Введение к работе
Актуальность исследования
Гипоксия - широко распространенное явление, возникающее как в условиях дефицита кислорода во внешней среде, так и в результате различных патологических состояний, связанных с нарушением функций дыхательной, сердечно-сосудистой систем, а также транспортной функции крови. Несмотря, на многолетнюю историю вопроса, интерес к данной проблеме не ослабевает, более того, в последнее время появляется все больше работ, посвященных клеточным механизмам гипоксических состояний (Полякова И.А., Лейкина М.И., 1994, Самойлов МО., Семенов Д.Г., 1999, Shinetti M.L., Sbarbat R., 1989, Narasimham L., Parinandi, Viswanathan N., 2002, Лукьянова Л.Д., 2000).
Важнейшей задачей в клинической практике является купирование постгипоксических состояний, адаптация организма к гипоксии. Особенно необходимо это в тех областях жизнедеятельности человека, где существует риск воздействия экзогенной гипоксии. Как правило, такой риск обусловлен профессиональной деятельностью, и возникновение гипоксических условий является чрезвычайным происшествием в результате отказа или технической неисправности систем жизнеобеспечения. Гипоксия в данных условиях может протекать с различной скоростью, вызывая тяжелые физиологические нарушения. Космонавты, летчики, подводники, пожарники, шахтеры - это основная группа риска.
В последнее время активно рассматривается возможность создания газовых дыхательных смесей с использованием индифферентного газа аргона в качестве газа-разбавителя кислорода. Такие дыхательные смеси в условиях недостатка кислорода в окружающей среде снижают негативное воздействие гипоксии и позволяют человеку в этих условиях более длительное время сохранить концентрацию внимания и адекватность действий. В частности, было показано (Павлов Б.Н., и др., 2000, Солдатов П.Э., и др., 2000), что присутствие Аг в дыхательных газовых смесях оказывает положительное действие на переносимость организмом гипоксии по целому ряду параметров, что, по мнению авторов, связано с его физиологической активностью, влияющей на внутриклеточный метаболизм.
Физиологические эффекты индифферентных газов, таких как N2, Не, Н2, активно изучаются в условиях повышенного давления газовой среды, где их использование обусловлено необходимостью купирования азотного наркоза, нервного синдрома высоких давлений, декомпрессионной болезни (Смолин В.В., и др., 1999,2005, Bennett 1984, 2002). Аргон, обычно не используют в практике глубоководных водолазных спусков, поскольку плотность этого газа больше плотности азота, что может создать проблемы в функционировании дыхательной системы при высоком давлении газовой
6НМНОТЕМ і
среды. Его наркотическая способность выше, чем у азота, и при повышении давления уже до одной атмосферы он вызьгаает наркотический эффект у человека и млекопитающих (Лазарев Н.В., 1941-1944, Смолин В.В., Рапопорт К.М., 1968). Выраженных физиологических эффектов индифферентных газов (за исключением ксенона и криптона) при нормальном давлении не зафиксировано, хотя показано, например, что замена азота на гелий в дыхательной газовой смеси приводит к изменению функций легких (Bennett Р.В., Hayward А., 1976).
Таким образом, вопрос о том, какой вклад вносят индифферентные газы в течение физиологических процессов при гипоксии, остается открытым. Немногочисленные данные по этой проблеме получены при исследованиях, проводимых на целом организме, и в силу такого подхода во многом отражают не только эффекты влияния гипоксии, создаваемой при помощи индифферентных газов, но и весь спектр физиологических реакций в этих условиях. Исследования в этой области на уровне клетки немногочисленны и зачастую противоречивы (David A., Lawrence R., 1983, Schinetti M.L., Sbarbati R., 1989, Schafer С, Ladilov Y. V., Siegmund В., 2000).
Такая ситуация обусловлена рядом причин.
Во-первых, наблюдаемые на определенных клетках изменения могут быть специфическими только для данного типа клеток, не позволяя дать оценку полученных эффектов для клеточного уровня в целом. Поэтому очень важен сам выбор того или иного типа клеток. На наш взгляд, для изучения влияния гипоксии in vitro наиболее адекватным выбором был бы выбор тех клеток, которые в силу своих функциональных особенностей или принадлежности к тем или иным органам и тканям сталкиваются с условиями гипоксии наиболее часто и, соответственно, обладают механизмами коррекции своих функций, адаптации к этим условиям (например, клетки эндотелия и имуннокомпетентные клетки).
Во-вторых, условия создания гипоксии, используемые в экспериментальных работах, значительно разнятся. Необходимо отметить, что важен не только сам метод дезоксигенации, но и контроль других внешних параметров, которые при определенных условия могут влиять на клетку не менее активно, чем снижение парциального уровня кислорода в среде.
И, наконец, необходимо учитывать разнообразие изучаемых внутриклеточных параметров и методов их исследования. По всей видимости, при изучении влияния гипоксии in vitro, измеряемые внутриклеточные параметры должны быть одинаково "показательны" для любого клеточного типа, в какой-то мере носить интегральный характер, отражая состояние внутриклеточных систем и функциональный статус клетки. В полной мере к таким параметрам можно отнести систему внутриклеточной рН-регуляции, систему регуляции активных форм
кислорода, которая в последнее время все чаще рассматривается, как вполне самостоятельная полноценная мессенджерная система, играющая важную роль в клеточной физиологии при различных экстремальных состояниях, в том числе и таких, как гипоксия и реоксигенация.
Нельзя не остановиться и на таком важном для живых систем процессе, как реоксигенация. Во многих случаях восстановление парциального давления кислорода в тканях несет не менее повреждающий эффект, чем сама гипоксия. Именно поэтому важно знать механизмы и динамику этого повреждения для выработки оптимальной тактики и стратегии выхода из постгипоксических состояний.
Таким образом, выбор наиболее адекватных типов клеток, исследуемых параметров, методических подходов для моделирования процессов гипоксии и реоксигенации in vitro с использованием индифферентных газов, применение достижений современной науки и техники, дающих качественно новые возможности для проведения исследований на уровне клетки могут пролить свет на многие аспекты в данном научном направлении.
Цель исследования
Целью работы явилось исследование влияния нормобарической гипоксии, создаваемой при помощи аргона или азота, на изменения внутриклеточного рН и уровня активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах мышей и эндотелиальных клетках человека.
Задачи исследования
-
Разработать на базе метода микрофлуориметрического анализа одиночных клеток программно-аппаратную исследовательскую систему для изучения эффектов гипоксии и реоксигенации in vitro.
-
Изучить влияние гипоксии и реоксигенации на целостность плазматических мембран перитонеальных макрофагов мышей и эндотелиальных клеток человека.
-
Исследовать влияние гипоксии и реоксигенации на динамику внутриклеточного уровня активных форм кислорода (АФК) перитонеальных макрофагов мышей и культуры эндотелиальных клеток.
-
Изучить влияние гипоксии, создаваемой при помощи индифферентных газов (аргона и азота), и последующей реоксигенации на внутриклеточный рН перитонеальных макрофагов мышей и эндотелиальных клеток человека.
-
Сравнить реакции клеток по изучаемым параметрам in vitro на гипоксические условия при использовании азота и аргона.
Научная новизна
В исследованиях на культивируемых клетках человека и животных в условиях посюянного мониторинга и автоматической коррекции физических и химических факторов среды инкубации впервые изучена динамика изменения внутриклеточного рН и внутриклеточного уровня активных форм кислорода при постепенном изменении парциального давления кислорода в среде. Показано повышение внутриклеточного рН и АФК в перитонеальных макрофагах и культивируемых эндотелиальных клетках человека в условиях нарастающей гипоксии.
Выявлена различная устойчивость эндотелиальных клеток человека и фагоцитов мышей к воздействию гипоксии и реоксигенации, оцениваемая по целостности плазматических мембран клеток.
Впервые показаны различия в динамике изменений внутриклеточных параметров в зависимости от использованного индифферентного газа для создания гипоксии in vitro.
Практическая значимость работы
Результаты проведенных исследований имеют важное значение для понимания механизмов формирования биологического ответа организма на уровне клетки при действии гипоксии и реоксигенации. Полученные данные должны быть учтены при анализе и купировании постгипоксических состояний, а также адаптации к гипоксии.
Разработанная программно-аппаратная исследовательская система для проведения исследований in vitro в условиях изменения парциального давления кислорода в среде может быть использована в работах, целью которых является изучение различных физико-химических параметров клетки. Система обладает достаточной гибкостью для широкого моделирования экспериментальных условий при изменении внешних физико-химических факторов и оценки изменения внутриклеточных параметров с помощью микрофлуориметрии.
Положения, выносимые на защиту:
-
Созданная программно-аппаратная система позволяет моделировать условия гипоксии и реоксигенации in vitro, проводить изучение внутриклеточных параметров с использованием флуоресцентных зондов.
-
Гипоксия и реоксигенация приводят к повышению уровня внутриклеточных АФК перитонеальных макрофагов и эндотелиальных клеток человека, и оказывает выраженное цитотоксическое действие на культивируемый эндотелий.
-
Постепенно нарастающая нормобарическая гипоксия приводит к повышению внутриклеточного рН культивируемых эндотелиальных
клеток человека и перитонеальных макрофагов мышей. Последующая реоксигенация сопровождается снижением уровня рНі до конгрольного значения в обоих типах клеток. 4. Изменение внутриклеточного рН в макрофагах не связано с работой №+/Н+-обменника, нарушением процессов окислительного фосфорилирования, процессов гликолиза.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ. Материалы исследований доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых, посвященных Дню космонавтики (2001-2003 гг.), Российской конференции «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях» (2000 г.), на X международном симпозиуме «Околого-физиологические проблемы адаптации» (2001 г.), на XII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (2002 г.), на 3-й Всероссийской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (2002 г.). Диссертация апробирована на кафедре биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБН РАН.
Структура и объем диссертации
