Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Физико-химические свойства гидроксиапатита 9
1.1. Синтетический гидроксиапатит как биометериал 9
1.2. Наноразмерный гидроксиапатит как компонент кальцифицированной атеросклеротической бляшки 11
1.3. Примесные центры в составе гидроксиапатита 14
1.4. ЭПР-спектроскопия гидроксиапатита 18
ГЛАВА 2 Методы расчета свойств дефектов и примесей из первых принципов 21
2.1. Теория функционала плотности 22
2.2. Периодические граничные условия 24
2.3. Базисный набор плоских волн 26
2.4. Приближение псевдопотенциалов 27
2.5. Применение метода функционала плотности в псевдопотенциальном приближении для исследования дефектов и примесей в твердых телах 28
2.6. Концентрация дефекта и энергия формирования 31
2.7. Комплексы 33
2.8. Расчет параметров спектров ЭПР из первых принципов 34
ГЛАВА 3 Образцы и методика исследования 39
3.1. Образцы синтетического и биогенного гидроксиапатита 39
3.2. Измерения ЭПР и ДЭЯР в образцах гидроксиапатита
3.3.Расчеты методом теории функционала плотности 41
ГЛАВА 4 Азотосодержашие примесные центры в структуре наноразмерного гидроксиапатита 43
4.1.Экспериментальные результаты 43
4.1.1.Спектры ЭПР 43
4.1.2.Времена релаксации 47
4.1.3.Спектры ДЭЯР 48
4.2. Численные расчеты методом функционала плотности 50
4.2.1.Пространственная структура дефекта 50
4.2.2.Энергия формирования дефекта 51
4.2.3. Структура парамагнитного центра NO32- 52
4.2.4.Константа сверхтонкой структуры 14N и g-фактор 55
4.2.6.Константы (супер)сверхтонкой структуры 1H и 31P 57
4.3. Заключение 60
ГЛАВА 5 Углерод-центрированные примеси в наноразмерном гидроксиапатите 62
5.1.ЭПР углеродсодержащих радикалов в биогенном и синтетическом гидроксиапатите 62
5.2. Взаимодействие с азотсодержащей примесью 67
5.3. Заключение 73
ГЛАВА 6 Ионы Mn2+ в структуре наноразмерного гидроксиапатита 75
6.1. Высокочастотный ЭПР ионов Mn2+ в кальцифицированной стенке сосуда и синтетическом гидроксиапатите 75
6.2. Исследование участков локализации ионов Mn2+методом теории функционала плотности 81
6.3. Эффекты содопирования в наноразмерном гидроксиапатите для ионов Mn2+ и NO3- 83
6.4.Заключение 92
Основные результаты и выводы 93
Список сокращений 96
Публикации автора 97
Литература 100
- Примесные центры в составе гидроксиапатита
- Применение метода функционала плотности в псевдопотенциальном приближении для исследования дефектов и примесей в твердых телах
- Численные расчеты методом функционала плотности
- Взаимодействие с азотсодержащей примесью
Примесные центры в составе гидроксиапатита
Необходимым свойством современных синтетических материалов для биологических и медицинских приложений является их биосовместимость: в своих физико-химических характеристиках они должны воспроизводить функциональность биогенных материалов, их сложную структуру, иерархичность, эффективность, надежность и адаптивность, обеспечивая тем самым оптимальное взаимодействие с биологическими тканями. На сегодняшний день проведен существенный объем химических, физических и биологических исследований, в результате которых удалось воплотить в синтезируемых материалах многие из перечисленных свойств [4].
Гидроксиапатит (ГАп) в организме млекопитающих является основным неорганическим компонентом костной ткани и зубов. В биомедицине ГАп и другие формы неорганических фосфатов кальция находят широкое применение как материалы для имплантации костной ткани, для адресной доставки к биологическим тканям лекарственных средств, флуоресцирующих препаратов и контрастных агентов для томографии и визуализации [5].
Преимущество ГАп как основы для остеозамещающих конструкций (и это на сегодняшний день можно назвать основным применением материала) по сравнению с другими материалами заключается в его биосовместимости и высокой аффинности к клеткам костной ткани [3]. Эти свойства в значительной мере зависят от физикохимических характеристик и структуры материала, хотя до конца не ясны многие механизмы, лежащие в основе этой взаимосвязи.
Можно выделить следующие два подхода к применению ГАп в биоинженерии костной ткани. (1) Применение цельных биомимикирующих конструкций на основе ГАп для полного замещения поврежденных участков костной ткани. Наиболее подходящими считаются наноструктурированные материалы в форме пористой керамики или гибридных композитов с полимерной составляющей. (2) Напыление ГАп на поверхность остеозамещающих конструкций. ГАп при этом выступает в качестве «предшественника» минерализации, инициирующего процесс ремоделирования костной ткани клетками остеокластами и остеобластами. Для этой задачи подходит карбонизированный ГАп. Кроме того, представляется перспективным применение иных форм фосфата кальция (например, октакальциевого фосфата).
Одним из важных качеств, которыми должны обладать остеозамещающие материалы, является их остеокондуктивность – способность обеспечивать оптимальные пространственные условия роста «новой» костной ткани, что предполагает обладание материалом определенной микроструктуры (например, размеры и распределение пор) [11-15]. Другим ключевым свойством является остеоиндуктивность – способность инициировать, хемотаксис и остеобластную дифференцировку клеток костной ткани. Среди химических свойств, влияющих на остеоиндуктивность, особый интерес представляет способность материала высвобождать ионы кальция и фосфата во внешнее (внеклеточное) пространство, поскольку имеется ряд экспериментальных свидетельств о роли этих ионов в биохимической активации остеокластов и остеобластов [16-17]. В зависимости от предрасположенности к этому процессу фосфаты кальция подразделяются на растворимые и нерастворимые (резорбируемые и нерезорбируемые)[1]. Чистый стехиометрический ГАп относится к нерастворимым фосфатам кальция (по крайней мере, при кислотности среды, близкой к физиологической), однако известно, что он становится менее стабильным при наличии в его составе некоторых примесей, например карбонат-анионов [18]. Кроме того, предрасположенность к резорбции зависит от размера кристаллов ГАп и оказывается выше для нанокристаллической формы [19].
Таким образом, микроструктура материалов на основе ГАп рассматривается как основной фактор, обусловливающий их остеокондуктивность, в то время как их химические свойства, в том числе примесный состав, оказывают влияние на остеоиндуктивность. В целом схожие требования к физико-химическим характеристикам ГАп лежат в основе потенциальной применимости материала для доставки в живые ткани функциональных молекул с их регулируемым высвобождением. Наноразмерные платформы на базе ГАп обладают рядом свойств, обусловливающих перспективность их использования для этой цели [20]: (i) возможность контроля резорбируемости ГАп позволяет синтезировать частицы, растворимые только при низких значениях pH — то есть в лизосомах после попадания в клетку; (ii) размер (и форму) частиц ГАп легко контролировать в процессе синтеза, тем самым оптимизируя их способность к прохождению через клеточную мембрану. Важно отметить, что аффинность ГАп к терапевтическим или флуоресцирующим молекулам (то есть предрасположенность к их связыванию и высвобождению) потенциально также может регулироваться посредством изменения примесного состава частиц.
В ряде работ показано, что синтетические наночастицы на основе ГАп могут приобретать флуоресцентные свойства благодаря введению в структуру ионов лантанидов [21-22] и служить для переноса различных лекарств, включая инсулин [23] и церамиды [24].
Для того, чтобы обеспечить требуемую биологическую активность ГАп, к настоящему времени проведен значительный объем исследований его различных модификаций, в том числе посредством функционалицации поверхности [25] и изменения химического состава с помощью введения примесей [26].
Применение метода функционала плотности в псевдопотенциальном приближении для исследования дефектов и примесей в твердых телах
В разбавленном пределе концентрация дефекта определяется энергией формирования Ef в соответствии с распределением Больцмана [84]: где Nsites - число кристаллографических позиций (включая эквивалентные с точки зрения симметрии локальные конфигурации), в которых дефект может локализоваться, kB – постоянная Больцмана, T – температура. Важно подчеркнуть, что это выражение предполагает случай термодинамического равновесия. Это является разумным допущением, поскольку в наиболее часто используемых методах роста кристаллов условия, в самом деле, оказываются близки к равновесным.
Энергии формирования дефектов в свою очередь могут быть заданы в виде разности между полными энергиями, которые рассчитываются из первых принципов методом DFT без обращения к экспериментальным параметрам. В этом случае в явном виде учитывается зависимость от атомных химических потенциалов (а также от положения уровня Ферми в случае заряженных дефектов) [84,97].
Без ограничения общности, в качестве примера расчета энергии формирования можно рассмотреть случай вакансии кислорода в зарядовом состоянии 2+ в составе оксида металла MeO. Эта величина задается следующим выражением: где Etot(VO2+) – полная энергия расчетной ячейки, содержащей вакансию, Etot(MeO) – полная энергия чистого кристалла MeO в расчетной ячейке того же размера, EF — энергия резервуара, с которым происходит обмен электронами, т. е. энергия уровня Ферми; условно предполагается, что атом O, удаленный из кристалла, переносится в резервуар, энергия которого задается химическим потенциалом атома кислорода O.
Величина O — вообще говоря, переменная, определяющая экспериментальные условия роста или отжига MeO. Ее верхнее значение задается энергией атома O в молекуле O2, что характеризует экспериментальные условия, богатые кислородом. Аналогично, верхняя граница для химического потенциала Me дается энергией атома Me в кристаллической фазе металла. Сумма величин O и Me соответствует свободной энергии системы MeO, что определяет условие стабильности кристалла. Поэтому максимальное значение O задает нижнюю границу для Me, и наоборот. Таким образом, значения химических потенциалов при расчете энергий формирования могут варьироваться в диапазоне, зависящем от значения энтальпии образования изучаемого материала, которое также достаточно точно рассчитывается из первых принципов.
Стоит добавить, что в некоторых (хотя и редких) случаях может обнаруживаться влияние вибрационной энтропии на стабильность различных конфигураций дефекта или примеси, как это показано в работе [98]. В свою очередь величины, используемые в (2.8) для расчета энергий формирования — это энергии расчетных ячеек, соответствующие условиям нулевой температуры и нулевого давления. Тем не менее, обычно энтропийные вклады в концентрацию дефекта чрезвычайно малы и близки по величине к значению kB, и, следовательно, ими можно пренебречь.
В предыдущем разделе рассматривались вопросы, связанные с расчетом энергий формирования изолированных дефектов. Однако, возможны ситуации, когда дефекты и примеси в структуре кристалла агломерируют и образуют комплексы [84]. Простейшим случаем является формирование комплекса AB из двух дефектов (примесей) – A и B — в соответствии с уравнением реакции A + B AB; (Eb), где Eb – энергетический выход реакции. Эту величину, которую часто называют энергией связывания Eb двух дефектов, можно выразить через соответствующие энергии формирования: Eb = Ef(A) + Ef(B) – Ef(AB), (2.9) где знак задан таким образом, чтобы отрицательное значение энергии связывания соответствовало случаю стабильного комплекса.
Тем не менее, важно понимать, что отрицательное значение Eb само по себе не означает, что комплекс непременно сформируется в процессе синтеза или отжига. Для того, чтобы концентрация комплекса превышала концентрацию изолированных дефектов каждого типа, его образование должно быть энергетически более выгодным по сравнению с формированием отдельных («изолированных») дефектов. Иными словами, энергия формирования комплекса Ef(AB) должна быть ниже энергий формирования Ef(A) и Ef(B). Очевидно, это означает, что значение Eb должно быть достаточно велико по сравнению с Ef(A) и Ef(B) — только в этом случае будет наблюдаться высокая концентрация комплекса. Тем не менее, комплексы могут формироваться не только в равновесных условиях в процессе роста кристалла. Может реализовываться следующий сценарий. Если описанные выше условия не удовлетворяются, и в сформированной структуре значительно доминируют изолированные дефекты, концентрация которых в дальнейшем остается фиксированной, но, по крайней мере, один из типов дефекта (A или B) достаточно мобилен и способен диффундировать в пределах кристаллической решетки, комплекс может образовываться уже после синтеза при изменении внешних условий. Подобный эффект, к примеру, наблюдается при формировании комплекса Mg-H в составе GaN. В этом случае энергия образования комплекса оказывается значительно ниже, чем энергия введения Mg, концентрация которого полностью определяется в процессе синтеза. Комплекс, однако, формируется при последующем охлаждении кристалла благодаря диффузии примеси H [84].
Расчет параметров спектров ЭПР из первых принципов Принципы расчетов свойств дефектов и примесей в твердом теле в рамках псевдопотенциального приближения метода DFT, описанные выше, могут применяться для «предсказания» экспериментальных результатов, а также в некоторых случаях могут облегчить интерпретацию наблюдаемых в эксперименте эффектов. Тем не менее, наиболее эффективное комбинирование экспериментальных и численных методов достигается в тех случаях, когда можно произвести непосредственное сравнение рассчитанных и измеренных величин. Для установления природы и пространственной структуры дефектов такое сравнение бывает чрезвычайно полезным. Важным частным случаем такого подхода является расчет спектроскопических параметров парамагнитных дефектов при их исследовании методами ЭПР.
Как было показано выше, псевдопотенциальное приближение оказывается чрезвычайно эффективным для расчета полной энергии системы, пространственной и электронной структуры, а также прочих свойств, обусловленных поведением электронных волновых функций в области, удаленной от ядра. Однако, его использование для расчета констант сверхтонкого взаимодействия и g-факторов напрямую оказывается невозможным.
В первую очередь это связано с тем, что применение псевдопотенциалов фактически приводит к полной потери информации об истинном виде волновых функций вблизи ядра, в то время как эта область в существенной мере определяет значения параметров спектров ЭПР. В частности, изотропная составляющая сверхтонкого взаимодействия в явном виде зависит от величины локализации спиновой плотности на соответствующем ядре.
Кроме того, расчет g-фактора включает вклады, обусловленные внешним магнитным полем, что приводит к нарушению трансляционной инвариантности решения системы уравнений Кона-Шэма для псевдопотенциального гамильтониана.
Численные расчеты методом функционала плотности
В настоящем разделе работы демонстрируется эффективность применения метода ЭПР для исследования углеродсодержащих радиационных радикалов в образцах кальцифицированной стенки сосуда и серии образцов синтетического наноразмерного ГАп с различной степенью карбонизации.
Первоначальный интерес к исследованию примесных центров карбоната (CO32-) в структуре наноразмерного ГАп был мотивирован поиском надежных прогностических маркеров развития атеросклеротических повреждений стенки сосуда. Согласно последним исследованиям, большинство клинических проявлений атеросклероза обусловлено разрывом атеросклеротической бляшки. Предположительно, существует тесная связь между нестабильностью бляшки (предрасположенности к разрыву) и процессом кальцификации стенки сосуда [120]. В работе [9] было высказано предположение, что спектральные и релаксационные характеристики углерод-центрированных радиационных радикалов в структуре нанормазмерного карбонизированного ГАп, содержащегося в поврежденной стенке сосуда, потенциально могут использоваться в качестве маркера для ранней диагностики риска разрыва атеросклеротической бляшки.
Несмотря на значительный интерес к исследованию примесных центров карбоната, связь между содержанием карбоната в структуре ГАп и его локализацией до сих пор остается предметом дискуссий (см. недавние работы [8,121,122]). Как было указано ранее, допускается, что основные возможные участки инкорпорирования ионов CO32- – это позиции групп OH- и PO43-(дефекты A- и B-типа, соответственно). Считается, что предрасположенность карбоната к преимущественной локализации в одной из этих позиций зависит от условий роста кристалла ГАп.
Вследствие сравнительно сложной структуры ГАп и большого размера элементарной ячейки (44 атома в случае гексагональной симметрии и 88 атомов для моноклинной конфигурации), лишь недавно в литературе стали появляться работы, посвященные исследованию карбонизированного ГАп полуэмпирическими и неэмпирическими расчетными методами [121,122]. Несмотря на кажущуюся перспективность использования численного моделирования, до сих пор сохраняются некоторые несоответствия между результатами расчетов и экспериментов (см. [121]). Проведение дальнейших экспериментальных исследований направленных на проверку и подтверждение теоретических моделей, особенно актуальны в случае наноразмерных материалов, свойства которых в большей степени зависят от условий синтеза и, с другой стороны, по-видимому, более схожи с характеристиками биогенного ГАп.
В настоящей главе для анализа возможных мест локализации карбоната было проведено исследование влияния степени карбонизации на характеристики спектра ЭПР радикала NO32-, введенного в структуру в процессе синтеза в качестве парамагнитного зонда, в сочетании с численными DFT-расчетами.
Измерения методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDS) подтвердили, что отношение Ca/P для образца с x = 0 равно 1.67(1)и свойственно для чистого ГАп. Характерные изменения спектров ИК со значением степени карбонизации x показаны на Рисунке 5.1. Видно, что моды, соответствующие примесному карбонату, наблюдаются даже в образцах с x = 0, что, по всей видимости, связано с самопроизвольным внедрением примеси в структуру кристалла. В то же время линии, соответствующие нитрату NO3- вблизи 825 и 1385 см-1[115,123] в спектрах ИК обнаружены не были. Последний факт до сих пор не нашел своего объяснения.
Результаты волюметрических измерений позволили определить истинную концентрацию карбоната в структуре ГАп, как показано на Рисунке 5.2. Вместе с результатами рентгенодифракционного анализа и ИК-спектроскопии эти данные указывают на локализацию карбоната в объеме нанокристаллов ГАп [104,105]. 14 12 10 8 6 4 2
Что касается биогенного нано-ГАп, можно ожидать, что в его структуре содержаться различные типы ионных примесей, поэтому облучение должно приводить к образованию целого ряда радиационных дефектов, которые вносят вклад в наблюдаемый спектр ЭПР и, таким образом, затрудняют его интерпретацию. В этой связи значительным преимуществом использования импульсного режима измерений спектров ЭПР является возможность выбора условий эксперимента (таких как параметры импульсной последовательности, температура и т.д.), оптимальных для детектирования определенного парамагнитного центра. Это позволяет разделить сигналы радикалов с различными временами релаксации.
Описанная методика оказывается эффективной при исследовании ГАп природного происхождения. Таким способом в образце кальцифицированной стенки сосуда после облучения рентгеновским излучением удалось выделить спектр ЭПР радикала CO2-, хотя и перекрывающийся с сигналом на g-факторе свободного электрона, вероятно, обусловленным радикалами в органической части образца. Полученный спектр также приведен на Рисунке 5.3.
Благодаря сравнению параметров спектров ЭПР указанного парамагнитного центра в образцах стенки сосуда со спектроскопическими характеристиками радикала CO2- в составе синтетического карбонизированного ГАп можно сделать вывод о локализации карбоната в структуре биогенного ГАп, содержащегося в ткани. Было, кроме того, выявлено, что сигнал центра CO2, аналогичный спектру, обнаруженному в синтетическом карбонизированном ГАп, наблюдается лишь в образцах стенки сосуда с высокой степенью кальцификации. Это является очередным свидетельством перспективности использования ЭПР-детектируемых радикалов CO2- в качестве маркеров процесса кальцификации стенки сосуда и развития атеросклеротических повреждений. Кроме того, из этого можно сделать вывод о том, что модели ГАп, используемые при проведении численных DFT-расчетов и сравнении их результатов с экспериментом, справедливы не только для синтетических кристаллов, но и для биогенного ГАп.
Взаимодействие с азотсодержащей примесью
В ходе работы в образцах атеросклеротических бляшек зарегистрированы спектры ЭПР ионов Mn2+. Показано, что спектроскопические характеристики ионов Mn2+ в кальцифицированных образцах почти идентичны параметрам парамагнитных центров марганца в синтетических нанокристаллах ГАп. Этот факт указывает на вероятную локализацию указанных парамагнитных центров в структуре кристаллов ГАп, входящих в состав атеросклеротической бляшки, а не в активном центре марганец-содержащих ферментов, как это предполагалось ранее[9]. Численные расчеты в рамках метода теории функционала плотности позволили получить информацию о возможном участке локализации примесного иона Mn2+ в структуре ГАп.
Использование подхода, комбинирующего DFT-расчеты и экспериментальное измерение релаксационных характеристик радиационного радикала NO32-, введенного в структуру ГАп в качестве парамагнитного зонда, позволило выявить тенденцию к содопированию нанокристаллов ГАп ионами Mn2+ и азотной примесью NO3-. Это является первым экспериментальным наблюдением взаимодействия противоположно заряженных примесных ионов в структуре ГАп, подтвержденное численными квантово-химическими расчетами. Вследствие унитарного характера наблюдаемого эффекта, выдвинуто предположение, что энергетическое преимущество содопирования может ожидаться и в случае введения других типов анионных примесей вместо нитрата, иэто в свою очередь должно напрямую влиять на функциональные свойства материала. Потенциальные возможности современных методов спектроскопии ЭПР могут быть эффективно использованы в подобных исследованиях.
1. Измерение спектров ЭПР и ДЭЯР образцов наноразмерного ГАп, полученных методом осаждения из водного раствора и облученного рентгеновским излучением, в X- и W-диапазоне позволило идентифицировать образующийся в них азотсодержащий радиационный центр как радикал NO32-. С помощью расчета спектроскопических параметров (g-тензора и тензоров сверхтонкой структуры 14N, 1H, 31P) в рамках теории функционала плотности и последующим сравнении симулированных спектров ЭПР и ДЭЯР с экспериментальными данными удалось установить, что радиационный радикал NO32- в структуре ГАп замещает группу ортофосфата (PO43-). Кроме того, анализ рассчитанных из первых принципов энергий формирования дефекта указывает на то, что примесный ион NO3-, прекурсор радиационного радикала NO32-, также имеет тенденцию к локализации в указанной позиции. Было выдвинуто предположение, что азотосодержащая примесь внедряется в структуру нанокристаллов ГАп в процессе синтеза.
2. Были измерены спектры ЭПР образцов наноразмерного ГАп, допированного ионами карбоната (CO32-), облученного рентгеновским излучением. По изменению интенсивности спектра ЭПР радиационного радикала NO32-в структуре ГАп при увеличении степени карбонизации получена информация о замещении нитратной примеси ионами карбоната. Показано, что разница рассчитанных из первых принципов энергий формирования нитратного и карбонатного дефекта в структуре ГАп согласуется с наблюдаемым в эксперименте эффектом. Предложено применение допирования ГАп ионами карбоната для удаления неконтролируемых анионных примесей из структуры наноразмерного ГАп.
3. Зарегистрированы спектры ЭПР образцов наноразмерного ГАп, допированного марганцем, до и после облучения рентгеновским излучением. Использование подхода, комбинирующего экспериментальное измерение релаксационных характеристик радиационного радикала NO32-, введенного в структуру ГАп, и DFT-расчеты, позволило выявить тенденцию ионов Mn2+ и противоположно заряженных азотных примесей локализоваться в пространственной близости в пределах нанокристаллов ГАп. Это является первым экспериментальным наблюдением взаимодействия противоположно заряженных примесных ионов в структуре ГАп, подтвержденное численными расчетами из первых принципов.
4. На основании анализа экспериментальных результатов [A1, A5-A7] для углеродосодержащих радиационных радикалов (CO2-) а также для ионов Mn2+ сделано предположение об эквивалентности локального окружения этих центров в образцах кальцифицированной стенки сосуда и в структуре синтетического карбонизированного ГАп.
5. Полученная в работе информация об участках локализации и механизмах распределения карбоната и марганца в структуре ГАп может оказаться полезной при дальнейших исследованиях соответствующих парамагнитных центров в наноразмерном ГАп, образующемся в стенке сосуда при кальцификации. Отмеченная в работе корреляция между степенью кальцификации и интенсивностью (возможностью наблюдения) соответствующих сигналов ЭПР позволяет рассматривать указанные центры в качестве перспективных маркеров при диагностике атеросклеротических повреждений.
