Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
ГЛАВА I. РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТОВ 9
ГЛАВА 2. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ БЕЛОК СИНТЕЗИРУЮЩЕГО АППАРАТА КЛЕТКИ ПРИ ЗАМОРА ,ЖИВАНИИ-ОТТАИВАНИИ 17
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ-ОТТАИВАНИЯ НА ЛИ30 СОМЫ И ШТОХОНДРИИ 25
РАЗДЕЛ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
1.1. Методы выделения субклеточных структур и тканевых препаратов 35
1.2. Бес клеточная белоксинтезирующая система из клеток печени крыс 38
1.3. Методы, применявшиеся для очистки ингибитора белкового синтеза 39
1.4. Методы изучения структуры мембран 46
1.5. Аналитические методы 49
1.6. Постановка криобиологических исследований 49
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 51
ГЛАВА 2. ВКЛАД СУБКЛЕТОЧНЫХ ШРАКЩЙ В НАРУШЕНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОСИНТЕЗА БЕЖА ПРИ ЗАМОРАЖИ ВАНИИ-ОТТАИВАНИИ Стр.
ГЛАВА 3. ВЗАИМОСВЯЗЬ СТЕПЕНИ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ
ЛИ30С0М И МИТОХОНДРИЙ ПРИ ЗАМОРАЖИВАНЙИ ОТТАИВАНИИ И ВЫХОДА ИНГИБИТОРА БЕЛКОВОГО СИНТЕЗА 65
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ И УСТАНОВЛЕНИЕ ПРИРОДЫ ИНГИБИ ТОРА ТРАНСЛЯЦИИ ИЗ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС 80
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ КРЙОПРОТЕКТОРОВ НА ИНГИБИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ЛИ30С0М И МИТОХОНДРЙ В ОТНОШЕНИИ БЕЛОК-СИНТЕЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ ОТТАИВАНИИ 99
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109
ВЫВОДЫ 116
ЛИТЕРАТУРА 118
Введение к работе
Широкое применение в народном хозяйстве методов низкотемпературного хранения биологического материала позволило создать ряд высокоэффективных технологий криоконсервирования клеток крови, костного мозга, тканей, микроорганизмов и т.д. Г 37, 55,62,64,95,100,110 3 . Вместе с тем, несмотря на достигнутые успехи, становится ясным, что дальнейший прогресс в этом направлении невозможен без глубокого изучения фундаментальных биохимических механизмов, лежащих в основе процессов криоповреж-дения и репарации структур клетки. В настоящее время интенсивно развиваются экспериментальные исследования, касающиеся выяснения природы криолабильности и криорезистентности биологических мембран Е10,12,111,178 3 , ферментных систем С 215,221,227j, выяснены некоторые общие закономерности механизмов криоповреж-дения и криопротекции клеточных суспензий С 11,43,62,63,164,173, 177 J .
Одним из ключевых биохимических процессов клетки, определяющих ее функциональную полноценность и уровень репаративных возможностей, как известно, является биосинтез белка. Однако, как показывает анализ литературных данных, механизмы криоповрежде-ния белок-синтезирующего аппарата клеток и особенности его функционирования после криоконсервации биологического материала изучены недостаточно. Имеются лишь единичные исследования,в которых изучалась суммарная белок-синтезирующая активность различных клеток и тканей в условиях замораживания L16,20-23,61,65 J или криолабильность отдельных звеньев белок-синтезирзгющей системы - ДЕШ, РНП полирибосом и др. С46-50,72,73,ИЗ,133,196,236J. Практически не освещенным до настоящего времени остается вопрос о влиянии замораживания-оттаивания и возможных механизмах криоповреждения и криопротекции конечного звена белок-синтези-рующей системы клетки - трансляции, хотя именно этот этап во многом определяет количественный и качественный уровень суммарного белкового синтеза в клетке. Шеющиеся немногочисленные работы по данной проблеме, выполненные на бесклеточных системах, показывают,что криочувствительность отдельных компонетов белкового синтеза во многом зависит от источника их выделения.Так, установлено, что белок-синтезирующая активность бесклеточных систем,выделенных из зародышей пшеницы или клеток асцитной карциномы Кребс Понижается при замораживании-оттаивании в результате криоповреждения факторов инициации Г26J. С другой стороны, показано, что бесклеточная система белкового синтеза из печени крыс, характеризуется криорезистентностью [227,тогда как замораживание гомогената и тканевых препаратов печени крыс приводит к значительному торможению белок-синтезирующей активности. Отмеченные факты явились исходной теоретической предпосылкой для обоснования рабочей гипотезы, согласно которой тормозящее влияние замораживания-оттаивания на белковый синтез in Situ может быть обусловлено не только первичным криоповреж-дением определенных компонентов белок-синтезирующей системі,но и воздействием на этап трансляции факторов вторичного порядка-ингибиторов (или ингибитора), освобождающихся из поврежденных клеточных структур.
Учитывая изложенное, целью данной работы явилось выяснение причин криоповреждения белок-синтезирующего аппарата в клетках печени крыс после замораживания-оттаивания и возможности ее защиты некоторыми криопротекторами.
Конкретными задачами данного исследования являлось:
1. Выяснить вклад повреждения отдельных субклеточных структур (ядер, митохондрий, лизосом и микросом), подвергавшихся замораживанию-оттаиванию в угнетение биосинтеза белка в бесклеточной системе из печени крыс;
2. Установить взаимосвязь степени структурных изменений лизосом и митохондрий при замораживании-оттаивании и выхода ингибитора белкового синтеза;
3. Выделить и дать характеристику возможного ингибитора трансляции, освободившегося из митохондрий печени крыс при замораживании-оттаивании;
4. исследовать возможность криопротекции выхода ингибитора белкового синтеза при замораживании-оттаивании лизосом и митохондрий с помощью некоторых криопротекторов (глицерин, диме-тилсульфоксид).
В работе впервые изучена роль криоповреждения субклеточных структур в нарушении синтеза белка. Показано, что в процессе замораживания-оттаивания гомогената печени крыс происходит значительное угнетение белок-синтезирующей активности, обусловленное влиянием на этап трансляции ингибиторов, освобождающихся из субклеточных структур лизосом и митохондрий. Ингибирую-щие свойства лизосом в отношении белок-синтезирующей активности связаны с освобождением из них активной рибонуклеази. Уровень освобождения ингибитора из лизосом существенно зависит от выбранного режима замораживания-оттаивания, в то время как выход ингибитора из митохондрий происходит при всех исследуемых режимах холодового воздействия. Ингибитор белкового синтеза, поступающий из митохондрий, локализуется в митопластах.
Установлено, что различия в угнетении синтеза белка в результате действия низких температур объясняются неодинаковой степенью разрушения субклеточных органелл. Митохондрии обладают большей криолабильностью, чем лизосомы. Показано, что переохлаждение суспензии митохондрий до температуры кристаллизации свободной воды не приводит к высвобождению ингибитора синтеза белка. Выход ингибитора из органелл происходит с момента кристаллизации и достигает своего максимума при эвтектической температуре среды замораживания.
В работе впервые сделана попытка выделения и определения природы ингибитора трансляции, освобождающегося в результате замораживания-оттаивания из митохондрий печени крыс. Установлено, что ингибитор представляет собой вещество белковой природы, молекулярный вес которого находится в пределах 20000-100000. Ингибитор не является РНКазой, АТФазой или протеиназой.
Показана возможность криопротекции выхода ингибиторов при различных режимах замораживания- оттаивания митохондрий и ли-зосом с помощью криопротекторов - глицерина и ДМС0.
Работа является фундаментальным исследованием, посвященным изучению причин криоповреждения белок-синтезирующего аппарата в клетках печени крыс после замораживания-оттаивания и возможности ее защиты некоторыми криопротекторами. Полученные результаты расширяют существующие представления о действии замораживания-оттаивания на состояние белок-синтезирующего аппарата в клетках печени и имеют практическую значимость для обоснования оптимальных температурных режимов замораживания и выбора криопротекторов с целью разработки эффективных способов криоконсер-вации биологического материала.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: П-м Всесоюзном стшозиуме "Структура и функции лизосом" (Новосибирск, 1980); Девятой конференции молодых ученых Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (Харьков, 1981); 1У-м Украинском биохимическом съезде (Днепропетровск, 1982).
По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Диссертационная работа выполнена в Институте проблем криобиологии и криомедицины АН УССР. Работа выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ института, номер государственной регистрации 79015696, а также по Всесоюзной проблеме № 2.28.8; задание №2.28.8.24 "Структура и функции биологических мембран".
