Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Механизмы криоповреждения и криозаищты 10
1.2. Электрические параметры биологических объектов 23
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы 39
2.2. Методы 40
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Электрические параметры суспензии нативных эритроцитов 57
3.2. Реакция эритроцитов на контакт с растворами ПЭО-1500, хлористого
натрия и сахарозы 88
3.3. Реакция эритроцитов, экспонированных с различными концентрациями ПЭО-1500, на возвращение в изотонические условия 132
3.4. Экспериментальная проверка гипотез о связанных с осмосом причинах повреждения эритроцитов 153
3.5. Электрометрическое исследование модели процесса кристаллизации физиологических
сред 169
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 179
ВЫВОДЫ 187
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ 189
ЛИТЕРАТУРА 190
Введение к работе
Современное состояние криобиологии характеризуется повышенным интересом к исследованию процессов, протекающих на всех этапах низкотемпературного консервирования биологических объектов, поскольку разработка новых методов криоконоервирования уже не может проводиться на уровне интуитивного подбора сред и условий замораживания-отогрева, а должна опираться на четкое понимание механизмов криоповреждения и криозащиты.
Однако, несмотря на многолетнюю историю, вопрос о ведущих факторах, определяющих жизнеспособность замороженного биологического материала, остается открытым. Это связано с одновременным протеканием различных процессов, реализуемых в замораживаемом биоматериале, со сложностью в реальных условиях исключения какого-либо из факторов с целью изучения действия остальных. Установленные причины повреждения клеток при низкотемпературном консервировании все еще остаются предметом дискуссии и число их продолжает увеличиваться.
К нерешенным актуальным проблемам криобиологии относится создание метода низкотемпературного консервирования эритроцитов, при котором перед трансфузией не нужно удалять из суспензии криозащитную добавку [l2,92] . Все разработанные до настоящего времени способы низкотемпературного консервирования отдельных фракций периферической крови человека неудовлетворительны по той причине, что на завершающем этапе требуют прове- дения трудоемкой дорогостоящей стерильной операции отмывания от криопротектора, что не позволяет использовать их в ординарных условиях и проводить трансшузию в широких масштабах [92] .
Хотя применяемые криопротекторы, как правило, физиологически мало токсичны, это не исключает процедур?/ отмывания, так как контакт деконсервированных клегок с нормальной физиологической средой приводит к гибели большого количества клеток за счет постгипертонического лизиса [25,204-] .
Теоретический анализ процессов массопереноса в предельном случае не проникающих через клеточную мембрану веществ приводит к выводу, что чувствительность клеток к постгипертоническому лизису в этом случае должна снижаться [42] . В связи с этим при разработке способов низкотемпературного консервирования эритроцитов, не требующих удаления криопротектора из суспензии перед трансфузией, большие надежды связывались с применением в качестве криозащитных агентов не проникающих в клетки высокомолекулярных полимеров и, в частности, полимергомолов полиэтиле-ноксида с молекулярной массой от 1000 до 4000 [92] . Однако, до сих пор эти надежды не оправдались. Одним из препятствий явилась опасность накопления в организме реципиента высокомолекулярного .полимера при массивных трансфузиях, что снижает допустимую дозу и приводит, в конечном счете, к необходимости частичного удаления криопротектора из суспензии эритроцитов до переливания [38,92] .
Кроме того, вопреки теоретическим прогнозам, оказалось, что применение высокомолекулярных веществ в качестве криопротек-торов не исключает повреждение деконсервированных клеток при контакте с изотонической средой [67] . Это обстоятельство резко снижает эффективность и целесообразность внутривенного вве- дения деконсервированной эритроцитарной массы без предварительного отмывания даже в сравнительно небольших количествах.
В настоящее время стало очевидным, что трудности, возникшие на пути к безотмывочному варианту низкотемпературного консервирования эритроцитов, могут быть преодолены лишь в результате всестороннего изучения реакции эритроцитов на контакт с растворами не проникающих через клеточную мембрану веществ и выявления механизма повреждения клеток в результате этого воздействия.
Целью настоящего исследования является изучение электрических и структурных параметров цитоплазмы и мембраны эритроцита при циклическом изменении состава окружающей его среды: физиологическая среда - раствор не проникающего через клеточную мембрану криопротектора 1130-1500 - физиологическая среда.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить электроспектроскопические характеристики, структурную целостность и динамику изменения формы эритроцитов на этапе экспозиции с растворами ПЭО-1500 различной тоничности.
Изучить электроспектроскопические характеристики, структурную целостность и динамику изменения формы эритроцитов в процессе одно- и многоступенчатого удаления криопротектора из суспензии.
Изучить влияние ПЭО-1500 на электропроводность и вязкость консервирующих сред.
Для достижения цели исследования и для решения поставленных перед нами задач наиболее эффективными и адекватными явились электроспектроскопические методы исследования, поскольку они позволили изучить параметры среды суспендирования и клеток в исследуемых условиях без дополнительной фиксации материала, что особенно важно при изучении слабых взаимодействий. Использование этих методов дало возможность оценить состояние мембраны и внутреннего содержимого эритроцитов на этапе экспозиции с криопротектором в условиях с различной концентрацией ПЭО-1500 и ионов Ncl+ .
Сложность изучаемых явлений, влияние на результаты экспериментов большого числа параметров обусловили необходимость независимого измерения параметров, характеризующих статус клеток, с помощью других, более традиционных методик. Для оценки сохранности клеток привлекали фотоколориметрический метод определения свободного гемоглобина в суспензионной среде, метод измерения концентрации эритроцитов в камере Горяева, пламеннофою-метрическое определение концентрации ионов натрия и калия в суспензионной среде. Изменение формы эритроцитов изучено методом фазово-контрастной микроскопии, а также определением среднего диаметра эритроцитов по модифицированному методу Паппен-гейма. Микровязкость цитоплазмы эритроцитов оценивали по подвижности спинового зонда в цитоплазме на ЭПР-спектрометре. Физико-химические свойства растворов ПЭО-1500 исследовали измерением электропроводности и вязкости сред, поверхностного натяжения и поверхностной активности ПЭО-1500.
Примененный впервые комплекс электроспектроскопических методов позволил всесторонне исследовать электрические параметры эритроцитов и консервирующих сред на этапе экспозиции с криопротектором, обнаружить особенности взаимодействия эритроцитов с ПЭО-1500 в случае присутствия в криозащитной среде ионов натрия. Исследование электрических параметров суспензии нагивных эритроцитов впервые показало, что результат криоконсервирования может быть улучшен за счет выбора степени разведения суспензии с криозащитной средой с учетом исходных характеристик суспензии: для суспензий с исходной удельной электропроводностью ниже 0,27 См/м замораживание-отогрев приводит к минимальному повреждению эритроцитов при разведении суспензии с 20 jS-ным ПЭО-1500 в соотношении 3:1, а при более высокой удельной электропроводности - в соотношении 1:1. Впервые показано, что по мере увеличения концентрации ПЭО-1500 в криозащитной среде результат замораживания-отогрева эритроцитов все слабее зависит от плотности клеток в замораживаемой суспензии. Таким образом., понятие об оптимальной концентрации криопротектора в криозащитной среде не является абсолютным, а зависит от других режимных параметров консервации. Получено экспериментальное подтверждение неправомочности определения показателей сохранности замороженной-отогретой эритромассы без отмывания ее от криопротектора. Комплексное исследование электрических и структурных параметров эритроцитов впервые показало, что присутствие в криозащитном растворе ПЭО-1500 ионов натрия сенсибилизирует эритроциты к постгипертоническому лизису.
Проведенные исследования обосновывают целесообразность применения высокомолекулярных полиэтиленоксидов в качестве криопротекторов для разработки эффективного способа низкотемпературной консервации эритроцитарной массы, не требующего проведения трудоемкой операции отмывания от криопротектора перед трансфузией. Электроспектроскопические исследования суспензии эритроцитов при циклическом изменении состава окружающей клетки среды могут быть использованы в лекционных курсах для студентов биологических факультетов, специализирующихся в области биофизики. Материалы диссертации по электрометрическому исследованию модели процесса кристаллизации физиологических сред вошли в монографию "Низкотемпературная кристаллизация в биологических системах", 1977 г.
Основные положения диссертации опубликованы в открытой печати в 9 научных работах и докладывались на 5 Всесоюзных и областных конференциях.
Основные положения, выносимые на защиту:
Максимальную сохранность эритроцитов, ( 75,0 * 3,0) JS, после цикла замораживание-отогрев с учетом потерь при возвращении в изотонические условия обеспечивает 40 %-нШ водный раствор ПЭО-1500 при разведении с эритроцитарной массой в отношении 1:1.
Форма эритроцитов, электрические и структурные параметры определяются как осмотическим давлением, так и составом внешней среды при неизменном осмотическом давлении.
Сохранность эритроцитов на этапе экспозиции с ПЭО-1500 не коррелирует с объемом обезвоженных клеток и со скоростью изменения их объема, но становится зависящей от этих параметров при отмывании деконсервированных эритроцитов.
Присутствие в растворе ПЭО-1500 ионов натрия сенсибилизирует эритроциты к постгипертоническому лизису.
Механизмы криоповреждения и криозаищты
Важнейшей задачей криобиологии является раскрытие механизмов криоповреждений и криозащиты биологических структур и разработка на этой основе методов консервирования, обеспечивающих длительное сохранение жизнеспособности биологического материала [87] .
Наиболее перспективным в настоящее время признано консервирование биологических объектов при температуре жидкого азота (-196С), которое позволяет осуществить обратимую остановку жизненных процессов [10,86,88] .
Процесс замораживания до сверхнизких температур условно можно разделить на несколько этапов, различающихся физико-химическими условиями, в которых оказывается биологический объект, а, следовательно, и основными механизмами криоповреждений: I) охлаждение объекта до О С; 2) охлаждение от О С до зоны фазовых переходов; 3) замораживание до полного затвердевания системы; 4) охлаждение затвердевшего образца до -196 С.
Важной характеристикой процесса замораживания биоматериала является скорость снижения температуры на каждом этапе.
Установлено, что быстрое падение температуры до О С приводит к повреждению или даже гибели некоторых клеток ("температурный шок"), в то время как медленное их охлаждение в тех же температурных пределах практически безвредно [40,79,158,198] . Реакция клеток на быстрое охлаждение до околонулевых температур зависит от состояния клетки, предварительной обработки [l45] , среды суспендирования [202J .
Экспозиция эритроцитов в гиперконцентрированных растворах Ь1а(Л при +25 С приводит к повышению их чувствительности к температурному шоку [l58,I8l] , однако, более длительная экспозиция может повышать устойчивость клеток к дальнейшему охлаждению [І8І] . тгоїшь и ГЇШУІЛ [204] показали, что эритроциты подвергаются действию температурного шока и в гипертонических растворах сахарозы. Эритроциты, охлажденные от +25 С до О С в гипертонических растворах сахарозы (40 % вес/объем) и ИЛ (2,53 % вес/объем), повреждаются при ресуслендировании в изотонических растворах больше, чем контрольные, содержащиеся при постоянной температуре [I8l] .
Методы
Электропроводность суспензий и растворов на частотах от 10 кГц до 1,5 МГц измеряли компенсационным методом на установке, собранной нами из унифицированных блоков. Блок-схема установки представлена на рис.1.
Питающее напряжение в диапазоне частот (10 200) кГц подавалось от генератора ГЗ-33, в диапазоне от 200 кГц до 1,5 МГц - от генератора ГЗ-4І. Мост полных проводимосїей J WM«3 2 фирмы RFT (ГДР) позволял раздельно определять активную и реактивную составляющие адмиттанса в диапазоне частот от 30 Гц до 1,5 МГц. Пределы измерений по активной составляющей (10 Ч 100) См, по реактивной составляющей - (0 122) мкФ. Максимальная погрешность прибора не превышала (І 2) %.
Достигаемая при помощи данного измерительного моста полных проводимостей скорость измерения по сравнению с другими мостами значительно больше, так как полное сопротивление измеряется по всему диапазону одинаково, как параллельное соединение действительных и мнимых проводимостей. В качестве индикатора баланса использовался ламповый вольтметр ВЗ-ІЗ.
Электрические параметры суспензии нативных эритроцитов
Исследовали электропроводность суспензии эритроцитов (естественный отстой) и плазмы доноров I, П и Ш групп крови. Измерена электропроводность эритроцитарной массы 90 доноров и плазмы 60 доноров.
Электропроводность эритромассы крови, стабилизированной гемоконсервантом Ш 76, принимает значения в диапазоне (0,15+0,5) См/м. Наибольшее количество доноров (50 ft от общего числа) имеют удельную электропроводность эритромассы в диапазоне (0,2 0,3) См/м, электропроводность эритромассы 14 % доноров лежит в пределах (0,15 0,2) См/м, а эритромассу с большой электропроводностью (0,4 0,5) См/м имеет около II % доноров.
Внутри каждой из групп крови распределение доноров по электропроводности эритроцитарной массы аналогично распределению для всех 90 доноров, однако кривые распределения для доноров I и П групп сдвинуты относительно друг друга (рис.8).
Электропроводность плазмы крови исследованных доноров принимает значения в диапазоне (1,0 1,4) См/м. 60 % доноров имеют плазму в диапазоне электропроводносшей (1,15 1,25) См/м. Функция распределения доноров по значениям электропроводности плазмы симметрична (рис.9).
Удельная электропроводность крови является интегральным показателем, зависящим от электропроводности плазмы, концентрации клеток и их морфологических особенностей.
В табл.2 приведены данные для 48 доноров различных групп крови по электропроводности эритромассы (естественный отстой), плазмы и концентрации эритроцитов. Коэффициент корреляции электропроводности плазмы и эритромассы незначителен: Z =0,29 (Р 0,95). Такое невысокое значение t можно объяснить тем, что при больших концентрациях эритроцитов различия в электропроводности плазмы вносят небольшой вклад в общую электропроводность суспензии. Об этом свидетельствует и существенное повышение частного коэффициента корреляции при Рг = Corvft - Z-= 0,78 (Р 0,95).
