Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор 6
1.1. Роль микроорганизмов в технологических потоках целлюлозно-бумажных предприятий 6
1.1.1. Роль микроорганизмов и контроля их параметров при биохимической переработке предгидролизатов и сульфитных щелоков 6
1.1.2. Роль микроорганизмов и контроля их параметров при биологической очистке сточных вод. 9
1.1.2.1. Микроорганизмы активного ила 9
1.1.2.2. Нарушение седиментационных свойств активного ила. Виды вспухания 22
1.2. Контроль параметров микроорганизмов в технологических потоках цбп. 35
1.2.1. Контроль параметров микроорганизмов при биохимической переработке предгидролизатов и сульфитных щелоков. 35
1.2.1.1. Оценка физиологического состояния дрожжей. 35
1.2.1.2. Измерение дрожжевой клетки 39
1.2.1.3: подсчет количества почкующихся клеток. 40
1.2.1.4. Подсчет количества мертвых клеток 41
1.2.1.5. Определение биомассы дрожжей весовым методом. 41
1.2.2. Контроль параметров микроорганизмов на сооружениях биологической очистки сточных вод 42
1.2.3. Автоматизированные методы контроля микроорганизмов. 48
1.3. Выводы по аналитическому обзору 50
1.4. Цель и постановка задачи исследования 51
2. Методическая часть 52
2.1. Приготовление препаратов для микроскопирования 52
2.2. Методика количественного определения биомассы дрожжей 52
2.3. Среда разработки программного обеспечения 54
3. Экспериментальная часть 56
3.1. Программно-аппаратный комплекс. 56
3.2. Оценка точности метода определения концентрации дрожжей 61
3.3. Проточная кювета 62
3.4. Термостатируемая кювета 65
3.5. Автоматизированный метод контроля состава активного ила 67
3.5.1. Алгоритм обработки изображения 67
3.5.2. Определение погрешности измерения 70
3.5.3. Выбор оптимального количества измерений 71
3.6. Сходимость результатов метода с балльной системой учета микроорганизмов активного ила 73
3.7. Связь параметров активного ила с показателями работы очистных сооружений 74
3.7.1. Зависимость между бпк5 в фильтрованной пробе и составом активного ила 79
3.7.2. Зависимость между концентрацией активного ила и его составом. 80
3.7.3. Взаимосвязь состава активного ила и илового индекса 81
3.7.4. Зависимость между температурой и составом активного ила 82
3.7.5. Влияние содержания кислорода в очищенной воде на состав активного ила 83
4. Выводы. 85
5. Список использованных источников 86
Приложение. 97
- Роль микроорганизмов и контроля их параметров при биохимической переработке предгидролизатов и сульфитных щелоков
- Контроль параметров микроорганизмов на сооружениях биологической очистки сточных вод
- Методика количественного определения биомассы дрожжей
- Автоматизированный метод контроля состава активного ила
Введение к работе
В целлюлозно-бумажной промышленности микроорганизмы используются на различных стадиях производства. Примерами могут служить биохимическая переработка предгидролизатов, сульфитных щелоков, а также процесс биологической очистки сточных вод [1,2].
Дрожжевое производство имеет ряд особенностей, определяющих своеобразие тех микроорганизмов, которые используются в качестве продуцентов кормового белка. Культура дрожжей, используемая в производстве, должна обладать целым комплексом полезных свойств. Микробиологический контроль на таком производстве играет важную роль. Проводя повседневный контроль состояния и активности производственной культуры, корректируя технологический режим выращивания дрожжей, можно активно участвовать в повышении производительности дрожжевого производства[3].
Микроорганизмы играют определяющую роль в процессе биологической очистки сточных вод. Для характеристики работы сооружений биологической очистки микробиологический анализ имеет существенное значение, поскольку позволяет определять состав, количественное распределение и особенности организмов активного ила (АИ). Микробиологический анализ заключается в оценке состояния и структурных особенностей биоценоза АИ методом микроскопирования. Организмы ила обладают способностью реагировать на состав и свойства очищаемых сточных вод, а также на условия жизнеобеспечения, гарантируемые конструкцией и регулируемые режимом эксплуатации сооружений. Эта реакция выражается качественным изменением и количественным распределением отдельных групп микроорганизмов [4].
Актуальным является совершенствование существующих методов анализа, позволяющее автоматизировать процесс его проведения. При автоматическом подсчете в тысячи раз возрастает скорость интерпретации изображений, что ведет к сокращению продолжительности анализа и повышению его объективности и точности.
В данной работе для качественной и количественной интерпретации изображений, полученных с помощью микроскопа, предлагается использовать компьютерную технику, что позволит получить новые данные о
микробиологических процессах дрожжевого производства и в процессе очистки сточных вод.
Целью работы являлась разработка усовершенствованных методов контроля параметров микроорганизмов в технологических средах ЦБП, позволяющих повысить точность и воспроизводимость получаемых результатов.
В задачи исследования входило:
Разработать автоматизированный метод микробиологического контроля дрожжевой суспензии, обосновать и оценить его эффективность.
Усовершенствовать микробиологический анализ состава активного ила станций биологической очистки сточных вод ЦБП для количественного определения его основных компонентов.
Выявить наиболее характерные взаимосвязи между составом АИ и показателями работы очистных сооружений целлюлозно-бумажных предприятий.
На защиту выносятся:
автоматизированный метод контроля дрожжевой суспензии, основанный на компьютерной интерпретации изображений, предназначенный для определения качественных и количественных характеристик дрожжей;
автоматизированный метод количественной оценки содержания различных морфологических форм микроорганизмов АИ очистных сооружений предприятий ЦБП;
выявленные закономерности между составом АИ и показателями работы очистных сооружений ЦБП.
Роль микроорганизмов и контроля их параметров при биохимической переработке предгидролизатов и сульфитных щелоков
Микроорганизмы появляются всюду, где есть условия, способствующие их развитию, а именно: 1) наличие достаточной влажности; 2) питательные вещества и 3) определенная температура, допускающая проявление жизненной активности. Следовательно, существование микробов определяется внешними условиями. К ним относятся: температура, свет, элементы питания - органогены (С, N, Р, S, Н, О); солевой состав среды, осмотическое давление, поверхностное натяжение и т.д. [5].
Микроорганизмы приспосабливаются к окружающей среде, и всякое нарушение оптимальных условий приводит к подавлению их развития и даже к отмиранию. Губительно действуют на микробную клетку изменение рН среды, нарушение кислородного режима, резкое изменение температуры, истощение питательных веществ, действие прямых солнечных лучей, а также и биологические факторы[6].
Биохимическая переработка веществ, образующихся из нецеллюлозных компонентов древесины в процессе сульфитных варок, имеет большое значение. Основным сырьевым источником для биохимических процессов являются моносахариды сульфитных щелоков. Если учесть значительный прирост моносахаридов при инверсии щелоков от варок целлюлозы высокого выхода, а также то, что специально на образование Сахаров во время сульфитных варок не затрачиваются сырье, химикаты и энергия, так как этот процесс неизбежно сопутствует основному процессу - получению целлюлозы, то становится очевидной экономическая целесообразность и необходимость утилизации всех содержащихся в щелоке Сахаров.
При получении целлюлозы нормального выхода из еловой древесины в равной степени целесообразно перерабатывать гексозы на этиловый спирт, после чего на оставшихся пентозах выращивать белковые дрожжи или выращивать дрожжи непосредственно на щелоках, утилизируя все сахара.
Для щелоков от варок целлюлозы нормального выхода из лиственной древесины и для щелоков целлюлозы высокого выхода, независимо от породы древесины содержащих, в основном, пентозные сахара, углеводную часть сульфитного щелока используют для выращивания дрожжей[3].
В основе получения кормового белка из гидролизатов растительных отходов лежит культивирование определенных микроорганизмов, а именно: аспорогенных дрожжей, относящихся главным образом к роду Candida. Отличительным признаком этих дрожжей является их способность к усвоению пентоз, которые входят в состав гидролизатов и составляют около 30% от общего количества Сахаров, образующихся при гидролизе древесины. Дрожжи используют для роста и синтеза белка различные источники углерода (сахара, органические кислоты), содержащиеся в гидролизате, кислород воздуха, минеральный и органический азот, фосфор и в небольших количествах калий, натрий, железо, магний и кальций.
Дрожжевое производство имеет ряд особенностей, определяющих своеобразие тех микроорганизмов, которые используются в качестве продуцентов кормового белка[7]. Культура дрожжей, используемая в производстве, должна обладать целым комплексом полезных свойств, а именно: активно размножаться на гидролизных средах, полностью используя источники углерода, входящие в их состав; давать высокий выход биомассы, содержащей большое количество полноценного белка и витаминов; обладать большой удельной скоростью роста; быть достаточно устойчивой к вытеснению посторонними микроорганизмами; не обладать патогенными свойствами и т.д. [8].
Микробиологический контроль дрожжевого производства обеспечивается выполнением следующих работ: 1. проведением систематического ежедневного контроля за физиологическим состоянием дрожжей во всех дрожжерастильных аппаратах и своевременным вмешательством в процесс при ухудшении состояния дрожжевых клеток или появлении нежелательных примесей;
2. изучением видового состава микрофлоры, развивающейся в дрожжерастильных аппаратах данного завода, определением процентного соотношения разных культур;
3. выполнением технологических параметров, обеспечивающих оптимальные условия для роста рекомендованной или отобранной на заводе продуктивной культуры.
Микробиологический контроль на таком производстве играет немаловажную роль. Проводя повседневный контроль состояния и активности производственной культуры, корректируя технологический режим выращивания дрожжей можно активно участвовать в повышении производительности дрожжевых производств [5].
Систематический, ежедневный контроль за состоянием микрофлоры -одно из необходимых условий ритмичной работы дрожжевого цеха. Микробиолог с помощью микроскопа может оценить состояние микрофлоры в каждом из работающих аппаратов: отметить физиологическое состояние дрожжей, количество мертвых и почкующихся клеток, наличие ветвистых и одиночных форм, вытянутых или видоизмененных клеток, присутствие посторонних примесей (дрожжей, отличающихся от основной культуры, мицелиальных грибов, бактерий). Отметив нежелательные изменения в состоянии микрофлоры, необходимо проверить выполнение установленного технологического режима выращивания дрожжей и способствовать быстрейшему устранению допущенных нарушений, провести подсев чистой культуры и т.д. [7].
Контроль параметров микроорганизмов на сооружениях биологической очистки сточных вод
Традиционный санитарно-бактериологический анализ на сооружениях биологической очистки включает учет сапрофитных бактерий, растущих на стандартных питательных средах, и определение группы кишечной палочки, что в совокупности характеризует бактериологическое микробное загрязнение очищаемой воды [10,69]. При контроле процесса очистки микробиологический анализ предполагает определение общей численности и морфологического разнообразия бактерий внутри хлопьев активного ила, поскольку бактерии активного ила являются важнейшим компонентом биоценоза, играя ключевую роль в трансформации органического вещества [10]. Общая численность бактерий отражает одну из наиболее существенных характеристик сообщества, поскольку состав микрофлоры и ее количественное распределение тесно связаны с экологической обстановкой в биологических реакторах, с каждым организмом, входящим в состав сообщества активного ила. Описание взаимоотношений между популяцией бактерий и простейших в активном иле - первоочередное условие успешного управления системой биологической очистки.
В то же время, бактерии внутри хлопьев ила практически учитываются довольно редко и, в основном, на очистных сооружениях для характеристики санитарного качества волы определяются сапрофитные виды санитарно-бактериологическим методом посева на питательные среды продолжительностью от 24 до 72 и более часов.
Для бактериологического анализа проба воды отбирается в стерильную посуду и анализируется по возможности немедленно, так как, бактериологическое население может измениться вследствие размножения или отмирания бактерий. Для анализа достаточно 1 мл воды.
Основным требованием бактериологической техники является необходимость работы в стерильных условиях, т. е. посуда не должна содержать ни одной жизнеспособной клетки.
Стерилизация большинства питательных сред производится в автоклавах при нагревании до 120 С в течение 30 или 45 мин или же при 100 С в течение трех дней при экспозиции 30—45 мин ежедневно (дробная стерилизация). Ко времени второго нагревания споры успевают прорасти и отмирают при повторном нагревании. Для жароустойчивых особей проводится третье нагревание.
Бактериологическая посуда стерилизуется в сушильном шкафу при 160 С в течение 2 ч или в автоклаве при 120 С и давлении 1,5 атм. Другие предметы обжигаются в пламени спиртовки.
Определение общего числа бактерий производится путем счета колоний на мясопептонном агаре после выращивания в течение 48 ч при 20—22 С. Подсчет колоний на твердой питательной среде ведется при помощи лупы с увеличением не менее чем в 5 раз. В настоящее время пользуются специальным прибором для подсчета микробных колоний в чашке Петри. На приборе имеется приспособление, куда помещается вверх дном чашка Петри. При включении прибора вся чашка равномерно освещается. Колонии подсчитываются через лупу, укрепленную над чашкой. Умножением полученной величины на разбавление определяют количество бактерий в литре образца воды [86]. Бактерии можно считать и непосредственно под микроскопом. Отмеренная капля исследуемой воды распределяется на определенной площади обезжиренного стекла. Мазок высушивается на воздухе, фиксируется спиртом или в пламени спиртовки и окрашивается 1%-ным раствором эритрозина в 5%-ном растворе карболовой воды. Подсчитывают 20 - 40 полей зрения. По результатам подсчетов определяют среднее содержание бактерий в одном поле зрения. При исследовании неизвестных бактерий используется дифференциальный метод окраски по Граму, заключающийся в окраске микроорганизмов метиловым фиолетовым с последующей обработкой йодом. Окрашенные таким образом бактерии, необесцвечивающиеся спиртом, называют грамположительными, а бактерии, обесцвечивающиеся под действием спирта, называют грамотрицательными. Способность окрашивания по Граму зависит от свойств клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны [87].
Известно, что метод посева на питательные среды учитывает только большинство субстратреагирующих бактерий, поэтому часто, при его использовании, теряется часть t информации о количественных характеристиках микроорганизмов. Для некоторых бактерий не достаточно установленного в методе посева времени инкубирования, а субоптимальная питательная среда и кислородный режим позволяют расти только аэробным бактериям. Часть жизнеспособных бактерий в популяции инертны, но жизнеспособны. - это так называемые "дремлющие" бактерии. Они должны учитываться в активном иле. поскольку при изменении условии или характера загрязнений. - именно им может принадлежать существенная роль в очистке сточных вод. Отсутствие необходимой питательной среды, которая бы поддерживала рост всех жизнеспособных гетеротрофных бактерий, приводит к серьезным ошибкам при использовании метода посева для оценки численности бактерий в активном иле[6].
Кроме проблем, связанных с низкой продуктивностью микрофлоры активного ила на чашках, следует отметить еще и длительное время получения результатов роста бактерий, что делает абсолютно невозможным использование данных бактериологического анализа, полученных методом посева, для оперативного выявления нарушений процесса очистки. Для этой цели пригодны методы прямого микроскопического счета бактерий внутри хлопьев активного ила, которые позволяют получать наиболее точные количественные оценки всей жизнеспособной микрофлоры.
Сущность методов прямого микроскопического учета заключается в том, что численность клеток бактерий, присутствующих в активном иле, определяется путем прямого микроскопирования на мембранных, окрашенных мембранных, ультрафильтрах или на черных ядерных фильтрах, после окрашивания бактерий, с помощью фазового контраста и люминесцентной микроскопии [80]. Этими же методами определяется и биомасса микроорганизмов. Метод основан на способности бактерий поглощать определенные красители, часть из которых активно люминесцирует, в результате чего микроорганизмы приобретают четкие очертания и легко отделяются от частиц активного ила при микроскопическом исследовании.
При ориентировочном просмотре проб можно вести учет частоты встречаемости организмов индикаторов по балльной системе, когда оценивается относительная численность организмов по условной пятибалльной шкале (табл.5). Преимущества - быстрота выполнения анализа (10-15 мин), поэтому использовать этот метод лучше при массовых анализах. Недостаток -субъективность оценки, невысокая точность.
Методика количественного определения биомассы дрожжей
Определение концентрации дрожжей подсчетом в камере Горяева-Тома. Счетная камера Горяева-Тома (рис. 11), представляет собой толстое отшлифованное стекло с тремя выступами. На среднем выступе нанесена микроскопическая сетка. Расстояние между смежными линиями сетки равно 0,05 мм, площадь сетки 1 мм2. Вся сетка разделена на 400 малых квадратов, площадь каждого квадрата равна 1/400 мм . Толщина слоя жидкости между поверхностью сетки и покровным стеклом 0,1 мм3, а объем ее над каждым маленьким квадратиком 1/4 10"3 мм3.
Дрожжевые клетки подсчитывали так: 2 мл испытуемой жидкости, содержащей дрожжи, разбавляли водой в 5-Ю раз для того, чтобы в поле зрения микроскопа было видно от 30 до 60 дрожжевых клеток. Одну каплю разбавленной жидкости с дрожжами помещали на средний выступ поверхности камеры Горяева-Тома, где нанесена сетка, и накрывали ее покровным стеклом, которое плотно прижимали к поверхности камеры для удаления пузырьков воздуха. Покровное стекло должно иметь абсолютно ровную поверхность, без каких-либо изгибов. Счетную камеру помещали на предметный столик микроскопа. Подсчет дрожжей вели с объективом 10х и окуляром хЮ-5-15. При этом увеличении в поле зрения микроскопа помещается не менее 16 малых квадратов, которые обведены утолщенными линиями. Количество дрожжевых клеток, находящихся в 16 квадратах, считали в четырех рядах по горизонтали в каждом квадрате. Подсчет начинали с верхнего левого квадрата, обведенного толстой линией. Дрожжевые клетки, которые пересекаются нижней и левой сторонами квадрата, подсчитывали в смежных квадратах. Для большей точности анализа подсчитывали дрожжи в пяти местах препарата, анализируя четыре квадрата.
Общее количество дрожжевых клеток в суспензии определяли по пяти большим квадратам в двух препаратах. Подсчитанное в каждом препарате количество клеток делили на 80 (16 5=80), получали количество клеток на площади одного маленького квадратика в объеме 1/4000 мм3. В 1 мм3 количество клеток будет в 4000 раз больше.
Программное обеспечение разрабатывалось на основе алгоритма обработки изображений. Данный алгоритм рассмотрен ниже. Для реализации программы была использована среда разработки DELPHI 3.
Delphi - один из самых мощных инструментов разработки программных продуктов любой сложности и направленности. Инструментарий этого пакета позволяет создавать полноценные приложения даже тем, кто имеет минимальный опыт работы с Delphi. Delphi представляет собой интегрированную среду разработки, инструменты которой позволяют значительно ускорить процесс разработки, создания и отладки программ. Среда Delphi - это сложный механизм, обеспечивающий высокоэффективную работу программиста. Delphi - это комбинация нескольких важнейших технологий: Высокопроизводительный компилятор в машинный код Объектно-ориентированная модель компонент Визуальное построение приложений из программных прототипов Компилятор, встроенный в Delphi обеспечивает высокую производительность, необходимую для построения приложений. Этот компилятор в настоящее время предлагает легкость разработки и быстрое время проверки готового программного блока, характерного для языков четвертого поколения и в то же время обеспечивает высокое качество кода.
Автоматизированный метод контроля состава активного ила
Под разработкой автоматизированного метода контроля состава активного ила понимается создание программного продукта (компьютерной программы), при использовании которого становится возможным наряду с повышением точности, уменьшить не только продолжительность определения количества микроорганизмов в исследуемых пробах, но также и трудоемкость данного процесса.
Машина должна воспринимать микроорганизмы адекватно человеческому глазу. Для этого производится настройка алгоритма несколькими изменяемыми параметрами, первый из которых выделяет элементы, по которым будет производиться расчет.
Изображение состоит из точек. Для каждой из них определен цвет. Во всех изображениях цветовая гамма разбита на три составляющие (красную (г), зеленую (g) и синюю (Ь)), каждая из которых в свою очередь также разбивается на 255 оттенков. Определение производится за счет нахождения производных интенсивности светового потока по каждому цвету, которые затем суммируются и пропускаются через «фильтр» (рис.23,24).
После применения «фильтра» на изображении остаются только те точки, в которых значения производных будут выше задаваемого уровня, (происходит разбиение изображения по контрастности). Таким образом, удается избежать влияния фона изображения на само определение. Также при этом исключается неравномерности освещения. Рисунок 23. Обработка изображения: слева-до обработки; справа-после обработки.
В целях ускорения работы метода и уменьшения влияния шумов регулируется обсчитываемая зона вокруг микроорганизмов (рис.25), то есть в определении будут участвовать только точки, находящиеся в непосредственной близости от предполагаемого микроорганизма. Технология идентификации нитчатых микроорганизмов основана на том, что длина этих объектов намного больше ширины. Для каждого объекта вычисляется степень «вытянутости» и сравнивается с регулируемым значением. Шлам идентифицируется по цвету, поскольку он имеет почти черный окрас, а частицы ила - желтовато-коричневый.
Каждый элемент изображения, который не является нитчатым микроорганизмом и шламовыми частицами, алгоритм разделяет на 2 компонента: флокул ированный и нефлокулированный ил. При высокой концентрации подобных частиц изменяется цвет объекта и можно утверждать, что этот объект будет являться флокулой. Кроме того, производится тест на наличие определенного числа соседних микроорганизмов, в котором считается «рейтинг флокулированности». На определенном расстоянии от объекта вычисляется расстояние до соседних объектов. Рейтинг зависит от суммы всех близлежащих объектов обратно пропорционально квадрату расстояния до них.
Определение обсчитываемой зоны: слева - до обработки; справа - после обработки. Эти регулируемые параметры оператор настраивает так, чтобы видимое глазом изображение адекватно отражалось на сравнительной картинке после обработки, в которой разными цветами выделяются следующие компоненты: нитчатые микроорганизмы (синий), флокулированный ил (коричневый), нефлокулированный ил (красный) и шлам (черный) (рис.26).
Один раз установленные настройки данных параметров при дальнейших измерениях не должны изменяться, чтобы данные были сопоставимы. 3.5.2,Определение погрешности измерения
Ил очень непостоянный и неравномерно распределенный по своему составу объект, поскольку в двух разных полях зрения микроскопа может возникнуть ситуация, когда одних компонентов много, а других вообще нет и, наоборот, и, следовательно, точность метода невысока.
Для определения точности метода произведена статистическая обработка 60 измерений содержания нитчатых микроорганизмов исследуемой пробы. Поскольку усреднять процентное содержание нитевидных бактерий не корректно ввиду неравномерности состава активного ила (попадаются снимки с полным отсутствием микроорганизмов), поэтому точность метода определялась по процентному содержанию от количества всех точек, попавших в кадр.
Среднее значение из шестидесяти измерений составило 1673 точки на снимке, занимаемых нитчатыми микроорганизмами (7,6 % от всех точек ила). Выборочная дисперсия о составила 782,92. Для характеристики разброса данных находим относительную погрешность метода. Коэффициент вариации составил 46,81 % или 0,46, а средняя квадратичная погрешность выборочного среднего равна 0,06.
Таким образом, если описывать метод, которым проводилось измерение, то относительная погрешность метода составила 0,46, но если описывать точность полученного результата, то характеристикой этой точности будет средняя квадратичная погрешность выборочного среднего - 0,06.
Зная квадратичную погрешность одного результата, можно найти необходимое число измерений при заданной точности, и наоборот, можно определить точность при конкретном числе проведенных измерений. Так при обработке 500 снимков, квадратичная погрешность отдельного результата составит 0,35, а средняя квадратичная погрешность выборочного среднего -0,02. При обработке 1500 снимков этот показатель составляет 0,01.
Таким образом, для того чтобы добиться погрешности измерения в пределах 2 % достаточно произвести обработку 500 снимков. Увеличение количества обрабатываемых снимков исследуемой пробы до 1500 штук приводит к повышению точности измерения почти в 2 раза.
