Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор 6
1.1 Химический состав топи нам бура 6
1.2 Переработка топинамбура 16
1.3 Получение гидролизатов из растительного сырья 27
1.4 Микробные полигидроксиалканоаты 32
1.5 Биоконверсия растительного сырья с получением защитных биопрепаратов 42
2. Методы проведения экспериментов 46
2.1 Объекты исследования 46
2.2 Методы исследования химического состава вегетативной части топинамбура и твердого остатка.. 48
2.3 Методы культивирован сгерпй Ralslonia culropha 52
2.4 Методы анализа бактериальной биомассы 53
2.5 Методы проведения эксперимента при оптимизации режима гидролиза вегетативной части топинамбура 55
2.6 Методы наработки опытной партии гидролизата 56
2.7 Методы исследования гидролизата и нейтрализата .57
2.8 Методы подготовки и проведения брожения гидролизатов вегетативной части топинамбура и исследования бражки 59
2.9 Методы исследования обесспиртованной барды и проведения культивирования белковых кормовых дрожжей 60
2.10 Методы культивирования микроорганизмов на послеэкстракционном остатке 61
3 Экспериментальная часть 63
3.1 Исследование химического состава вегетативной части топинамбура...63
3.2 Культивирование бактерий на субстратах из вегетативной части топинамбура 66
3.3 Оптимизация режима гидролиза вегетативной части топинамбура 77
3.4 Получение этанола из вегетативной части топинамбур 83
3.5 Культивирование кормовых дрожжей 87
3.6 Биодеструкция твердого остатка 92
4 Технологическая часть 97
5 Выводы 102
Список использованных источников 104
Приложение
- Переработка топинамбура
- Микробные полигидроксиалканоаты
- Методы исследования химического состава вегетативной части топинамбура и твердого остатка..
- Культивирование бактерий на субстратах из вегетативной части топинамбура
Введение к работе
В связи с сокращением доступных ресурсов древесины в последние годы во всем мире уделяется большое внимание изысканию новых видов сырья для химической и биохимической переработки. Среди таковых-биомасса злаков, культурных и дикорастущих травянистых растений, багасса различных видов. Однако эти виды сырья до сих пор не получили широкого распространения в биотехнологии, в основном из-за отсутствия совершенных методов и аппаратов для переработки.
Основное требование, предъявляемое к сырью для биохимической переработки - высокое содержание полисахаридов. Этому требованию, согласно данным химического состава, в полной мере удовлетворяет вегетативная часть топинамбура, традиционно используемая в кормопроизводстве. Благодаря значительному содержанию углеводов наиболее приемлемым способом для ее переработки может быть кислотный гидролиз. Полученные сахаросодержащие субстраты потенциально приемлемы для любых биотехнологических процессов, включая биосинтез этанола, кормового белка, и других ценных продуктов микробного синтеза, например-полигидроксиалканоатов (ПГА). ПГА- термопластичные полиэфиры биологического происхождения, которые по базовым свойствам аналогичны полипропилену и полиэтилену, но обладают такими уникальными свойствами, как биоразрушаемость и биосовместимость. Разработка и освоение новых, экологически чистых материалов, включающихся в биосферные круговоротные циклы, соответствует концепции экологически безопасного устойчивого промышленного развития. В «Повестке дня 21 века», принятой в 1991 г. на специальной конференции ООН по окружающей среде и развитию, акцентировано внимание на необходимость разработки и внедрения новых экологически безопасных материалов.
Для создания новых технологий и повышения эффективности имеющихся мощностей биохимических заводов с учетом возрастающих требований к защите окружающей среды необходим комплексный подход к использованию сырьевой базы. Одним из экологически чистых способов утилизации твердого остатка после гидролиза вегетативной части топинамбура является биоконверсия, позволяющая получить препараты, применяемые для биологической защиты растений.
Таким образом, необходимость разработки с целью практического внедрения технологии комплексной переработки вегетативной части топинамбура с получением этанола, кормового белка, биополимеров и защитных биопрепаратов очевидна, что и явилось целью данной работы.
Переработка топинамбура
Продолжительное время топинамбур культивировали в основном на кормовые цели. Благодаря высокому содержанию сухих веществ, хорошей углеводной, и витаминной обеспеченности, а также малому количеству клетчатки, зеленая масса топинамбура обладает значительными кормовыми достоинствами. Надземная часть растения и клубни дают 200-300 ц кормовых единиц с 1 га и 12-16 ц/га перевариваемого протеина. Топинамбур превышает по питательной ценности, перевариваемому протеину и выходу кормовых единиц в 2,9-7,9 раза кукурузу, однолетние и многолетние травы, картофель. Наличие в стеблях растений большого количества Сахаров обуславливает легкую их силосуемость. Силос из зеленой массы земляной груши также отличается высокими кормовыми достоинствами и питательностью [2, 38, 39,40].
Другим наиболее простым и традиционным способом использования топинамбура является непосредственное применение его в пищу. Среди 24 новых ингредиентов, введенных на мировой рынок в 1988 году и предназначенных для использования в пищевой промышленности, имеется и сухой экстракт из топинамбура. Известны технологии получения топинамбурного пюре, паст, муки, концентратов, сиропов, порошков. Топинамбурные продукты успешно используют при изготовлении сладких блюд, мармелада, готовых завтраков, сложнокомпонентных соков, безалкогольных напитков, вина, пива, при изготовлении молочных продуктов, хлеба. Для этих целей используются клубни топинамбура в свежем, вареном или консервированном виде. Специальные опыты показали, что по калорийности клубни весьма близки к картофелю, это делает возможным применение топинамбура (клубней) вместо картофеля, но в тоже время ему присущ ряд недостатков, которые ограничивают эту возможность. Во-первых, органолептические свойства топинамбура отличаются от таковых картофеля, во-вторых, инулиды не набухают, как крахмал, поэтому приготовленные клубни остаются очень водянистыми. Однако это не снижает пищевых достоинств топинамбура. В результате медико-биологических испытаний топинамбура и профилактических продуктов на его основе установлен явно выраженный сахаро- и холестеринопонижающий эффект [1,39,41]. В последние десятилетия выявлены большие потенциальные возможности топинамбура не только как культуры кормового и пищевого, но также лечебно-профилактического и технического назначения [42]. Значительное развитие получили такие области как производство этилового спирта и высокофруктозных сиропов.
Спектр получаемых сахаристых продуктов из топинамбура весьма разнообразен: - неочищенный концентрат, получаемый при ферментативном гидролизе клубней (75-85 %); - - очищенный концентрат фруктозы, подобный меду, содержащий 75-85 % фруктозы (ионообменная очистка); - кристаллическая фруктоза; - порошок инулина и другие высушенные продукты. Побочный продукт переработки (прессованный жмых) высушивается, измельчается и служит источником пищевых волокон при производстве диетических продуктов низкой калорийности [43].
Топинамбур нашел свое применение в производстве кормовых дрожжей, молочной кислоты, винного уксуса, пропионовои кислоты, маннита и пектиновых веществ [16, 44-45]. Продукты переработки топинамбура могут быть использованы в парфюмерной промышленности для приготовления кремов и паст, губной помады и в качестве добавки к шампуням.
Изучена возможность использования топинамбура в качестве субстрата в производстве глицерина, ацетона, бутанола, биогаза, моторного топлива [16,39,47-49]. В 1991 г. в Нидерландах проходил второй Международный конгресс по топинамбуру, который подытожил состояние и перспективы работ по топинамбуру и резюмировал, что главными направлениями развития работ является получение фруктозных сиропов, этанола, кормового белка, новых сахаристых продуктов и подсластителей, а также физиологически активных соединений, синтезируемых на основе инулинов и фруктанов для применения в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве [50].
Для промышленных объемов на существующих технологических линиях наиболее изученным и установившимся процессом переработки топинамбура является получение спирта, так как культура служит хорошим источником сбраживаемых Сахаров. Важно отметить, что эффективность превращения углеводов составляет 80-95 %. При этом средний выход спирта из клубней составляет 7-8 л/ц (в отдельных случаях до 10 л), что, в свою очередь, превышает в 1,5-3,5 раза выход спирта при переработке сахарной свеклы, картофеля, пшеницы. Также себестоимость 1л спирта из топинамбура ниже, чем из картофеля или зерна вследствие высокой урожайности и меньших производственных затрат. В промышленных масштабах этот процесс в разные годы применялся во Франции, Германии, России, Польше, США и Японии. В нашей стране первые производственные опыты по использованию клубней топинамбура на выработку спирта были произведены еще в начале 30-х годов [1,39].
В процессе производства спирта из топинамбура основными являются четыре стадии: - подготовка сырья, которая предусматривает приготовление из клубней топинамбура сока, протертой массы или пюре и извлечение Сахаров из исходного материала. Это извлечение растворимых углеводов осуществляется через клеточные стенки; - предварительная обработка углеводов, сущность которой заключается в осахаривании диффузного сока (перевод инулина во фруктозу). Предварительную обработку углеводов осуществляют ферментативным, кислотным или термическим гидролизом (под высоким давлением). Кроме того, может быть применен комбинированный способ гидролиза, сочетающий элементы, например, термического и ферментативного гидролиза; - получение этанола вследствие сбраживания дрожжами осахаренного сока в этиловый спирт. Эффективность образования этанола из подготовленного и обработанного должным образом сырья зависит от продуктивности штаммов дрожжей и их толерантности к этанолу, рН, температуры, добавок питательных веществ и оптимальной концентрации сахара. С экономической точки зрения очень важен еще высокий выход этанола, который, помимо технологических параметров, зависит и от типа выбранного оборудования . например, при использовании реактора с иммобилизованными клетками достигается очень высокая продуктивность по этанолу — около 100 г/л ч, однако выход этанола составляет только 86 % от теоретического, а утилизация углеводов — 80 % ( для сравнения: в реакторе с мешалкой и свободными клетками достигается выход спирта 90 % от теоретического и утилизация Сахаров 95 %).; - выделение этанола из бражки. Концентрирование и очистка спирта является дорогостоящей стадией в промышленном производстве этанола, так как дистилляция требует больших затрат энергии. На этой стадии происходит удаление побочных продуктов, таких как альдегиды и сивушные масла. В целом спирт из топинамбура отличается высоким качеством [25].
В Тираспольском Институте Химии АН РМ проведены исследования по созданию технологии производства этилового спирта из клубней топинамбура, с целью замены остродефицитных пищевых видов сырья. В отличии от рекомендованной в литературе разварки цельных клубней при нагревании под давлением, авторами с целью уменьшения энергозатрат было предложено их измельчение на молотковой дробилке [51].
В университете Carlton (Оттава, Канада) для получения этанола из гидролизата клубней топинамбура использовали оригинальную систему с иммобилизованными клетками дрожжей [52]. Микробные клетки заключали в пористые агрегаты из ацетилцеллюлозы и в полученную клеточную суспензию в водном растворе ацетона погружали хлопковую ткань. Затем ткань сушили на воздухе и стабилизировали обработкой полиэтиленимином и далее дитионитом, содержащим щелочной альдегид. Полученные полоски из ткани с иммобилизованными на ней клетками дрожжей размещали параллельно в ферментере и проводили периодический процесс ферментации с циркуляцией среды. Достигнута максимальная производительность в 20 г этанола на 1л ферментационной среды в час, и эта продуктивность оставалась постоянной в течение 60 дней.37
Микробные полигидроксиалканоаты
Полимерные материалы необходимы для различных сфер человеческой деятельности. Среди них - известные и широко применяемые синтетические материалы и полимеры биологического происхождения, так называемые биополимеры. Синтетические полимеры (нейлон, полиэтилен, полиуретан) совершили революцию в нашем образе жизни, но их применение создает ряд проблем. Во-первых, синтетические полимеры получают из не возобновляемых ресурсов; во-вторых, - применение неразрушаемых в природной среде пластиков и их накопление ведет к загрязнению окружающей среды и создает глобальную экологическую проблему. Объемы выпуска неразрушаемых в природной среде синтетических пластмасс, главным образом полиолефинов (полиэтил енов и полипропиленов), получаемых в экологически тяжелых процессах нефтеоргсинтеза, а также полистеринов, огромны и ежегодно возрастают примерно на 25 млн тонн, при этом основная их часть складируется на свалках. В целом, рассматриваемые проекты возможной реутилизации химических пластиков неоптимистичны [82]. Основными тенденциями в современной индустрии полимеров является создание новых экологически чистых полимерных материалов и композитов с широким спектром полезных свойств. Направление поиска в последние годы смещается в сторону производства не аккумулируемых в природной среде материалов, разрушаемых в естественных биологических процессах, то есть вписывающихся в биосферные круговороты. В этой связи большую актуальность приобрели работы по полимерам биологического происхождения. Биополимеры подразделяются на две категории: полимеры, продуцируемые биологическими системами (например, микроорганизмами) и полимеры, синтезируемые химически, но на основе исходного сырья биологического происхождения (аминокислоты, сахара, жиры)[83].
Среди применяемых и активно разрабатываемых в настоящее время новых полимерных материалов - полисахариды (крахмал, ксантан, альгинат и другие), алифатические полиэфиры, полимеры молочной и гликолевой кислот (полилактиды, полигликолактиды), и с недавних пор-полиоксиалканоаты (ПОА). ПОА - это новый класс биополимеров -полимеры оксипроизводных жирных кислот, которые синтезируются прокариотическими микроорганизмами в специфических условиях роста. С последними связаны наибольшие надежды, так как, помимо термопластичности, аналогично полипропилену и полиэтилену, полиоксиалканоаты обладают антиоксидантными и оптическими свойствами, пьезоэлектрическим эффектом и, самое главное, они разрушаются в окружающей среде и характеризуются биосовместимостью. Это делает их перспективными для применения в медицине (хирургические и одноразовые материалы), фармакологии (пролонгация действия лекарственных веществ), пищевой промышленности (упаковочный и антиоксидантний материал), сельском хозяйстве (обволакиватели семян, удобрений, пестицидов, разрушаемые пленки, тара для тепличных хозяйств). Перспективам полиоксиалканоатов посвящено много обзоров [87,89-91,93-107], в том числе - по физиологии и генетике микроорганизмов, синтезирующих ПОА [93,96,101], исследованиям состава [84,101,108-109], их свойств [97,110-114] и разрушаемости [115-120]. В последние годы в связи с масштабированием и освоением процессов получения полиоксиалканоатов в промышленных масштабах стали появляться работы, посвященные технико-экономическому анализу данных производств [84,121-123].
Первым из полиоксиалканаотов был обнаружен полиоксибутират-полимер р-оксимасляной кислоты (ПОБ). В настоящее же время известно свыше 100 различных полиоксиалканоатов. ПОА накапливаются в бактериальных клетках в виде гранул, которые при окрашивании хорошо визуализируются микроскопически. Накопление ПОБ в бактериях происходит при высоких значениях соотношения углерод/азот в среде, а его распад наблюдается при отсутствии экзогенных источников энергии и углерода. ПОБ и другие ПОА являются внутриклеточным резервным соединением. Установлено, что ПОБ синтезируется с различными выходами многими прокариотическими микроорганизмами (к настоящему времени их насчитывается свыше 300) с использованием различных субстратов. Однако для промышленного применения было выделено всего несколько высокопродуктивных и перспективных микроорганизмов, эффективно синтезирующих полиоксибутират с использованием ряда субстратов (сахаров, метанола, углеводородов, смесей водорода и углекислоты) - водородокисляющие бактерии Alcaligenes eutrophus, (недавно переименованные в Ralstonia eutropha), Alcaligenes latus, азотфиксаторы Azotobacter vinelandii, псевдомонады Pseudomonas oleovorans, метилотрофы Methylomonas, Methylobacterium organophilum [84,87,94,96,99].
Чистый полиоксибутират, однако, хрупок и мало устойчив к растяжению. Недостаточная эластичность и термостабильность ПОБ затрудняет процессы его переработки, что ограничивает возможные области его применения. И если бы полиоксибутират был единственным полиоксиалканоатом, он, вероятно, не имел бы больших перспектив. Однако, из активного ила был выделен полимер, свойства которого отличались от ранее изученного полиоксибутирата [124]. Детальный хроматографический анализ показал в полимере, помимо доминирующей оксимасляной кислоты, присутствие оксивалериановой, оксигексановой и оксиоктановой кислот в качестве минорных компонентов [125]. Это был первый обнаруженный гетерополимерный полиоксиалканоат.
Открытие способности микроорганизмов к синтезу гетерополимерных ПОА явилось сильным импульсом для расширения исследований данных биополимеров. Изменение соотношения C Cs сополимеров в ПОА сопровождается существенными изменениями термомеханических и волоконных свойств материала. Например, присутствие оксивалерата в ПОА существенно снижает температуру плавления и кристалличность материала, делая его более эластичным, упругим и удобным для переработки. Установлено, что на общий выход, состав и отдельные свойства полимеров (молекулярную массу, степень кристалличности, механическую прочность, скорости разрушения в природных и модельных средах) влияют параметры режима ферментации, главным образом, источника углеродного питания [109-114]. Это открывает перспективы для направленного синтеза биополимеров с заданными свойствами.
В связи с тем, что значительная доля стоимости ПОА приходится на долю исходного сырья, магистральное направление исследований, определяющее стратегию промышленного производства полиоксиалканоатов, в настоящее время связано с возможностями расширения сырьевой базы для их производства. Широкие исследования ПОА, развернутые в самое последнее время, ориентированы на поиск новых субстратов. При этом исследуется рост и синтез ПОА уже известными и изученными микробными штаммами с привлечением новых субстратов, а также продолжается поиск новых природных и конструирование новых штаммов, способных эффективно усваивать различные новые субстраты.
Методы исследования химического состава вегетативной части топинамбура и твердого остатка..
Пробу вегетативной части топинамбура отбирали методом квартования. Вначале отбирали среднюю пробу грубоизмельченного сырья массой до 1-3 кг и после высушивания на воздухе до воздушно-сухого состояния измельчали на дезинтеграторе до размера частиц 1-3 мм. Исследование химического состава топинамбура проводили по методикам принятым в химии растительного сырья. Определение содержания влаги Анализ проводили методом высушивания навески в бюксе до постоянной массы при температуре 105±2 С [174]. Определение содержания минеральных компонентов Метод основан на сжигании навески сырья с последующим прокаливанием золы в муфельной печи при температуре 575+25 С до постоянной массы [174]. Определение легко- и трудногидролизуемых полисахаридов Легко- и трудногидролизуемые полисахариды определяли с использованием метода Кизеля и Семигановского. Метод основан на определении количества моносахаридов, образующихся из легкогидролизующихся полисахаридов исследуемой растительной ткани при гидролизе ее разбавленной соляной кислотой, и на определении количества моносахаридов, образующихся из трудногидролизуемых полисахаридов, содержащихся в остатке растительной ткани после гидролиза легкогидролизуемых полисахаридов.
Белковые кормовые дрожжи концентрированной серной кислотой, затем проводили инверсию образовавшихся декстринов разбавленной серной кислотой. В гидролизатах определяли содержание образовавшихся редуцирующих веществ (РВ) методом эбулиостатического титрования.
Химическая сущность метода заключается в окислении редуцирующих веществ медно-щелочным раствором (реактив Фелинга) при кипячении в стеклянном сосуде - эбулиостате. Индикатором при титровании служил метиленовый голубой, который в окислительной среде имеет синий цвет, а в восстановительной - бесцветен. По изменению окраски метиленовой сини определяют конец титрования медно-щелочного раствора раствором сахара. Для растворения осадка закиси меди в медно- щелочной раствор добавляют желтую кровяную соль K4Fe(CN)6. Массовую долю легко- и трудногидролизуемых полисахаридов рассчитывали в процентах к абсолютно сухой навеске [174].
Содержание веществ лигниновой природы определяли по методу Кенинга в модификации Комарова с 72 % серной кислотой. Метод основан на количественном выделении лигнина удалением экстрактивных веществ соответствующей экстракцией и полисахаридов концентрированной минеральной кислотой [174].
Определение веществ, экстрагируемых горячей водой Извлечение веществ, экстрагируемых горячей водой, из вегетативной части топинамбура проводили в колбе с обратным холодильником при кипячении в течение Зч. Количество водорастворимых веществ находили по массе сухого остатка после выпаривания водного экстракта (аликвоты пробы) [174].
В водном экстракте определяли содержание редуцирующих веществ до и после инверсии серной кислотой, азот, микро- и макроэлементы, фруктозу Определение фруктозы
Определение содержания фруктозы проводили по методу Мак-Рери и Слаттери. Метод основан на способности кетосахаров давать окраску с резорцином в кислой среде. Для этого в пробирку вносили пипеткой экстракт, содержащего от 1 до 8 мг фруктозы в 100 мл, спиртовый раствор резорцина и 3%-ный раствор соляной кислоты. В другую пробирку вносили воду и остальные реактивы аналогично опытной пробе. Перемешивали и помещали пробирки на водяную баню при 80С на 20 мин. После охлаждения до комнатной температуры измеряли на ФЭК интенсивность окраски с зеленым светофильтром (540 нм). Слепую пробу использовали в качестве эталона для сравнения. Содержание фруктозы вычисляли . по предварительно полученному градуировочному графику[175].
Минеральный состав экстрактов анализировали общепринятым методом: фосфор - колориметрически (красный светофильтр) с аскорбиновой кислотой в присутствии 1%-ного раствора молибдата аммония и ацетатного буфера после минерализации гидролизата смесью хлорной и азотной кислот (НСЮ4: HN03 = 1:1, по объему); серу - титрометрическим методом, в ходе которого 50 мл гидролизата сжигали в кислороде, пропускали через катионит К-2, выпаривали и далее титровали 0,01 Н раствором ВаСЬ с индикатором нитрохромаза. Для определения магния, кальция, калия, натрия и микроэлементов экстракт минерализовали в смеси кислот (НС 1() : HNCh -; 1:1, по объему) и анализировали агомно-абсорбционным методом на приборе ААС IN («Carl Zeiss») [1761. Определение общего азота
Определение общего азота проводили микрометодом Къельдаля [177]. В пробирку вносили высушенную биомассу, добавляли концентрированную серную кислоту и помещали на предварительно нагретую до 230 С песочную баню на 40 минут. Пробирку извлекали из песка, охлаждали при комнатной температуре, добавляли 30% раствор Н202 и снова помещали на песочную баню еще на I час до полного обесцвечивания жидкости. Параллельно ставили пробирку (холостая проба), в которую вносили только H2SO4. Каждую пробу, включая холостую, в отдельности разводили дистиллированной водой в 100-200 раз. Из каждой пробы отбирали по 2 мл, добавляли 8 мл дистиллированной воды и вносили кусочек красной лакмусовой бумажки и титровали 30% раствором NaOH до щелочной реакции (посинения лакмусовой бумажки). Далее в пробирки добавляли 0.5 мл реактива Неслера и измеряли на ФЭК оптическую плотность проб (синий светофильтр) относительно холостой пробы Я =440 нм.
Культивирование бактерий на субстратах из вегетативной части топинамбура
Исследование химического состава экстракта вегетативной части топинамбура показало, что в нем содержится значительное количество фруктозы, а также необходимые для роста микроорганизмов микро- и макроэлементы. В соответствии с полученными результатами, дальнейшие исследования были направлены на изучение возможности биосинтеза полигидроксиалканоатов бактериями R. culropha на субстрате, полученном из вегетативной части топинамбура.
За помощь в разработке данного раздела диссертации выражаем благодарность заведующей лаборатории хемоавтотрофпого биосинтеза Института биофизики СО РАН доктору биологических наук, профессору Воловой Т.Г. Сравнительные результаты выращивания бактерий показали, что оптимальная концентрация фруктозы для данного штамма составляет около15 г/л; повышение концентрации до 20-25 г/л вызывает ингибирование роста бактерий, а концентрация фруктозы 5-Ю г/л недостаточна для получения высокого урожая биомассы. Поэтому в дальнейшем ферментацию реализовали с подпиткой фруктозы при ее текущей концентрации в культуре не выше 15 г/л. Далее были проведены исследования влияния условий углеродного питания на динамику аккумуляции полимеров (рис. 3.2-3.3)
Установлено, что в автотрофных условиях при использовании С02 и Н2 в качестве углеродного и энергетического субстратов организмы накапливали в клетках до 65 % полимеров в течение 65-75 ч культивирования. Миксотрофные условия (использованы автотрофиыи и гетеротрофный углеродные субстраты (ССЬ+фруктоза))- не увеличивали общего содержания полимера в клетках, однако вследствие более быстрого роста бактерий при миксотрофии (в среднем на 25-30% по сравнению с автотрофным ростом), обеспечивали урожаи биомассы и выходы полимера в ней, сопоставимые с автотрофными условиями за более короткий период культивирования. На гетеротрофных углеродных субстратах у всех штаммов получен максимальный выход полимера, до 70-75 % к абсолютно сухому весу.
На следующем этапе работы была оценена пригодность экстракта из вегетативной части топинамбура в качестве субстрата для синтеза полимеров. В данном опыте при гетеротрофном росте в режиме аккумуляции полимера в условиях лимита по азоту общий урожай R.eulropha составил 7,0 г/л, полимера - около 65 % (к ЛСЪ). Динамика скорости синтеза полимера была следующей: в начальный период (около 10 ч от начала процесса) при минимальной концентрации полимера в клетках (не выше 5%) абсолютная скорость накопления полимера составляла всего 0,013 г/ч, удельная скорость синтеза - около 0,03 1/ч. В течение последующих 40-60 ч при увеличении общей биомассы в культуре и концентрации полимера в клетках до 35-55 % удельная и абсолютная скорости возрастали, достигая максимальных значений, соответственно, 0,55 1/ч и 0,6-0,07 г/час. Далее на фоне увеличения общей биомассы, которое было связано, главным образом с накоплением полимера в клетках, скорость его синтеза постепенно снижалась. В стационарной фазе, когда общий пул полимера в клетках достигал максимальных значений, удельная скорость синтеза падала до начальных (около 0,01 1/ч).
Полиоксибутират накапливается в бактериальных клетках в виде гранул, которые при окрашивании хорошо визуализируются микроскопически. По мере увеличения внутриклеточного пула полимера количество гранул и их диаметр возрастает. Диаметр гранул в стационарной фазе достигает до 0.7 мкм и более, однако количество гранул зависит от размера клеток. На рисунке 3.6 представлена бактериальная клетка с запасами полиоксибутирата около 70 %. мкм
Бактериальная клетка с содержащимися в ней гранулами полимера Для широкого применения полиоксибутирата важна его способность прессоваться в различные формы, нити, пленки. Изучение термопластических свойств ПОБ показало, что он близок к классическим химическим полимерам (полипропилену, полиэтилену и т.д.). Температура размягчения образца полиоксибутирата составила 110 С, при этом температура плавления составила 163 С, пик испарения 215 С (температура плавления полипропилена -170 С, полистерина -110 С).
Поскольку наиболее выгодным является комплексное исполЕ/ювание всей биомассы, исследование биологической ценность шротов водородокисляющих бактерий после экстракции из нее полимера было следующим этапом работы. После извлечения полимера остаточная обезжиренная биомасса (шрот) содержит в основном азотистые компоненты, то есть может иметь самостоятельное значение для получения разнообразных ценных продуктов.
