Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Используемые методы молекулярного моделирования
1.1. Методы квантовой химии 9
1 .Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики 9
1.2.1. Метод потенциалов эффективных фрагментов 10
1.2.2. Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики
на основе потенциалов эффективных фрагментов 12
І.З.Метод молекулярного докинга 14
Ы.Метод молекулярной динамики 16
Глава 2. Моделирование реакции гидролиза пептидной связи трипсином
2.1. Экспериментальные сведения о реакциях с участием сериновых протеаз 17
2.1.1. Строение активного центра сериновых протеаз 17
2.1.2. Механизм реакции с участием сериновых протеаз 18
2.1.3. Кинетика реакций с участием сериновых протеаз 20
2.1.4. Инактивация и ингибирование фермента 22
2.1.5. Оценки энергии активации в реакциях с участием сериновых протеаз ....23
2.2. Моделирование реакций гидролиза пептидной связи сериновыми протеазами 24
2.3. Моделирование реакции методом КМ/ММ 32
2.4. Результаты расчетов 34
2.4.1. Моделирование реакции гидролиза с участием модели 1 34
2.4.2. Моделирование реакции гидролиза с участием модели II 40
2.4.3. Оценка влияния субстрата на активный центр фермента 45
Глава 3. Моделирование реакции гидролиза метилтрифосфата в воде
3.1. Предпосылки к изучению реакции гидролиза метилтрифосфата в воде 48
3.2. Выбор базиса для моделирования химических реакций с участием фосфатных групп 50
3.3. Построение моделей , 55
3.4. Результаты расчетов 58
3.4.1. Моделирование реакции с участием модели 1 58
3.4.2. Моделирование реакции с участием модели II 62
Глава 4. Моделирование реакций гидролиза трифосфатов в биологических системах
4.1. Особенности протекания реакции гидролиза АТФ в миозине 66
4.1.1. Структура и свойства миозина 66
4.1.2. Гидролиз аденозинтрифосфата „ 70
4.2. Описание движения миозина вдоль актина с помощью кинетической модели 74
4.3. Обзор теоретических и экспериментальных работ, посвященных реакции гидролиза АТФ 77
4.4. Выбор модельной системы для реакции гидролиза АТФ 85
4.5. Результаты расчетов , 87
4.6. Моделирование реакции гидролиза гуанозинтрифосфата вбелкер21газ , 91
4.6.1. Строение белка р2Iras 92
4.6.2, Исследование механизмов гидролиза ГТФ в белках 93
4.7. Методики моделирования реакции гидролиза ГТФ 103
4.7.1. Методика молекулярного докинга 103
4.7.2. Методика молекулярной динамики 104
4.7.3. Построение КМ/ММ модели , 105
4.8. Результаты моделирования реакции гидролиза ГТФ 107
4.8.1. Сравнение положения Gln61 в белках p21ras и p21ras-GAP 107
4.8.2. Молекулярный докинг. 110
4.8.3. Молекулярная динамика 113
4.8.4. Расчеты КМ/ММ 115
4.8.5. Сравнение механизмов гидролиза ГТФ в белках p21ras и p21ras-GAP 120
Выводы 123
Список литературы 124
- Методы квантовой химии
- Экспериментальные сведения о реакциях с участием сериновых протеаз
- Предпосылки к изучению реакции гидролиза метилтрифосфата в воде
- Особенности протекания реакции гидролиза АТФ в миозине
Введение к работе
Актуальность темы
Возрастающий интерес к моделированию реакций, происходящих в живых системах, обусловливается потребностями био- и нанотехнологий, быстрым развитием информационных технологий. Наиболее перспективной группой методов моделирования реакций на данный момент можно считать гибридные методы квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ). Анализ энергетических профилей химических реакций, построенных с использованием методов КМ/ММ, позволяет детализировать механизмы химических превращений с учетом реального белкового окружения или молекул растворителя. Согласно основной идеи приближения КМ/ММ центральная реакционная часть системы рассматривается на квантовом уровне, а молекулярное окружение - в рамках подходов молекулярной механики.
Данная работа посвящена изучению важнейших химических реакций гидролиза, происходящих в биологических системах, с помощью комбинированных методов квантовой и молекулярной механики. Для детального анализа выбраны: гидролиз пептидной связи трипсином, гидролиз аденозинтрифосфата белком миозином, а также гидролиз гуанозинтрифосфата, происходящий в белке p21ras.
Работа является актуальной, что обусловлено возрастающим интересом к расчетам сечений поверхности потенциальной энергии для биохимических реакций, протекающих в сложном молекулярном окружении. В настоящее время становится возможным детально изучать важнейшие реакции гидролиза субстрата, проходящие в активном центре фермента, определять отдельные стадии этих реакций и обосновывать механизмы, предлагаемые по результатам экспериментальных исследований. Понимание процессов, происходящих внутри клетки на молекулярном уровне, позволит, в частности, установить критерии поиска активных компонентов новых лекарственных веществ.
Цель работы
Работа носит преимущественно методический характер: демонстрируется применение оригинального комбинированного метода квантовой и молекулярной механики, основанного на теории потенциалов подвижных эффективных фрагментов. Целью работы являлось изучение механизмов важнейших биохимических реакций с помощью данного варианта метода КМ/ММ на основе рассчитанных энергетических профилей реакций гидролиза рассматриваемых молекулярных систем.
В рамках заданной цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать реакции гидролиза пептидной связи трипсином. Построить
энергетическую диаграмму химической реакции.
Изучить реакцию гидролиза трифосфатов в водной среде, включая исследование влияния катиона Mg на протекание реакции.
Моделирование реакции гидролиза аденозинтрифосфата в реальном белковом окружении в миозине. Построить профиль потенциальной энергии реакции и сравнить полученные результаты с результатами гидролиза метилтрифосфата в водной среде.
4. Изучить реакцию гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21ras. Построить
профиль потенциальной энергии реакции и сравнить результаты с ранее полученными
данными для реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras-GAP.
Научная новизна результатов
Моделирование механизмов химических реакций с помощью метода КМ/ММ позволило получить детальную картину химических превращений в реакциях гидролиза субстратов. С помощью использованной методики возможно отслеживать пути перемещения протонов, локализовать стационарные точки на поверхности потенциальной энергии, определять энергетические характеристики на отдельных стадиях реакции гидролиза.
Показано, что реакция гидролиза пептидной связи трипсином протекает по однопротонному механизму. Использование расширенной модели субстрата, при учете взаимодействия между аминокислотными остатками субстрата Thrll-Glyl2-Prol3-Cysl4-Lysl5-Alal6-Argl7-Ilel8-Ilel9 и аминокислотными остатками белка His40-Phe41-Cys92, Serl90-Cysl91-Glnl92-Glul93-Aspl94-Serl95, Ser214-Thp215-Gly216, позволило точно описать активный центр фермента. Рассчитанная энергия активации на первой стадии реакции не превысила 10 ккал/моль.
Впервые с помощью комбинированного метода квантовой и молекулярной механики проведено моделирование эффекта индуцированного соответствия. Показано, что только за счет сжатия активного центра при встраивании в него модельного субстрата может происходить снижение активационного барьера до 3 ккал/моль.
Впервые определено, что реакция гидролиза метилтрифосфата в водном окружении протекает по механизму нуклеофильного замещения второго
9+ 9+
порядка Sn2 в присутствии катиона Mg . В отсутствие Mg реакция протекает в две стадии с образованием интермедиата по механизму SnI. Энергетические
барьеры, рассчитанные методом функционала плотности и теории возмущений второго порядка, не превышают 17 ккал/моль.
Результаты данной работы позволяют представить общую картину протекания реакций фосфорилирования в водном растворе и в присутствии белковой матрицы. Выявлена общая закономерность при рассмотрении реакций гидролиза АТФ и ГТФ в белках: белковая матрица способствует ослаблению гидролизуемой связи Ру-Ор еще до начала реакции, что приводит к снижению активационных барьеров рассматриваемых ферментативных реакций по сравнению с подобными барьерами, полученными для реакции гидролиза метилтрифосфата в воде.
Продемонстрирована практическая значимость комбинированного метода квантовой и молекулярной механики, основанного на теории потенциалов эффективных фрагментов: на примере различных биохимических реакций гидролиза, включая хорошо изученную экспериментально реакцию гидролиза пептидной связи трипсином и сложную реакцию гидролиза ГТФ белком p21ras. Эффективность метода подтверждается сравнением полученных результатов моделирования с результатами других теоретических исследований и с экспериментальными данными, накопленными по рассматриваемым системам. Это дает основание полагать, что метод может быть использован для определения механизмов других возможных реакций, протекающих в живых системах, и служить важнейшим источником данных о неизученных в настоящее время биохимических реакциях.
Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты данного исследования помогают детализировать механизм химической реакции, а, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями. В частности, понимание механизма реакции гидролиза субстрата трипсином облегчает создание новых ингибиторов, а понимание механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21ras дает возможность влиять на процессы деления клеток. Результаты исследования могут быть использованы в разработке биологически активных соединений и новых лекарственных препаратов.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации были представлены на V Ежегодной международной молодежной конференции, Институт Биохимической физики РАН им. М.Н. Эмануэля
(Москва, 2005), II Российская школе-конференции «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» (Саратов, 2004), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), Английской секции международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), III Международной конференции по водородным связям и молекулярному взаимодействию (Киев, 2006).
Результаты работы опубликованы в 10 печатных изданиях, в том числе в 5 тезисах докладов.
Структура и объем работы
Методы квантовой химии
Метод потенциалов эффективных фрагментов (ПЭФ) был разработан для моделирования влияния сольватации в рамках дискретных моделей описания растворителя [2]. Основная идея метода заключается в замене молекул растворителя эффективными фрагментами, потенциалы которых входят в одноэлектронную часть оператора Гамильтона рассматриваемой молекулы растворенного вещества.
Первоначально метод эффективных фрагментов был сформулирован и реализован для описания кластеров молекул воды. Первоначальный вариант метода предполагал учет:
1) кулоновских взаимодействий между молекулами растворителя и растворенного вещества.
2) поляризационных взаимодействий между молекулами растворителя и растворенного вещества.
3) обменных вкладов.
Из предварительных неэмпирических вычислений рассчитываются мультипольные моменты и поляризуемость фрагментов, которые впоследствии используются для расчетов вкладов 1 и 2.
Растворенное вещество, которое может быть молекулой или группой молекул, описывается с помощью квантового неэмпирического гамильтониана. Влияние молекул растворителя учитывается при добавлении вкладов 1-3 в одноэлектронные слагаемые гамильтониана [3].
Метод, первоначально реализованный для описания водных растворов, может быть распространен для любого растворителя, однако, для такого обобщения необходимы дополнительные вычисления. Основную трудность представляет получение отталкивательного потенциала для двух молекул растворителя для большого числа относительных конфигураций молекул. Этот процесс требует много усилий и не всегда оканчивается успешно [3].
Согласно реализации идеи ПЭФ в программном комплексе GAMESS (US), эффективные потенциалы находятся с помощью отдельных квантовохимических расчетов. Соответственно, гамильтониан всей системы можно записать, как Н = Нкм + V, где Нкм - оператор Гамильтона для квантовомеханической части, а оператор V объединяет три вклада в одноэлектронную часть гамильтониана, представляющие потенциалы эффективных фрагментов. Для ц-ой молекулы растворенного вещества одноэлектронные вклады в неэмпирический гамильтониан представляются формулой: где VElec - электростатические, VPo1 - поляризационные, VRep - отталкивателыше составляющие, a s относится к электронным координатам [ ].
Электростатические взаимодействия между двумя полярными молекулами часто вносят наибольший вклад в общую энергию. Методы учета внешних электростатических возмущений в квантовомеханические вычисления были представлены, например, в работах Коллмана (Kollman) [4]. Наиболее простая и часто применяемая модель - это использование частичных зарядов, центрированных на атомах. Однако, более точным вариантом является использование частичных зарядов [5], распределенных по многим точкам.
Электростатический потенциал взаимодействия //-ой молекулы растворенного вещества получают из мультипольного разложения в ряд вплоть до октуполей: заряд, дипольный, квадрупольный и октупольный моменты, соответственно, a Fa, Fab, Fatc - электрическое поле, градиент поля и гессиан поля [э].
Рассматривались различные варианты получения мультипольных разложений [6,7], но в пакете GAMESS (US) реализован метод Стоуна распределенного мультипольного анализа (РМА).
Поляризацию фрагментов под действием электрического ноля молекул из КМ части описывают самосогласованной возмущенной моделью, используя локализованные молекулярные орбитали (ЛМО). Используя ЛМО из расчета Хартри-Фока для изолированных молекул находятся локализованные дипольные поляризуемости а„ь :
Экспериментальные сведения о реакциях с участием сериновых протеаз
Примерно одна треть протеаз может быть классифицирована как сериновые протеази из-за наличия остатка серина в активном центре. Консервативным фрагментом данного подкласса является система Asp - His - Ser, т.е. каталитическая триада. Недавно были найдены сериновые протеазы, содержащие несколько измененную каталитическую триаду, где, например, остаток аспарагиновой кислоты заменен глутаминовой кислотой или остатком гистидииа.
Существуют также протеазы, в которых катализ происходит с участием диады Ser - His или только одного аминокислотного остатка, например, Ser в пенициллинацилазе [23,24].
Каталитическая триада, образующая активный центр химотрипсина, представлена аминокислотными остатками Serl95, Aspl02 и His57. Каталитическая триада переплетена сетью водородных связей, которые в основном наблюдаются между парами атомов N81-H His57 и 051 Похожие водородные связи наблюдаются и в случае комплекса с ингибитором фермента эглином С, ацилферментным комплексом и аналогом переходного состояния -трифторкетонным комплексом (рис. 2) [ ]. комплекс с эглином С ацил-ферментный комплекс трифторкетонный комплекс
Рис. 2. Различные комплексы и сеть водородный связей в активном центре химотрипсина по результатам рентгеноструктурных данных (цифрами обозначены расстояния в Группа ОН Ser2I4 образует водородную связь с 061 Aspl02 в сериновых протеазах типа трипсина. Водородные связи также фиксируются между 082 Aspl02 и группами NH главных цепей А1а56 и His57; считается, что эти связи взаимно ориентируют Asp 102 и His57 [ , ].
Другой неотъемлемой компонентой фермента является оксианионовая дыра, образованная группами NH Gly 193 и Serl 95 пептидной цепи. Эти группы формируют окрестность, которая активирует карбонильную группу подвижной пептидной связи и стабилизирует отрицательно заряженный оксианион тетраэдрического интермедиата [25].
Адсорбционный центр включает полипептидную связывающую часть и связывающие карманы для боковых цепей белкового субстрата. Исследования специфичности протеаз обычно основывается на рассмотрении P1/S1 взаимодействия (по номенклатуре Счечтера-Бергера, где Р1-Р1 относится к пептидным остаткам на ацильнои и уходящей группе, соответственно, а смежные наружные пептидные остатки SI, SP и т.д. относятся к соответствующим центрам связывания фермента), а затем на рассмотрении взаимодействий P2-Pn/S2-Sn [23].
Специфичность химотрипсин-подобных сериновых протеаз обычно характеризуется в терминах P1-S1 взаимодействия. Sl-центр представляет собой карман, смежный к Serl95, образованный из аминокислотных остатков 189-192, 214-216 и 224-228. Serl89, Gly216 и Gly226 формируют глубокую гидрофобную полость в химотрипсине, образуют отрицательно заряженный Sl-центр, отвечающий за специфичность к субстратам, содержащих Arg или Lys в Р1-центре. Гидрофобные взаимодействия определяют положение полипептидной цепи в активном центре фермента [ , ]. Тип взаимодействия P1/S1 вносит основной вклад в специфичность сериновых протеаз [ ].
Предпосылки к изучению реакции гидролиза метилтрифосфата в воде
Одним из важнейших процессов, протекающих в живых системах, является гидролиз фосфатных эфиров. Аденозинтрифосфат (АТФ) является резервуаром биологической энергии, и его гидролиз приводит к перераспределению этой энергии. ДНК и РНК также представляют собой фосфоэфиры, а их стабильность определяется энергией активации реакции гидролиза фосфатных эфиров.
Для понимания механизмов химических реакций, происходящих в сложных биологических системах, как правило, рассматривают наиболее простые аналогичные реакции. Так, в литературе до сих пор появляются работы, посвященные реакции гидролиза метилфосфата и метилтрифосфата [57].
Максимальное значение константы скорости для реакции гидролиза метилтрифосфата составляет SxlO"6 с"1 при 373 К и рН = 4.2 [iS]. Еще в 1955 году сделано предположение, что механизм реакции имеет диссоциативный характер: на первом этапе происходит образование РОз аниона, который в последствие реагирует с водой, образуя Н2РО4 [5 ].
Высказывались сомнения, что Р03 может существовать как свободный анион [60]. Кинетические эксперименты демонстрировали невозможность образования свободного РОз аниона в протонных растворителях [6]. В работе [62] показано, что кластеры РОз"-(Н20)п стабильны в газовой фазе с числом молекул воды в системе до двух. Добавление третьем молекулы приводит к изомеризации и образовании ортофосфата и двух молекул воды.
Альтернативный механизм - ассоциативный - включает образование пентакоординационного интермедиата, имеющего форму тригоналыюй бипирамиды [63]. Подобный механизм реакции имеет место и для реакций гидролиза эфиров карбоновых кислот, при этом присоединение новой частицы и уход старой происходит синхронно.
В работе [ ] Варшел изучал энергетику реакции гидролиза метилфосфата в случае и ассоциативного, и диссоциативного механизмов. Поиск стационарных точек осуществлялся методом Хартри-Фока в базисе 6-31G . В стационарных точках также приведены расчеты энергии в точке с помощью методов теории возмущений MP2/6-31+G . Эффекты сольватации учтены с помощью модели
Лангевеновских диполей [ ]. В результате авторы делают вывод, что энергетические барьеры одинаковы для ассоциативного и диссоциативного механизма реакции и варьируются от 24 до 42 ккал/моль в зависимости от уровня расчетов. Делается предположение, что в случае ферментативной реакции трифосфатов, этот процесс может проходить любым путем, что зависит от конкретного электростатического окружения.
В этой же работе можно найти и экспериментальное значение активационного барьера для гидролиза гуанозинтрифосфата в водном растворе, который оценивается в 27,5 ккал/моль, основываясь на значении константы скорости равной 5,4xl0"s с 1 [63].
Гидролиз фосфатов также изучался с помощью методов квантовой химии. В работе [бз] изучалась реакция изомеризации кластеров 0{ (игО)п в H2P04 (H20)n.i (п=1,2,3). Расчет энергии в стационарных точках осуществлялся методом самосогласованного поля (ССП) и с использованием теории возмущений второго порядка Меллера-Плессе. Для п=1 энергетический барьер составил 32 ккал/моль (метод ССП) и 22 ккал/моль (метод МР2) с использованием базисного набора DZP с добавлением диффузных функций. Барьеры уменьшались примерно на 5 ккал/моль с участием дополнительных молекул воды (п=2,3).
В статье [ ] моделировали реакцию гидролиза депротонированного метилтрифосфата, явно окруженного молекулами воды в присутствии катиона Mg с использованием метода молекулярной динамики в варианте Карра-Парринелло. В работе рассматриваются серии молекулярно-динамических траекторий при трех различных координатах реакции. Сначала, расстояние между Ow - каталитической молекулой воды и Рт было зафиксировано, а при постепенном уменьшении этого расстояния, свободная энергия увеличивалась до максимального значения 39,1 ккал/моль при 1.9 А, приводя к пентавалентному интермедиату с Ртв центре. Этот путь связан с ассоциативным механизмом реакции.
Особенности протекания реакции гидролиза АТФ в миозине
Миозин - фибриллярный белок, один из главных компонентов сократительных волокон мышц (миофибрилл). Он составляет от 40 до 60 процентов всех мышечных волокон в организме человека. При соединении миозина с другим белком миофибрилл - актином - образуется актомиозин -основной структурный элемент сократительной системы мышц. Важнейшее свойство миозина - способность расщеплять АТФ - было открыто В.А. Энгельгардтом и М.Н. Любимовой в 1939 г.
Миозин - представитель интенсивно изучаемой в последнее время группы белков - «молекулярных моторов», осуществляющих в живых клетках механохимическое преобразовании энергии гидролиза АТФ в механическую работу при взаимодействии с актиновыми филаментами. Все миозины подразделяют в настоящее время на 17 классов [74,75]. Все известные в настоящее время миозины являются олигомерами и состоят из нескольких полипептидных цепей.
Самыми известными и наиболее хорошо изученными представителями семейства миозинов являются миозины второго класса (миозины II), к которым относятся все мышечные миозины и многие немышечные миозины [ ].
В состав молекулы миозина скелетных мышц входят шесть полипептидных цепей - две так называемые тяжелые цепи миозина и четыре лёгкие цепи миозина. Эти цепи прочно ассоциированы друг с другом нековалентными связями и образуют единый ансамбль, который собственно и является молекулой миозина
Тяжелые цепи миозина имеют большую молекулярную массу (200 - 250 кДа) и сильно асимметричную структуру. У каждой тяжелой цепи есть длинный спирализованный хвости маленькая компактная головка. В области шейки, то есть при переходе грушевидной головки тяжелой цепи миозина в спиральный хвост, располагаются короткие цепи миозина, имеющие молекулярную массу 18-28 кДа.
Скелетные мышцы состоят из многоядерных клеток, связанных возбудимой плазматической мембраной, по которой приходит нервный импульс, инициирующий сокращение мышцы [ ]. Мышечные клетки состоят из множества сократительных волокон - миофибрилл, расположенных параллельно друг другу. Структурно-функциональными единицами миофибрилл являются саркомеры, которые располагаются вдоль мышечных волокон через каждые 2.3 мкм (рис.51).
