Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор и основные методы, использованные в работе 19
Раздел 1.1. Номенклатура и конформационный анализ полисахаридов .19
Раздел 1.2. Статистика и молекулярная гидродинамика линейных полимеров -..26
Раздел 1.3. Двойное лучепреломление в потоке растворов полимеров ив полимерных пленках 69
Раздел 1.4. Основные методы исследования полисахаридов, использованные в работе 75
Глава 2. Исследование гидродинамических и молекулярных свойств линейных полисахаридов 84
Раздел 2.1. Исследования целлюлозы в прямом растворителе железовинно-натриевом комплексе ...85
Раздел 2.2. Конформационные характеристики гепарина, изученные методами молекулярной гидродинамики и рассеяния рентгеновских лучей ...114
Раздел 2.3. Исследование синтетического поливинилсахарида -полиметакрилоилглюкозамина ...132
Раздел 2.4. Равновесная жесткость цепей линейных полисахаридов и нормированные скейлинговые соотношения 142
Глава 3. Концентрационная зависимость коэффициента седиментации и седиментационный параметр ps ...153
Раздел 3.1. Скейлинговое соотношение между концентрационным седиментационным коэффициентом ks и коэффициентом седиментации s0 153
Раздел 3.2. Седиментационный параметр 156
Раздел 3.3. Возможности применения седиментационного параметра :..162
Глава 4. Двойное лучепреломление в растворах и в пленках полисахаридов 171
Раздел 4.1. Динамическое двойное лучепреломление некоторых полисахаридов и оптическая анизотропия глюкопиранозного кольца 171
Раздел 4.2. Двойное лучепреломление в пленках полисахаридов и ориентационный порядок вблизи поверхности раздела фаз .186
Глава 5. Молекулярная гидродинамика дендримерных молекул . ...199
Раздел 5.1. Образцы дендримеров и дополнительные методы их исследования 202
Раздел 5.2. Гидродинамический инвариант дендримерных молекул .217
Раздел 5.3. Средняя плотность дендримерного вещества в объеме, ограниченном дендримерной молекулой 218
Раздел 5.4. Сравнение гидродинамических характеристик и объем, занимаемый лактозными группами в лактодендримерах 220
Заключение 229
Литература... 232
Приложения
- Статистика и молекулярная гидродинамика линейных полимеров
- Конформационные характеристики гепарина, изученные методами молекулярной гидродинамики и рассеяния рентгеновских лучей
- Седиментационный параметр
- Двойное лучепреломление в пленках полисахаридов и ориентационный порядок вблизи поверхности раздела фаз
Введение к работе
Полисахариды являются одним из важнейших классов биополимеров наряду с нуклеиновыми кислотами и белками. Полисахариды или углеводсодержащие биополимеры играют разнообразную роль в природе и в живом организме, они составляют основную массу органического вещества биосферы.
Однако наше понимание молекулярных и конформационных свойств полисахаридов ограничено по сравнению с такими биополимерами как белки и нуклеиновые кислоты, для которых особенности молекулярной архитектуры и ее связи с биологическими функциями в настоящее время достаточно хорошо изучены и продолжают интенсивно изучаться. Это отставание в изучении полисахаридов и относящихся к ним классов гликополимеров частично обусловлено тем, что эти молекулы труднее охарактеризовать в связи со структурной неоднородностью и молекулярной полидисперсностью. Следует признать, что до последнего времени важность исследования полисахаридов была принижена по сравнению с изучением белков и нуклеиновых кислот. Вместе с тем, полисахариды давно используются как полупродукты для многих многотоннажных технологий: производство бумаги, вискозного волокна, пороха, желирующих компонент для пищевой промышленности и т.д. В последнее время полисахариды приобретают все большее значение в медицине, пищевой и фармацевтической науках. Ситуация значительно изменилась не только благодаря возрастающему признанию коммерческой важности полисахаридов в пищевой и фармацевтической пищевой промышленностях (гелеобразователи, загустители, носители лекарственных препаратов), но также благодаря признанию ключевой роли гликополимеров в тонких специфических биологических процессах. Так расположенные на поверхности клетки они определяют специфичность этой поверхности и обеспечивают взаимное узнавание клеток.
7 Например, углеводы определяют групповую принадлежность крови млекопитающих, проявляют себя также на некоторых стадиях сложного процесса оплодотворения. Углеводы являются компонентом многих смешанных биополимеров и биополимерных систем таких как гликопептиды, гликопротеины, лигноуглеводные комплексы и т.д., которые выполняют в организме и в природе сложные и важные функции. "In vivo" полисахариды играют решающую роль в образовании биоструктуры (целлюлоза, пектины, хитин в остове растений или хондроитинсульфаты в хрящах млекопитающих), являются источником энергии в клетке (крахмал, гликоген), биозащитой против механических повреждений (слизи в пищеварительной, репродуктивной и трахеобронхиальной системах и хитины в панцирях ракообразных и насекомых), биологической смазкой (гиалуроновая кислота в синовиальной жидкости), важной составляющей кровеносной системы (гепарин).
Для того, чтобы лучше понять роль полисахаридов и гликополимеров во всех этих явлениях существенно знание их конформаций и таких физических свойств как размеры и распределения по размерам этих макромолекул, особенно в растворах, где проявляются многие из функциональных свойств этих полимеров. Известно, что спектр конформационных состояний, образуемых полисахаридами, является результатом как особенностей первичной структуры (различный тип гликозидной связи, различия в присоединении ОН-групп, присутствие различных заместителей ОН-групп) так и результатом образования спиральных структур с максимально достижимой равновесной жесткостью молекулярных цепей.
Однако, массив экспериментальных данных по гидродинамическим и молекулярным характеристикам, размерам полисахаридных цепей и их коиформационным свойствам относительно ограничен и недостаточно систематизирован. Эти данные могут быть получены наработкой и анализом
8 гомологических рядов полисахаридов (т.е. химически идентичных, но отличающихся степенью полимеризации) в терминах соотношений молекулярная масса/гидродинамические и оптические свойства, а также сравнением этих соотношений для различных рядов полисахаридов с известными и контролируемыми химическими отличиями в главной или боковых цепях. Для получения подобной информации необходимо определение молекулярных масс (седиментационно-диффузионный анализ, светорассеяние, эксклюзионная хроматография) и определение характеристик, связанных с размерами молекулярной цепи в растворах (радиусы инерции макромолекул, коэффициенты поступательной диффузии и скоростной седиментации, характеристическая вязкость). Результатом этих исследований является определение величин контурной длины, а также персистентной длины (длины статистического сегмента Куна) и степени свернутости полимерной молекулы. Кроме того, структурные и конформационные особенности полисахаридов отражаются в таком структурно чувствительном параметре как собственная сегментная оптическая анизотропия. Эта характеристика определяется в экспериментах по динамическому двойному лучепреломлению и зависит от оптической анизотропии повторяющейся единицы и равновесной жесткости цепи.
Наряду с природными полиуглеводами в последнее время синтезируют молекулы, в том числе полимерные, содержащие углеводные мономеры или углеводные фрагменты в цепи. Подобный синтез и изучение его продуктов связаны с задачей получения более совместимых с живым организмом носителей лекарственных препаратов, с моделированием и изучением процессов глико-протеинового узнавания на молекулярном уровне. К числу таких молекул относятся поливинилсахариды. Дополнительная информация о конформационном состоянии природных полисахаридов может быть получена сравнением их
9 поведения с поведением синтетических пол и винил сахарид ов, которые содержат в боковых цепях моносахара. Поливинилсахариды вызывают интерес как модельные полимеры и как полимеры носители.
В последнее десятилетие проявляется большой интерес к синтезу и исследованиям дендримеров - молекул регулярно разветвленной структуры, в том числе гликодендримеров. Регулярная молекулярная структура дендримерных молекул предполагает их применение в различных областях супрамолекулярной химии, катализа и поверхностных явлениях, науки о жизни и материаловедении. К получению и исследованию регулярных дендримерных молекул примыкают исследования гиперразветвленных дендритных систем, получаемых одностадийным синтезом. Природными представителями последних являются полисахариды амилопектин, гликоген, а также полифенольное соединение-лигнин, входящий наряду с целлюлозой в лигноуглвводный комплекс древесины.
Одним из важных применений полисахаридов, в частности производных целлюлозы и хитина, является их использование в мембранных технологиях, играющих важную роль при решении ряда экологических проблем. В связи с этим возникает необходимость количественного изучения процессов упорядочения фрагментов полимерных цепей при образовании пленок и мембран. Процессы такого упорядочения могут рассматриваться как элементарная форма самоорганизации биологических макромолекул. Информативным методом исследования образования упорядоченных слоев на границах раздела фаз является изучение двойного лучепреломления в пленках.
Все это определяет большой и нарастающий интерес к изучению молекулярных и конформационных характеристик углеводсодержащих биополимеров - природных и синтетических полисахаридов.
Целями работы являются: - развитие методических приемов при гидродинамических исследованиях природных и синтетических полисахаридов, учитывающих особенности их строения (гидродинамических методов исследования линейных макромолекул на примере углеводсодержащих полимеров), установление связи между особенностями химической структуры линейных углеводсодержащих полимеров и их гидродинамическими, молекулярными и оптическими свойствами в растворах, установление связи между степенью линейного порядка в макромолекулах полисахаридов и параметром ориентационного порядка в поверхностных слоях пленок, полученных из водных растворов незамещенных полисахаридов, как ряда полимераналогичных структур, установление связи между особенностями архитектуры и химической структуры регулярно-разветвленных молекул-дендримеров и их гидродинамическими характеристиками,
Основные задачи определение методами молекулярной гидродинамики конформационных характеристик молекул природных и синтетических полисахаридов различных классов, установление иерархии нормализованных скейлинговых соотношений (соотношений типа Куна-Марка-Хаувинка-Сакурады) между гидродинамическими величинами и молекулярной массой линейных полимеров, оптимизация учета концентрационных эффектов при скоростном аналитическом ультрацентрифугировании (установление скейлингового соотношения между концентрационным коэффициентом седиментации ks и коэффициентом скоростной седиментации So), введение в экспериментальную практику аналитического ультра центрифугирования нового параметра и демонстрация его использования для определения молекулярной массы линейных макромолекул, в том числе полисахаридов, определение величины собственной оптической анизотропии глюкопиранозного кольца на основе данных по двойному лучепреломлению в потоке, изучение спонтанного двойного лучепреломления в полисахаридных пленках, разделение структурной и ориентационной составляющих поверхностного двойного лучепреломления, установление связи между параметром внутримолекулярного порядка в изолированных макромолекулах (их равновесной жесткостью) и параметром надмолекулярного ориентационного порядка фрагментов полисахаридных цепей в пленках, установление иерархии гидродинамических методов по чувствительности к размерам/молекулярной массе дендримерных молекул и оценка слоевых объемов в исходных и гибридных дендримерах. Научная новизна работы заключается в следующем:
Установлены особенности корреляционных связей между гидродинамическими величинами и молекулярной массой, определены равновесные характеристики для ряда линейных природных и синтетических полисахаридов.
Впервые показано, что аналитические выражения, используемые для оценки равновесной жесткости цепей как с учетом внутриклубковых объемных эффектов, так и в Є-условиях являются подобными (симметричными), что позволяет использовать различные типы построений для получения оценок персистентных
12 длин полимерных цепей.
Нормализация гидродинамических скейлинговых соотношений с использованием массы единицы длины полимерной цепи позволяет располагать макромолекулы по занимаемому ими объему или их размерам. Дальнейшая нормализация с использованием длины сегмента Куна позволяет сводить скейлинговые зависимости гидродинамических величин линейных макромолекул практически в единую кривую. Это означает, что длина сегмента Куна и масса единицы длины являются основными величинами, определяющими гидродинамическое поведение линейных макромолекул в растворе. Следующими по значимости являются внутриклубковые объемные эффекты, проявляющиеся в области больших молекулярных масс, и эффекты внутримолекулярного протекания, проявляющиеся в области малых молекулярных масс.
Установлена скейлинговая связь между концентрационным коэффициентом седиментации ks и коэффициентом скоростной седиментации so, облегчающая учет концентрационных эффектов в скоростной седиментации.
Впервые введен в экспериментальную практику аналитического ультрацентрифугирования новый параметр, продемонстрирована возможность его использования для получения молекулярной информации в случае линейных незаряженных макромолекул, в том числе полисахаридов. Седиментационный параметр является также инструментом для проверки адекватности получаемых экспериментальных результатов в скоростном аналитическом ультрацентрифугировании.
Впервые получены надежные оценки величины собственной оптической анизотропии незамещенных полисахаридов. Это позволило разделить вклады структурной и ориентационнои составляющих в двойном лучепреломлении пленок полисахаридов и оценить величины параметра ориентационного порядка
13 фрагментов полимерных цепей вблизи границы раздела фаз.
Впервые установлена корреляция между линейным порядком в цепных молекулах, характеризуемом равновесной жесткостью, и параметром ориентационного порядка на межфазных границах в полимерных пленках.
Впервые с использованием полного набора методов молекулярной гидродинамики были изучены ряды дендримерных молекул различного строения. Показано, что методы поступательного трения являются наиболее чувствительными методами при исследовании регулярно разветвленных молекул, тогда как характеристическая вязкость практически нечувствительна к размерам и молекулярной массе дендримерных молекул.
Впервые получены экспериментальные оценки гидродинамического инварианта, а также оценки слоевых объемов для рядов генераций различных дендримеров.
Практическая значимость работы определяется тем, что установлены количественные корреляции между химической структурой и равновесными свойствами макромолекул природных и синтетических полисахаридов. Данные могут быть использованы при направленной модификации полисахаридов, поливинилсахаридов имеющих фармакологическое и техническое применения. Установлены количественные взаимосвязи между экспериментальными величинами, измеряемыми при скоростном аналитическом ультрацентрифугировании линейных незаряженных макромолекул, в том числе природных и синтетических полисахаридов. Полученные корреляции между равновесными свойствами цепных молекул и степенью ориентационной упорядоченности вблизи межфазных границ могут быть использованы при производстве полимерных мембран различного назначения, Результаты представляют интерес для биофизики и молекулярной физики
14 высокомолекулярных соединений как существенный элемент формирования общей картины о молекулярных свойствах цепных линейных и регулярно разветвленных макромолекул (дендримеров). Знание равновесных характеристик углеводсодержащих макромолекул (полисахаридов и гликодендримеров) является важным элементом в установлении структуры и механизмов образования углевод-протеиновых комплексов, выполняющих важные функции в живом организме.
Основные положения, выносимые на защиту:
Систематические исследования линейных углеводсодержащих полимеров различного происхождения и строения, позволили определить равновесные свойства линейных цепных молекул в зависимости от вариации их структуры; установить связь физических свойств со структурой повторяющегося звена.
Предложен и опробован алгоритм исследования полисахаридов (полимеров) в комплексных, взаимодействующих с полимером растворителях, позволяющий определять степень связывания низкомолекулярного комплекса с полимером и молекулярные характеристики полимера.
Ступенчатое нормирование скейлинговых соотношений линейных полимерных молекул позволяет классифицировать линейные макромолекулы по их размерам и, прежде всего по величине равновесной жесткости молекулярных цепей, а затем выделить области проявления объемных взаимодействий и внутриклубкового протекания.
4. Установление соотношения скейлинга между концентрационным коэффициентом седиментации и коэффициентом скоростной седиментации в виде ks-YsSt/2*31^5, которое обобщает зависимость для различных молекулярных архитектур, а также в случае различных гидродинамических и термодинамических взаимодействий в полимерных молекулах.
Седиментационный параметр ps=NA[s]ks1/3M"2/3 является новым гидродинамическим параметром (инвариантом), что в некоторых случаях позволяет рассматривать седиментационный параметр не только как инструмент проверки взаимосогласованности экспериментальных данных, но и как способ определения молекулярной массы из гидродинамических данных, полученных в одной серии экспериментов (скоростное аналитическое ультрацентрифугирование). Даны рекомендации по использованию конкретных значений седиментационного параметра для расчета молекулярных масс линейных полимеров.
Собственная сегментная оптическая анизотропия незамещенных однотяжевых полисахаридов прямо пропорциональна равновесной жесткости цепей (в десятикратном интервале изменения длины сегмента Куна). Это означает, что удельная анизотропия в первом приближений не зависит от особенностей структуры полисахаридной цепи.
Знание удельной оптической анизотропии полисахаридных цепей позволило разделить структурный и ориентационный вклады в величину спонтанного двойного лучепреломления, наблюдаемого методом наклонного поляризованного луча в пленках полисахаридов. Наблюдается однозначная корреляция между линейным порядком в полисахаридной цепи и ориентационным порядком в поверхностных слоях полисахаридных пленок.
Выполнены комплексные исследования рядов дендримерных молекул с вариацией концевых групп. Коэффициент поступательного трения сильно зависит от номера генерации дендримера. Установлены корреляции между гидродинамическими характеристиками и молекулярной массой, определены экспериментальные значения гидродинамического инварианта, оценен вклад концевых групп в размеры дендримерных молекул.
Личный вклад автора заключался в выборе главного направления исследований, в постановке и решении конкретных задач, планировании и организации экспериментальных исследований автору принадлежит ведущая роль. Личное участие автора заключается также в проведении экспериментальных гидродинамических и оптических исследований (кроме экспериментов по двойному лучепреломлению в потоке), в анализе и интерпретации результатов, формулировании выводов, написании статей и отчетов. Соавторы принимали участие в проведении экспериментов, а также в обсуждении полученных результатов. Совместно с д.ф.-м.н. профессором С.Я. Френкелем обсуждались постановка работ по использованию концентрационной зависимости коэффициента седиментации для определения молекулярных масс полимеров и совместные публикации. В гидродинамических исследованиях участвовали кандидаты физ.-мат. наук Е.В. Корнеева, Н.А. Михайлова, Е.Б. Тарабукина и ИИ. Зайцева, а также Н.А. Шильдяева. Динамооптические измерения проводили кандидаты физ.-мат. наук Н.П. Евлампиева и Ґ.Ф. Колби на. Измерения двойного лучепреломления в пленках и обсуждение полученных результатов проводилось совместно с д.ф.-м.н. профессором А.Е. Грищенко.
Результаты работы в качестве устных и стендовых докладов были представлены на следующих научных конференциях: 1-ая Республиканская конференция "Мембраны и мембранная технология" (Киев, Украина, 1987); Научном семинаре "Методы исследования целлюлозы" (Рига, Латвия, 1988); 4-ой Всесоюзной конференции по физике и химии целлюлозы (Минск, Белоруссия, 1990); Всесоюзной конференции "Фундаментальные проблемы современной науки о полимерах" {Ленинград, Россия, 1990); Всесоюзной конференции "Химия пищевых веществ. Свойства и использование биополимеров в пищевых продуктах" (Могилев, Белоруссия, 1990); Vllt-ой Всесоюзной научно-технической
17 конференции "Химия, технология и применение целлюлозы и ее производных" (Суздаль, Россия, 1990); IV-ой Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, Россия, 1991); V-oe Всесоюзное совещание "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах" (Иваново, Россия, 1991); Международном Симпозиуме "Строение, гидролиз и биотехнология растительной биомассы" (Санкт-Петербург, Россия, 1992); ХІ-ая Всеакадемическая Международная Школа по Проблемам Метрологического Обеспечения и Стандартизации и (Санкт-Петербург, Россия, 1993); 8th International Celucon Conference (Lund, Sweden, 1993); International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems" (Saint-Petersburg, Russia, 1994); Всероссийской научной конференции "Химия и технология лекарственных веществ" (Санкт-Петербург, Россия, 1994), First International Conference "Polysaccharide engineering" (Trondheim, Norway, 1994); XXVIIth International Carbohydrate Symposium (Ottawa, Canada, 1994); First International Symposium on Polyelectrolytes "Polyelectrolytes in Solution and at Interfaces" (Potsdam, Germany, 1995); IX Symposium on Analytical Ultracentrifugation (Berlin, Germany, 1995); 2"" International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems" (Saint-Petersburg, Russia, 1996); Glikman International Workshop on Structure Formation in Solution and Gels of Food Polysaccharides (Saratov, Russia, 1996); The 4th UK Analitical Ultracentrifuge Users Meeting (Leicester, UK, 1996); Third International Fructan Conference (Utah, USA, 1996); IV International Satellite Meeting "Conformational Studies of Carbohydrates" (La Thuile, Italy, 1996); XVIII International Carbohydrate Symposium (Milano, Italy, 1996); Международной Конференции "Фундаментальные проблемы науки о полимерах" (Москва, Россия, 1997); 9th European Carbohydrate Symposium (Utrecht, Netherlands, 1997); Polysaccharide Biotechnology Meeting (Sutton Bonington, UK, 1997); Xth Symposium on Analytical Ultracentrifugation (Regensburg, 1997, Germany); 4th
18 International Workshop "Carbohydrates as Organic Raw Materials" (Vienna, Austria, 1997); XIX International Carbohydrate Symposium (San Diego, USA, 1998); Xlth Symposium on Analytical Ultracentrifugation (Potsdam, 1998, Germany); 11th International Symposium on Polymer Analysis and Characterization (Santa Margherita Ligure, Italy, 1998); 2-ой Съезд биофизиков России (Москва, Россия, 1999); 1st International Dendrimer Symposium (Frankfurt/Main, Germany, 1999); XX International Carbohydrate Symposium (Hamburg, Germany, 2000); The 6th UK Analitical Ultracentrrfuge Users Meeting (Glasgow, UK, 2000); 11th European Carbohydrate Symposium (Lisboa, Portugal, 2001); Xllth Symposium on Analytical Ultracentrifugation (Duisburg, 2001, Germany); EuroConference "Highly Branced Polymers, Dendrimers, Interpenetrating and LC Polymer Networks" (Helsinki, Finland, 2001); Euroconference "Advances in Analytical Ultracentrifugation and Hydrodynamics. Macromolecular Solution Structure and Interactions in Biological and Synthetic Systems" (Autrance, France, 2002); Xlllth Symposium on Analytical Ultracentrifugation (Osnabrueck, 2003, Germany); 10-ая Всероссийская научно-техническая конференция "Эфиры целлюлозы и крахмала: Синтез, свойства, применение"{Суздаль, Россия, 2003); 12th European Carbohydrate Symposium (Grenoble, France, 2003);Третья Всероссийская Каргинская Конференция "Полимеры-2004" (Москва, Россия, 2004). Диссертация состоит из пяти глав. Каждая глава начинается с небольшого введения, а в конце содержит список работ автора, на основе которых изложен материал главы.
Статистика и молекулярная гидродинамика линейных полимеров
Изложение вопросов, рассматривающих конформационные свойства и поведение макромолекул в растворах, дано в ряде, ставших уже классическими монографиях [23-27], а также в более поздних монографиях [28-36]. Далее будут изложены основные сведения необходимые для обсуждения полученных при изучении полисахаридных цепей экспериментальных результатов.
Одним из основных типов макромолекул являются линейные макромолекулы, состоящие из последовательности большого числа одинаковых или различающихся по химическому строению структурных элементов, соединенных химическими связями в линейную цепь. Важнейшим свойством полимерной цепи является способность к вращению вокруг единичных связей и/или возможность крутильных колебаний в пределах многомерной потенциальной ямы, отражающей зависимость потенциальной энергии внутреннего вращения от углов внутреннего вращения вокруг единичных связей. Это приводит к двум основным механизмам термодинамической равновесной гибкости, характеризующей способность полимерной цепи принимать множество пространственных форм - конформаций: поворотно-изомерный и крутильно-колебательный механизмы гибкости.
В поворотно-изомерной концепции, предложенной М.В.Волькенштейном [24], термодинамическая гибкость полимеров возникает за счет реализации набора разных поворотно-изомерных конформаций цепи. Этот механизм гибкости положен в основу конформационной статистики, теории геометрических, диэлектрических и оптических свойств гибкоцепных макромолекул [27]. В достаточно обширном классе жесткоцепных макромолекул гибкость молекулярной цепи обеспечивается крутильно-колебательным механизмом. В таких полимерах поворотная изомерия отсутствует из-за запретов, налагаемых первичной химической структурой (циклизация, электронное сопряжение) или вторичной структурой (внутрицепные водородные связи). Во всех цепях жесткоцепных полимеров при достаточной длине также появляется термодинамическая гибкость, которая обеспечивается накоплением валентно-деформационных и крутильно-колебательных локальных деформаций вдоль цепи. Крутильно-колебательный механизм гибкости был впервые рассмотрен СЕ. Бреслером и Я.И. Френкелем [37].
Наличие различных механизмов гибкости приводит к тому, что достаточно длинные цепи в растворе принимают конформации статистически свернутого клубка. Модель линейной полимерной цепи из свободно-сочлененных сегментов (модель Куна) хорошо описывает статистические свойства реальных длинных цепей и является простейшей статистической моделью. В этой модели реальная макромолекула заменяется "эквивалентной" цепью, состоящей из N прямолинейных сегментов длиной А, пространственные ориентации которых взаимно независимы. Полная длина эквивалентной цепи L принимается равной длине полностью вытянутой (без деформации валентных углов) реальной цепи (контурная длина) так, что L-NA. Вторым важным условием является требование совпадения начала и конца эквивалентной цепи с началом и концом реальной цепи при любой конформации реальной цепи. Следовательно, длина вектора h, соединяющего концы цепи, имеет одно и то же значение для реальной и модельной цепей. Вектор расстояния между концами цепи h является одной из основных характеристик линейной макромолекулярной цепи, характеризующий размеры свернутой цепи как целого. Статистические свойства цепи в этом случае описываются функцией распределения W(h) по h. Для гипотетической цепи, состоящей из N свободно-сочлененных элементов длиной А, распределение W(h) уже при N 10 оказывается практически гауссовым [24, 25, 28] W(h)dh = (16M)1/2(hm2)-3 2exp(-h2/hm2)h2clh (1.1) где наивероятнейшее значение hm2 =(2/3)NA2. С помощью формулы (1.1) может быть получен любой из моментов распределения hk , определяемый общим соотношением: hk =fW(h)hkdh / JW(h)dh (1.2) При k=2 для среднего квадрата расстояния между концами цепи получаем: h2 =NA2. (1.3) При описании поведения коротких цепей используют модель "персистентной", или червеобразной цепи Кратки-Порода [38]. В основе этой модели лежит цепь длиной L, сочлененная из п прямолинейных элементов длиной AL, так что L=nAL В отличие от свободно сочлененной цепи пространственные ориентации соседних элементов в известной мере передается вдоль по цепи. Корреляция между элементами выражается в том, что среднее значение cosAy =exp(-AL/a), где а длина корреляции, персистентная длина, которая также является параметром жесткости цепи. Для среднего квадрата расстояния между концами червеобразной цепи Породой было получено следующее выражение: h2 /2al_=1-(1-e"x)/x, (1.4) где х=1_/а. Для длинных цепей в пределе х- « получаем h2 0O=2aL, что означает, что при достаточной длине червеобразная цепь становится гауссовой с длиной сегмента Куна А=2а. В цепных линейных макромолекулах корреляция во взаимных ориентациях последовательных звеньев убывает по мере их удаления друг от друга. Мерой расстояния, на котором эта корреляция сохраняется, служит длина сегмента Куна А или персистентная длина а.
Конформационные характеристики гепарина, изученные методами молекулярной гидродинамики и рассеяния рентгеновских лучей
Гепарин является линейным полисахаридом гетерогенным по длине и составу. Структурная формула его повторяющегося звена представлена на рис.2.12. Гепарин принадлежит к семейству глюкозами нот юка нов выделяемых из тканей животных. Рис.2.12. Структура повторяющейся единицы гепариновой цепи. Замести Гепарин хорошо известен как тели статистически распределены вдоль цепи. Ri, R2=H или S03"; ( з=Н, СОСН3 антикоагулянт крови и как или БОз". противотромбозное средство, он также влияет на рост и биологическую активность клеток в культуре [172-177]. Гепарин также часто используют как модель при изучении гепаран сульфата (ГС). ГС содержит все повторяющиеся единицы, содержащиеся в гепарине, однако в ГС встречаются более протяженные сульфатированные и не сульфатированные области [173-175]. Таким образом, гепарин близок по распределению заместителей в цепи к статистическим сополимерам, тогда как гепаран сульфат ближе к блок-сополимерам. ГС находят на поверхности большинства клеток животных или во внеклеточной матрице, и он включен в различные биологические функции посредством взаимодействия с
115 протеинами. Гепаран сульфат регулирует, например, рост клеток, адгезию клеточной поверхности, ее морфологию, липидный метаболизм. ГС стимулирует ответ на вирусную инфекцию [176] и проявляет себя как рецептор для многих патогенов [177, 178]. Часто короткие фрагменты гепарина используют для моделирования взаимодействий ГС с протеинами. Нашей основной задачей является изучение конформационных изменений в полимерных целях при взаимодействиях протеина с гепарином, протеина с гепаран сульфатом. Для этой цели необходимо получить фракции гепарина различной длины и охарактеризовать их в отсутствии протеинов. Биофизическое изучение гепарина в растворах ранее было осуществлено в основном на его коротких по длине фракциях, имеющих клиническое применение [172, 179]. В настоящей работе изучены гидродинамические характеристики и рассеяние рентгеновских лучей фракциями гепарина с целью определения его конформационных параметров.
Изучали Na-соль гепарина, полученного из свиной слизи (Sigma Н-3393, Lot 98Н0713). Элементный анализ образца был осуществлен в "Service Central d Analyse", CNRS, Vernaison, France. Отношение между содержанием серы S=(8.8±0.3)% и азота N=(1.80±0.07)%, было использовано для расчета среднего числа сульфатных групп т=2.14, приходящихся на дисахарид, чему соответствует средняя молекулярная масса дисахарида Мо=580 г/моль.
Образец был расфракционирован методом препаративной гель-проникающей хроматографии в растворе 0.2М NaCl на геле Sepharose CL6B (Pharmacia, Biotech). Высота колонки была 1 м, диаметр - 2.5 см. В колонку помещали 10 см3 раствора концентрации с=20 г/л и элюировали со скоростью 2.5 см3/мин и коллектировали по 5 см3 прошедшего колонку раствора. Было осуществлено разделение четырех порций исходного раствора при идентичных условиях, при комнатной температуре. Фракции, содержавшиеся в 2-3 соседних тубах, объединяли, диализовали против НгО в мешках Spectra-Por 1000Da, а затем лиофилизовали. Таким образом, было получено 14 фракций. Общий выход после фракционирования, диализа и лиофилизации составил 64%. Вес фракций варьировался от 1.5 до 70 мг. Все измерения проводили при 20С в 0.2М NaCI (плотность ро=1.0070 г/см3, динамическая вязкость тю=0.999 сП).
Скоростное аналитическое ультрацентрифугирование осуществляли на Beckman XLI при скорости вращения 0,8-, s 10 с ротора п=57 000 об/мин в двухсекторных ячейках с длиной по ходу луча 12 мм. Границу регистрировали при помощи интерференционной оптики (интерферометр Рэлея).
Инкремент показателя преломления был рассчитан по соотношению Дп/Лс -5.7x10"5(J/c), где J-число интерференционных полос. Для ячейки с толщиной вкладыша 12 мм и при инкременте Дп/Дс=0.1 см3/г концентрации 1мг/мл соответствует 1.75 интерференционной полосы. седиментационных экспериментов в Др103г/см; необходимо знание фактора плавучести или инкремента плотности раствора. - На рис.2.16 представлены результаты измерений плотности растворов гепарина [2 ,1 ..э осуществленные в различных условиях. Не обнаружено отличия в результатах, Рис. 2.16. Определение инкремента плотности Др/Дс гепарина в 0.2М NaCI и в воде при 20С. Др=р-ро, р и ро - плотности раствора и растворителя, соответственно. 1 раствор в 0.2М NaCI до диализа, 2 раствор в 0.2М NaCI после диализа, 3-раствор в дистиллированной и деиониэованной воде. полученных при прямом разбавлении или диализе растворов против 0.2М NaCI, а также полученных при измерениях растворов гепарина в чистой воде. Среднее значение фактора плавучести оказалось равным Др/Дс=(1-иро)= =(0.530±0.008), чему соответствует значение удельного парциального объема и=0.467 см3/г. Это значение также находится в хорошем согласии с 119 литературными данными [184,185]. Таким образом, по результатам седиментационно-диффузионного анализа с использованием полученного значения фактора плавучести были рассчитаны молекулярные массы фракций гепарина, представленные в таблице 2.7. В таблице приведены также значения гидродинамического инварианта и седиментационного параметра.
Седиментационный параметр
Концентрационный коэффициент к5, называемый также коэффициентом Гралена, может быть представлен в общем виде как: K=Bs( h2 yzfM) (3.6), где В8-Вв(а,Х)-безразмерный коэффициент, зависящий от гидродинамического взаимодействия при седиментации ансамбля частиц/молекул и от термодинамического качества растворителя. Следовательно, коэффициент седиментации so (формула Сведберга) и ks различным образом зависят от молекулярной массы и размеров макромолекул. Исключая размер цепи h2 при сопоставлении величин so и ks, получаем: fc-B.iePo-1 = NAIs]k.10M-ae 3.7), где ре - введенный нами седиментационный параметр [84, 85, 238-240]. Уоллесом и ван Холдом было впервые показано [62], что сопоставление величин s0 и ks позволяет оценивать молекулярную массу для полимергомологов. Затем эта возможность обсуждалась также в работе [61]. Введение 157 седиментационного параметра позволяет представить соотношение Уоллеса -ван Холда - Роу в общем виде: Mks NA/f tsfV 2 (3.8) Предпосылкой для введения седиментационного параметра послужило обобщение имеющегося в литературе экспериментального материала (рис. 3.3) для линейных незаряженных полимеров [84, 85].
Используя значения М, определенные одним из абсолютных методов (светорассеяние или седиментационно-диффузионный анализ), а также значения (1-оро) и л.0, на основе значений so и ks можно рассчитать седиментационный параметр 8 s для различных полимерных систем. В тех случаях, когда известно значение гидродинамического инварианта До (или В = Ао/k), седиментационный параметр рассчитывали по соотношению: Bs = 8 (100)1/3 у1 3 = А0 (100)ш у1/3 к"1, где к - постоянная Больцмана, а у= kj[r]]. Вклады погрешностей экспериментальных значений величин ks, М, So, По. (1-иро) в суммарную погрешность В 8 различны и зависят от М. С большей погрешностью определяется значение величины ks, но, поскольку в 8 s эта величина входит в виде кв1/3, ее вклад остается на уровне вкладов погрешностей М и So. В области наибольших погрешностей определения ks и so (область малых значений so, см., например, [241]) относительная погрешность определения единичного значения Bs составляет 20 - 30%.
Анализ, проведенный в работах [84, 85], показал, что экспериментальные значения р s для гибкоцепных полимеров в 8-условиях и для жесткоцепных полимеров остаются практически неизменными во всем интервале значений L/A и d/A. В таблице П3.1 Приложения приведены значения скейлинговых индексов, а также седиментационных параметров р S) рассчитанных для различных полисахаридов. Таблица 3.1 Средние экспериментальные значения параметров ps и Bs Типы полимерных систем Ps 10"7моль"ш Ate 1010 Bsю-23моль 10"7 моль"1/3 АОю10 Гибкоцепные полимеры в 9-условиях 1.0 3.0 1.33 1.08 3.2 Гибкоцепные полимеры в термодинамически хороших растворителях 1.25 3.7 2.61 1.08 3.2 Жесткоцепные полимеры 1.0 3.0 1.33 1.24 3.7 р1-4 глюканы и их производные 1.0 3.0 1.33 1.14 3.4 Глобулярные белки 1.17 3.5 2.14 1.01 3.0 среднеквадратичная погрешность «6/ Ао=кр - гидродинамический инвариа b; VW=k(E нт Мандел Зз/ЮО)1 ькерна- 3Po"1akps;Po=5.1 Флори-Цветковс 1;і-Клениь Средние значения р s (таблица 3.1) для разных групп полисахаридов (целлюлоза, производные целлюлозы в водных растворителях, производные целлюлозы в органических растворителях, другие линейные полисахариды) близки. Можно полагать, что в первом приближении значение р5 не зависит ни от природы заместителей в глюкопиранозном звене, ни от молекулярной массы.
Возможность оценки молекулярных масс по величинам s0 и ks проиллюстрирована нами на примерах растворимых производных хитина (таблица 3.3, таблица П3.2 Приложения), производных целлюлозы и при исследовании фракций гепарина (глава 2).
Обоснованность использования седиментационного параметра при интерпретации данных скоростного аналитического ультрацентрифугирования может быть также продемонстрирована на примере получения количественных оценок длин сегмента Куна, гидродинамических диаметров изучаемых полимеров и сравнения их с соответствующими величинами, получаемыми на основе молекулярных масс, определенных абсолютными методами.
Хитозан был получен из камчатского криля, его степень дезацетилирования (СД) составляет 0,8, чему соответствует ММ повторяющегося звена М0=169. Исследовали растворы фракций ХЗ в растворителе большой ионной силы. Растворителем служил водный раствор СЗЗМСНзСООН+О.ЗМЫаС! В растворителе такого состава полиэлектролитные эффекты подавлены. Характеристики использованного растворителя при 294 К таковы: плотность ро=1,015 г/см3, вязкость го=1 05 мПас. Фактор плавучести был определен пикнометрически (1-иро)-0,38 с относительной среднеквадратичной погрешностью 4,7і 10"2.
Сравнение результатов свидетельствует о близости оценок жесткости цепей, получаемых различными способами. По значениям А прослеживается тенденция увеличения равновесной жесткости цепи с повышением степени нитрации целлюлозы. Полученные оценки свидетельствуют об адекватности способа оценки молекулярной массы по результатам исследования концентрационной зависимости коэффициента седиментации. Аналогичные сопоставления, свидетельствующие об адекватности получаемых оценок, были проведены для нитрата хитина, хитозана, карбоксиметилхитина, гепарина [170, 215, 241].
Таким образом, исследование концентрационной зависимости s в широкой области значений концентраций позволяет надежно определять So и ks. Использование соотношения ks=yssov дает возможность исключить концентрационные эффекты и определить степень в уравнении SQ - KeM1 8. Кроме того, используя среднее экспериментальное значение р s=1,0x107 для линейных поли мергомологов целлюлозы и ее производных можно оценить молекулярные массы фракций и моделирующие параметры макромолекул полимеров.
Двойное лучепреломление в пленках полисахаридов и ориентационный порядок вблизи поверхности раздела фаз
Сложная пространственная организация биологических структур не может быть до конца понята без обсуждения вопросов о поведении биологических макромолекул вблизи межфазных границ, где формируются градиенты различных физических свойств. Одной из количественных физических характеристик молекулярных структур является степень ориентационной упорядоченности молекулярных фрагментов вблизи межфазных границ. Это обстоятельство позволяет рассматривать степень ориентационной упорядоченности как меру способности биологических молекул к самоорганизации. Полисахариды являются одним из компонентов биологических структур, обеспечивающих различные функции живого организма. Одновременно полисахариды являются уникальным полимергомологическим рядом, у которого равновесные характеристики гибкости цепи меняются более чем на два порядка при практическом постоянстве удельной оптической анизотропии цепи (для незамещенных структур). Это позволяет получить новую информацию о связи степени ориентационного порядка на межфазных границах с величинами, характеризующими равновесную жесткость полисахаридных цепей.
Эффективным методом, позволяющим получить количественную информацию о структуре и об ориентации анизотропных элементов полимерных цепей в поверхностных слоях, является метод наклонного поляризованного луча [114]. Метод основан на измерении двойного лучепреломления (ДЛП) при прохождении поляризованного света через пленку под углом к поверхности, отличным от нормального. Для объяснения возникновения ДЛП при таком способе прохождения луча через пленку в работе [112] была высказана гипотеза об ориентационной упорядоченности полимерных цепей вблизи поверхности. Феноменологическая теория поверхностного ДЛП, использующая гипотезу об ориентационной упорядоченности цепей, была впервые дана в работе [113] (см. 1-3.2)
Из формулы (1.88) следует, что коэффициент поверхностного двойного лучепреломления В пропорционален толщине пленки Н. Вывод теории соответствует эксперименту для малых толщин Н. Однако с увеличением толщины экспериментальные значения В достигают насыщения и перестают зависеть от толщины пленок [113, 114, 270, 277]. Это несоответствие теории эксперименту следует из предположения, которое было использовано при выводе формулы (1.88). Предполагалось, что при малых Н параметр ориентационного порядка не зависит от толщины пленки и характеризуется некоторым средним значением S.
Пленки отливали из водных растворов различной концентрации на горизонтальные стеклянные поверхности (без контакта с вертикальными стенками) и высушивали при комнатных условиях. Так при получении пленок из растворов декстрана было установлено, что скорость высушивания с единицы поверхности составляла 3.8 х10"6 г/сх см2. При образовании пленок из растворов декстрана наблюдали спонтанный макроскопический транспорт вещества на периферию пятна раствора/пленки. Испарение растворителя идет со всей поверхности раствора, контактирующего с воздухом, однако пленка начинает формироваться в области трехфазной границы (подложка-раствор-воздух), т.е. в области краевого угла, где скорость испарения растворителя меньше. В эту область происходит спонтанный транспорт полимерного вещества и образующаяся пленка неоднородна по толщине вблизи границы. Область периферии образовавшейся пленки является областью градиента ее толщины. Для исследования из таких пленок вырезали центральную однородную по толщине часть пленки, размер которой обычно был »(20x20) мм2. Толщину пленок измеряли микрометром. При необходимости использовали стопы из нескольких однородных пленок. Толщину пленок из ксантана рассчитывали по формуле H=cm/Qp, где с - концентрация раствора, полная площадь пленки Q, m - масса раствора, распределенного на площади Q, р - плотность полимера. В. этом случае предполагали, что пленка является однородной по толщине. Пленки ГПМЦ готовили из образцов с различными молекулярными массами {Мх10 3= 263; 68; 45 и 31) из водных растворов, помещенных на горизонтальные подложки из стекла или полиметилметакрилата. Толщины пленок варьировали изменением концентрации раствора, а также массы раствора, удерживаемого в определенных границах силами поверхностного натяжения.
Пленки из МЦ с толщиной более чем 0,08 мм (80 цм) обнаруживают макроскопическую регулярную неоднородность/структуру, видимую в отраженном свете и приводящую к сильному рассеянию света и невозможности измерения ДЛП в проходящем свете через пленки таких и больших толщин. Этот эффект макроскопического структурирования связан, по-видимому, с микрофазовой сегрегацией в пленках МЦ, вызываемой балансом взаимодействий гидрофобных и гидрофильных участков макромолекул МЦ. Наличие гидроксипропильных заместителей (один заместитель на 10 вакансий) разрушает микрофазовое структурирование и пленки ГПМЦ остаются прозрачными (не рассеивающими) вплоть до толщин больших, чем 0.2 мм.
Изучение двойного лучепреломления в пленках полисахаридов производилось методом наклонного поляризованного луча. При малых углах падения , как нетрудно видеть из сопоставления уравнений (1.88) и {1.94), должно выполняться соотношение б-Аф-і2. На рис.4.9 представлены первичные экспериментальные результаты измерений, хорошо описывающиеся параболическими зависимостями, которые могут быть преобразованы в линейныезависимости переходом к переменным S=f(2sin2t) (рис. 4.10). Наклон последних в соответствии с соотношением (1.88) позволяет определить коэффициент поверхностного ДЛП В. Сравнение экспериментальных данных показывает, что практически не наблюдается различия в ДЛП пленок ГПМЦ сходных толщин, полученных на стекле и на полиметилметакрилатных подложках, а также для хитозановых пленок, полученных на стекле и полиэтиленовых подложках.
