЧ при нейтрализации обусловлена его невысокой молекулярной массой.
Синтез затравочных полистирольных частиц методом полимеризации стирола в отсутствие эмульгатора
Несмотря на то, что метод полимеризации стирола в отсутствие эмульгатора широко используется для синтеза частиц с узким распределением по размерам для применения их в иммуно-химических реакциях и для изучения фагоцитоза, мы не нашли готовых рецептов синтеза полимерных суспензий со средним диаметром частиц -1,5 мкм, которые отвечали бы всем предъявляемым к ним требованиям. В связи с этим возникла необходимость проведения специальных исследований, которые позволили бы найти оптимальные условия их получения. Диаметр частиц в первую очередь зависит от концентрации инициатора и мономера, поэтому исследования были начаты с изучения влияния массового соотношения мономерной и водной фаз, и концентрации инициатора на диаметр частиц полимерной суспензии и устойчивость реакционной системы в процессе синтеза и при хранении. Массовое соотношение мономерной и водной фаз изменяли от 1:3 до 1:20. Рецепты проведения полимеризации приведены в табл. 3.1. Таблица 3.1 Рецепт проведения безэмульгаторных полимеризаций при различном Полимеризацию проводили при 70С в течение 24 часов, при постоянной концентрации инициатора, которая составляла 0.2 % масс в расчете на водную фазу. соотношении фаз, (массовые части) Наименование компонента Наименование полимеризаци и SL-1 SL-2 SL-3 SL-4 SL-5 J Стирол 100 100 100 100 100 Вода 300 500 750 1000 2000 Персульфат калия, % масс. В расчете на водную фазу 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 На рис 3.1. представлены кривые конверсия-время. Как и следовало ожидать, скорость полимеризации возрастает по мере уменьшения объема мономерной фазы. Максимальная скорость полимеризации наблюдается при массовом соотношении мономер/вода, равном - 1:20; минимальная - при массовом соотношении фаз -1:3.
Влияние концентрации инициатора на кинетические закономерности полимеризации стирола в отсутствие эмульгатора изучали при постоянном массовом соотношении мономер/вода, равном 1:5. Концентрацию инициатора, при прочих равных условиях изменяли в интервале от 0,1 до 0,4 % масс в расчете на водную фазу.
Как и следовало ожидать, при увеличении концентрации инициатора скорость полимеризации возрастает. Максимальная скорость полимеризации наблюдается при концентрации инициатора, равной 0.4 % масс в расчете на водную фазу. При этой концентрации инициатора образуется устойчивая полимерная суспензия, что обусловлено увеличением содержания концевых ионогенных групп полимерных цепей, фрагментов молекул инициатора, в адсорбционном слое полимерных микросфер.
Электронные микрофотографии полученных полимерных суспензий, данные по значениям диаметров частиц, их распределению по размерам и ,-потенциалу приведены на рис.3.4-3.6. Видно, что с увеличением концентрации инициатора размер частиц уменьшается. Наибольший диаметр частиц, равный 1,6 мкм, наблюдается в полимерной суспензии, полученной при минимальной концентрации инициатора, равной (0.1 %) в расчете на водную фазу, однако полимерная суспензия полученная в этих условиях, неустойчива .
Видно, что с увеличением концентрации инициатора размер частиц уменьшается. Наибольший диаметр частиц, равный 1,6 мкм, наблюдается в полимерной суспензии, полученной при минимальной концентрации инициатора, равной (0.1 %) в расчете на водную фазу, однако полимерная суспензия полученная в этих условиях, неустойчива .
Malvern Instruments Ltd, Malvern UK+44 1684 892456 Таким образом, при выбранных условиях проведения полимеризации максимальный диаметр частиц, равный 1,06 мкм., был получен при концентрации персульфата калия, равном 0,2 % масс, в расчете на водную фазу. Эти частицы полистирольной суспензии были использованы в качестве затравочных при затравочной полимеризации различных мономеров.
Для облегчения дальнейших исследований в этой области была создана простейшая математическая модель процесса безэмульгаторной полимеризации стирола. Исходные данные, взятые для построения модели были: (соотношение фаз: 0,333 -0,05; концентрация персульфата калия: 0,1 ч-0,4% массовых на воду). С помощью этой модели возможно предсказать основные свойства полимерной суспензии.
Рентгеноэлектронное исследование межфазного слоя полимерных микросфер
Компонентами рецепта синтеза полимерных суспензий являются ДСН, стиролсульфонат натрия, ионогенные сульфонатные группы которых, ориентируясь на границе фаз, обеспечивают формирование электростатического фактора стабилизации. Кроме того, концевые сульфатные группы молекул инициатора также принимают участие в его формировании. Количество ДСН и персульфата калия в рецептах синтеза полимерных суспензий составляло 2,4 и 0,31 м.ч. в расчете на полимер. Стиролсульфонат натрия добавляли на стадии затравочной полимеризации и его концентрация была равна 3 м.ч. в расчете на полимер. Согласно спектральным исследованиям в поверхностных слоях полимерных микросфер содержится сера. Интенсивность пиков серы для всех частиц примерно одинаковы, за исключением полимерных микросфер, полученных в присутствии ПДС (SSL-33). Для них наблюдается наименьшая интенсивность пика серы примерно в 3 раза. Так как энергия связи для серы составила 169 эВ, что соответствует группе SO3H, был сделан вывод о том, что основной вклад в формирование электростатического фактора стабилизации вносят именно эти группы, а сульфатные группы персульфата калия дополнительный, но гораздо меньший. Падение интенсивности пика серы для полимерных микросфер, полученных в присутствии кремнийорганических ПАВ, SSL-33, можно объяснить присутствием в межфазном адсорбционном слое частиц полидиметилсилоксана, который экранирует сульфонатные группы, располагаясь вдоль межфазной поверхности в виде спиралей или зигзагов с гидрофильными участками, обращенными в воду, снижая в этом случае роль электростатического фактора устойчивости.
Рентгеноспектральний анализ показал наличие в межфазном адсорбционном слое частиц, полученных в присутствии полидиметилсилоксана (SSL-33), наличие кремния. Для создания структурно-механического фактора устойчивости в межфазном слое частиц при синтезе полимерных суспензий SSL-30, SSL-31, SSL-32 добавляли поливинилпирролидон, в количестве 1 м.ч. в расчете на полимер. Рентгенэлектронные спектры подтверждают наличие азота в поверхностном слое для всех частиц. При этом пик интенсивности во всех случаях составил примерно одинаковую величину, т.е. количество ПВП на поверхности частиц во всех исследованных образцах примерно одинаково, что согласуется с условиями их синтеза.
По условию синтеза полимерных суспензий SSL-30, SSL-31, SSL-32 (табл.3.10.) на поверхности частиц должны быть функциональные 0=0 группы молекул акролеина. Массовые части акролеина составляли 3 и 9 м.ч. в расчете на полимер. Рентгеноспектральный анализ показал, что концентрация С=0 групп в межфазном адсорбционном слое частиц SSL-30 и SSL-31, содержащих и не содержащих краситель, соответственно, резко различаются. В окрашенном образце, SSL-30 она почти в 10 раз выше, чем в неокрашенном. Причиной этого является присутствие на поверхности частиц красителя, который содержит С=0 группу в своей структуре. При этом выделить альдегидные группы акролеина не представляется возможным. Из сравнения спектров для полимерных суспензий SSL-30 и SSL-31 следует, что основной вклад в содержание С=0 групп вносит краситель.
Содержание С=Ю групп в образце SSL-32 составило наибольшую величину (21%) - практически в 1,5 раз больше, чем в образце SSL-30 и в 14 раза чем в образце SSL-31. Согласно рецепту массовое соотношение акролеина в синтезе полимерных микросфер SSL-32 в 3 раза выше, чем в окрашенном SSL-30 и в неокрашенном SSL-31 (9 и 3 м.ч. в расчете на мономер). Таким образом спектральный анализ подтверждает увеличение содержания функциональных групп С=0 на поверхности.
В случае частиц полимерных суспензий, синтезированных в присутствии пол идимети л сил океана (SSL-33), спектр также показал на присутствие С=0 групп, но так как акролеин в процессе синтеза этих частиц не добавляли, можно предположить, что информация об этих группах поступает от карбоксильных групп, содержащихся в полидиметилсилоксане.
Информационная глубина исследуемой поверхности полимерных микросфер составила 10 нм. Следовательно, полученную информацию о поверхности можно считать достоверной.
Таким образом, межфазный адсорбционный слой частиц содержит компоненты, каждый из которых придает определенные свойства этому слою. Полученные результаты доказали присутствие тех компонентов в поверхностном слое полимерных микросфер, содержание которых предполагалось на поверхности в нем согласно заданным условиям синтеза частиц и поставленным к ним требованиям,
У всех полимерных суспензий в межфазном адсорбционном слое обнаружены функциональные группы соединений, обеспечивающие как электростатический и структурно-механический факторы стабильности: сульфонатные группы во всех частицах, азот в случае частиц SSL-30, SSL-31, SSL-32 и ПДС в случае SSL-33. Следовательно, на поверхности частиц совместно работают два фактора стабилизации - электростатический и структурно-механический, а сочетание этих двух факторов стабилизации позволяет обеспечить высокую устойчивость полимерных микросфер в процессе полимеризации и при хранении, при иммобилизации на поверхность частиц биолигандов, в растворах электролитов, сохранение узкого распределения частиц по размерам после окрашивания суспензий, что отвечает требованиям, поставленным к полимерным суспензиям, используемым в иммунодиагностике. Также подтверждено наличие функциональных групп на поверхности частиц, необходимых для ковалентного связывания биолигандов.
