Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1 Углеродные наноструктуры 8
1.1.1 Углеродные нанотрубки 9
1.1.2 Графен и графит 13
1.2 Биологические макромолекулы 17
1.2.1 Нуклеиновые кислоты 17
1.2.2 Белки 19
1.2.3 Вирусы 21
1.2.4 Биополимеры бактериальных клеток 22
1.3 Действие углеродных нанотрубок на биологические объекты 25
1.4 Методы исследования наноструктур 27
1.4.1 Атомно-силовая микроскопия 27
1.4.2 Комбинационное рассеяние света 34
2. Экспериментальные методики и материалы 47
2.1 АСМ - оборудование и обработка данных 47
2.2 Оборудование для регистрации спектров КРС 48
2.3 Углеродные нанотрубки и графитные наноматериалы 51
2.4 Биологические объекты 52
3. Исследование общих закономерностей и особенностей физических свойств наноструктурированных углеродных материалов
3.1 Спектроскопия комбинационного рассеяния в одностенных углеродных нанотрубках
3.2 Спектроскопия комбинационного рассеяния в массивных образцах графита и тонких графитовых пленках
3.3 Разработка метода получения графена на различных подложках 67
3.4 Определение числа атомных слоев в графеновых кластерах с использованием статистического анализа АСМ изображений
3.5 Резонансное КРС в графеновых кластерах с различным числом слоев. Механизм двойного резонанса. Определение числа слоев в кластерах графена из совместного анализа данных АСМ и КРС
4. Изучение биологических микро- и нанообъектов методом АСМ 82
4.1 Исследование стабильности флуоресцентных белков 82
4.2 АСМ исследование бактериального флуоресцентного сенсора 85
4.3 Изучение нитевидных РНК-содержащих растительных вирусов с помощью АСМ
4.4 Анализ стабильности вирусных частиц при образовании комплексов вирус-белок
5. Влияние одностенных углеродных нанотрубок на биологические объекты
5.1 Изучение комплексов одиночных углеродных нанотрубок и молекул ДНК методами АСМ и КРС
5.2 Анализ влияния углеродных нанотрубок на частицы нитевидных РНК-содержащих растительных вирусов
5.3 Изучение процесса взаимодействия углеродных нанотрубок с живыми бактериальными клетками.
Основные результаты 106
Библиография 111
- Углеродные нанотрубки
- Оборудование для регистрации спектров КРС
- Спектроскопия комбинационного рассеяния в массивных образцах графита и тонких графитовых пленках
- АСМ исследование бактериального флуоресцентного сенсора
Введение к работе
Повышенное внимание к взаимодействию наночастиц с биологическими объектами в последние годы вызвано, прежде всего, началом широкого применения нанообъектов в продуктах массового бытового и промышленного потребления. Интерес к наноматериалам обусловлен, прежде всего, возможностью модифицировать их физические и химические свойства за счет изменения характерного размера, не изменяя при этом состав вещества. В последние десятилетия большой интерес привлекли углеродные наноматериалы, такие как фуллерены, углеродные нанотрубки и другие графитоподобные структуры. В основе физической теории таких материалов лежат свойства графена — двумерного монослоя атомов углерода, образующих гексагональную сетку. Практический способ получения этого материала был предложен лишь недавно, поэтому экспериментальное исследование его свойств, необходимое для детального понимания физических характеристик всего класса графитоподобных наноматериалов, лишь начинается.
Несмотря на то, что наноматериалы в значительной степени все еще остаются предметом перспективных научных разработок, уже первые исследования показали, что взаимодействие со столь малыми структурами может по-разному влиять на биологические объекты, зачастую изменяя и нарушая их нормальное функционирование или приводя к драматическим изменениям в структуре. Результаты начатых в последнее время во многих лабораториях работ по изучению влияния наноматериалов на различные биологические объекты и организмы, в том числе и человека, во многом противоречат друг другу.
Таким образом, исследование наноматериалов и их взаимодействия с биологическими объектами представляет собой актуальную в настоящее время задачу. Данная диссертационная работа посвящена разработке
методов атомно-силовой микроскопии для визуализации углеродных наноструктур, биомакромолекул и их комплексов и применению этих методов для изучения взаимодействия одностенных углеродных нанотрубок с биологическими объектами и, в первую очередь, с их биополимерами. В работе было проанализировано действие углеродных наноматериалов на биологические макромолекулы, частицы растительных вирусов и живые бактериальные клетки. Для получения достоверных данных о свойствах комплексов была выполнена детальная характеризация исходных компонентов, обладающих наноразмерными параметрами
Были исследованы физические свойства кластеров графена — двумерной гексагональной сетки атомов углерода, являющейся основой для всех графитоподобных структур. Для изучения структуры и электронных свойств данного материала в основном использовались методы атомно-силовой микроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния света. Интерпретация экспериментальных результатов была проведена на основе известных теоретических подходов и новых моделей, разработанных в результате сотрудничества с другими лабораториями в рамках работы по теме диссертации.
Для характеризации биологических макромолекул и частиц до и после взаимодействия с углеродными структурами в большинстве случаев был использован метод атомно-силовой микроскопии. Оказывая минимальное внешнее, воздействие этот метод позволяет исследовать структуру, размеры и форму объектов, которые в данном случае зависят от внешних воздействий. Кроме этого, были использованы такие методы, как флуоресцентная спектроскопия, оценка способности бактерий к делению и дыханию. Для оценки полученных результатов использовали известные характеристики для биологических объектов.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было определение характера взаимодействия углеродных нанотрубок с различными биологическими объектами.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1) Исследовать физические свойства углеродных нанотрубок, в том числе:
разработать методику контроля и идентификации получаемых образцов углеродных наноструктур с помощью атомно-силовой микоскопии;
провести анализ электронных свойств углеродных наноструктур с помощью спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния света;
сравнить свойства углеродных нанотрубок, имеющих
цилиндрическую поверхность, со свойствами плоских графеновых
чешуек и тонких графитных пленок.
2) Охарактеризовать топологию и физические свойства биомакромолекул и
биологических частиц, в том числе:
разработать методику исследования биообъектов с помощью атомно-силовой микоскопии;
исследовать характеристики, поведение и стабильность биообъектов при нанесении на поверхность слюды, при взаимодействии с зондом атомно-силового микроскопа, а также при некоторых других внешних воздействиях.
3) Изучить влияние углеродных нанотрубок на биологические объекты:
разработать методики создания образцов, обеспечивающие
возникновение взаимодействия выбранных биологических объектов
с углеродными нанотрубками;
разработать процедуру контроля наличия такого взаимодействия и
образования комплексов;
исследовать характеристики биологических объектов в процессе их взаимодействия с углеродными наноструктурами с помощью атомно-силовой микроскопии и спектроскопических методов;
проанализировать возможные изменения в структуре и свойствах исследуемых объектов и сделать заключение о характере взаимодействия между ними.
Углеродные нанотрубки
При исследовании сажи, получающейся как побочный продукт при синтезе фуллеренов, в 1991 году японский ученый Сумио Иджима обнаружил много стенные углеродные нанотрубки [4]. Однако, и до этого времени в некоторых работах сообщалось о наблюдении волокнистых углеродных структур [7-9]. Открытие Иджимы инициировало целый ряд теоретических исследований, предсказавших возможность синтеза не только многостенных, но и одностенных углеродных нанотрубок (ОУН). Экспериментально ОУН были обнаружены тем же Иджимой в 1993 году [6]. Целенаправленный синтез одностенных нанотрубок был впервые произведен в 1996 году в группе Смолли методом каталитического лазерного испарения графита, где в качестве катализатора была использована смесь Co-Ni [10]. К настоящему моменту развито более 10 различных методов синтеза ОУН: электродуговой синтез [11], лазерное испарение композитных графитовых мишеней с внедренными катализаторами [8, 12, 13], каталитический пиролиз углеродсодержащих газов [14-16] и др.
Схематическое изображение одностенных углеродных нанотрубок различного типа: а- нанотрубка типа "кресло", б- нанотрубка типа "зигзаг". кристаллами, имеющими цилиндрическую структуру, сформированную одной или несколькими полосами искривленных графитовых плоскостей (Рис. 1). Обычно они имеют диаметр порядка 0.6-3.0 нм и длину 1-10 мкм. Таким образом, эти структуры можно рассматривать как бесконечно длинные вдоль оси цилиндры, в каждом поперечном сечении которых располагается лишь несколько атомов углерода. Такая структура углеродных нанотрубок приводит к существованию дискретного набора перпендикулярных оси трубки волновых векторов и к квази-непрерывным значениям волновых векторов вдоль оси нанотрубки. Несмотря на то, что каждая нанотрубка состоит из огромного числа атомов, физические свойства этих структур определяются их микроскопической структурой.
Нанотрубки обладают многими уникальными химическими и физическими свойствами. Их геометрия определяется двумя целыми числами (п,т). Число п определяется числом гексагонов, укладывающихся в длину окружности нанотрубки. Взаимная ориентация гексагональной сетки графита и продольной оси нанотрубки определяет очень важную структурную характеристику нанотрубки — хиральность.
Геометрия углеродных нанотрубок (УНТ) определяет такие их важнейшие характеристики, как проводимость и плотность электронных состояний. Например, возможно существование двух нанотрубок с минимальным отличием в диаметре, обладающих различным типом проводимости: одна из них будет являться проводником, а другая — полупроводником. При условии п — т = 3q , где q - целое число, нанотрубки будут металлическими, в другом случае полупроводниковыми. Эта особенность, в частности, позволяет, за счет внедрения дефекта, создавать р-п переходы с ничтожно малыми размерами в пределах одной трубки. Это и другие размерно-зависимые свойства позволяют рассматривать углеродные нанотрубки как основу для наноэлектронных устройств.
Электронно-микроскопическое изображение пучка одностенных углеродных нанотрубок. Необходимо отметить, что нанотрубки с различными геометриями могут иметь один тот же диаметр. Существует две специфических геометрии: если п = т, то нанотрубка имеет структуру типа "кресло", а при т = 0 - типа "зиг-заг" (РисЛ а, б). Наименования даны по характерному расположению атомов на торцевом краю трубки. Все остальные нанотрубки называются "хиралъными", поскольку они имеют форму спирали с различными углами закручивания (Рис.1 в).
Стабильной формой существования одностенных углеродных нанотрубок являются пучки, включающие по 15-100 нанотрубок близкого диаметра (Рис.3). Это представляет серьезную проблему для некоторых применений УНТ, поскольку до настоящего момента синтез и выделение нанотрубок определенной хиральности, диаметра и типа проводимости являются сложными задачами. В связи с этим в настоящее время большой интерес представляет развитие методик разбиения пучков на отдельные нанотрубки, а также выделение фракций, обогащенных УНТ с металлическим или полупроводниковым типом проводимости [17-19],
Графен является двумерной структурой, состоящей из гексагонально упакованных атомов углерода. Несмотря на то, что большинство теоретических расчетов для других графитоподобных материалов (0-мерных фуллеренов, 1-мерных нанотрубок и 3-х мерного графита - Рис.4) основаны на предполагаемых свойствах графена, все попытки его синтеза до недавнего времени не давали удовлетворительного результата. Более того, теоретически было доказано, что двумерная монослоиная пленка не может существовать в свободном состоянии и должна спонтанно сворачиваться, образуя какую-либо более устойчивую структуру. Рис.4. Графен и графитоподобные материалы.
Теоретическое исследование графена началось задолго до получения реальных образцов материала в связи с построением теории графита. Как было показано в 1947 г. П. Воллесом, в зонной структуре графена отсутствует запрещенная зона, причём, в точках соприкосновения валентной зоны и зоны проводимости энергия электронов и дырок имеет линейную зависимость от волнового вектора [20]. Такого рода спектром обладают частицы с нулевой массой. Однако, в отличии от других безмассовых частиц, электроны и дырки заряжены и поэтому являются фермионами.
Впервые успешное получение графена удалось реализовать группе А. Гейма и К. Новоселова лишь в 2004 году [21]. Для получения двумерного кристалла была использована удивительно простая методика микромеханического расщепления - многократного отщепления тонких слоев от кристалла графита (Рис. 5). Этой же группой исследователей был предложен метод визуального контроля толщины и положения образцов графена. Данная методика основана на том, что при определенных графит характеристиках подложки (например, при наличии тонкого слоя Si02 ( 300 нм) на поверхности Si), на которой находится образец, содержащий один или несколько атомных слоев графена, даже столь малые его толщины могут изменить условия интерференции в отраженном пучке света. В результате контраст на границах отдельных кластеров меняется, и они становятся заметными в обычный оптический микроскоп. При этом образцы различной толщины отличаются по цвету.
Полученные таким образом моноатомные слои графена могут рассматриваться как идеальный двумерный кристалл. В последнее время в литературе установилась иная терминология, в которой графеном называют не только однослойные структуры, но и кристаллы, состоящие из счетного числа слоев, т.е. двух-, трех-, десяти-... п-слойный кластер графена. Получение образцов графена дало возможность проводить экспериментальные исследования его свойств. Также появилась возможность сравнивать свойства плоского графена с характеристиками его производных, имеющих иную конфигурацию (нанотрубки, фуллерены и т.п.) и других графитовых материалов, включая обычный графит. Значительный интерес в настоящее время привлекает исследование электрон-фононного взаимодействия в графене, которое проявляется, в частности, в спектрах комбинационного рассеяния света [22-24].
Оборудование для регистрации спектров КРС
Для проведения исследований методом спектроскопии комбинационного рассеяния света использовались следующие спектрометры: Jobin Yvon S-3000 с тройным монохроматором, работающий в схеме вычитания дисперсии; Jobin Yvon Т-64000 с возможностью использования одинарного и тройного монохроматоров; Jobin Yvon U-1000 с двойным монохроматором. Все перечисленные спектрометры были снабжены системой оптической фокусировки на основе оптических микроскопов Olympus с пространственным разрешением 1мкм. Схема спектрометра Jobin Yvon S-3000 приведена на Рис. 18. В качестве возбуждающего излучения использовались линии Аг+, Аг+-Кг+ и He-Cd лазеров Spectra Physics. Предмонохроматор
Полученнык пектры регистрировались с помощью CCD-матрицы. Для различных длин волн разрешающия способность спектрометра изменялась в пределах от 1,5 см"1 до 5 см" . Кроме того, для получения спектров в инфракрасной области был использован Фурье-спектрометр Bruker FR-1106, работающий в инфракрасной спектральной области. В этом случае для возбуждения рассеяния использовалось излучение YaG:Nd лазера с длиной волны линия 1064 нм. Схема Фурье-спектрометра представлена на Рис. 19., его основная часть представляет собой интерферометр Майкельсона. Интерферометр содержит два взаимно перпендикулярных зеркала -неподвижное 1 и подвижное 2 и полупрозрачную светоделительную пластину 3, расположенную в месте пересечения падающих пучков излучения и пучков, отраженных от обоих зеркал. Пучок излучения от источника 4, попадая на пластину 3, разделяется на два пучка. Один из них направляется на неподвижное зеркало 1, второй - на подвижное зеркало 2; затем оба пучка, отразившись от зеркал, выходят через светоделитель из интерферометра в одном и том же направлении. Далее излучение фокусируется на образце 5 и поступает на детектор излучения 6. Два пучка Рис. 19. Оптическая схема фурье-спектрометра: 1 - неподвижное зеркало интерферометра; 2 - подвижное зеркало; 3 - светоделительная пластина; 4 источник излучения; 5 - исследуемый образец; 6 - детектор излучения отличаются друг от друга оптической разностью хода, величина которой меняется в зависимости от положения подвижного зеркала. В результате интерференции пучков интенсивность результирующего потока 1(х) периодически меняется (модулируется). Частота модуляции зависит от частоты падающего излучения v и смещения подвижного зеркала х. В результирующей интерферограмме выделяется, так Называемая, точка нулевой разности хода, или точка белого света. В этой точке для всех частот наблюдается максимум; от нее ведут отсчет смещения подвижного зеркала. Для градуировки перемещений последнего часто используют интерферограмму монохроматичного излучения от лазера (обычно на основе Не - Ne), введенного в фурье-спектрометр.
Во всех случаях при исследовании методом комбинационного рассеяния света интенсивность возбуждающего излучения подбиралась таким образом, чтобы не происходило нагрева или разрушения образца. Для этого в ходе предварительны экспериментов производилось варьирование интенсивности в широком диапазоне и отслеживались изменения в спектрах КРС и другие характеристики образцов. 2.3 Углеродные нанотрубки и графитные материалы
Одностенные углеродные нанотрубки были синтезированы методом дугового разряда в лаборатории спектроскопии наноматериалов ЦЕНИ ИОФ РАН имени A.M. Прохорова. Полученные таким методом ОУНТ имеют характерный диаметр от 0,7 до 2 нм и длину до нескольких мкм. Исходный нанотрубочный материал содержит лишь около 20% ОУНТ, включая в себя также частицы металлических катализаторов и различные формы углерода (аморфный углерод, кластеры графена и т.д.) [120]. Применение специальных химических методов [121] позволяет получать очищенные нанотрубки. В данной работе для анализа взаимодействия углеродных нанотрубок с биологическими объектами был использован как исходный, так и очищенный нанотрубочный материал.
В качестве образцов для проведения сравнительных исследований использовались графитные материалы в виде высокоориентированного пиролитического графита, а также графитные пленки нанометровой толщины, синтезированные в лаборатории перспективных углеродных материалов кафедры физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ. Для получения тонких углеродных пленок, содержащих менее 100 графеновых слоев, использовалось осаждение из газовой смеси метана и водорода, активированной разрядом постоянного тока. Выбирались условия осаждения, соответствовавшие получению графитоподобного (а не алмазо-подобного) материала. Концентрация метана составляла около 8%, температура подложки - около 1000С, давление газовой смеси — около 10 кПа, плотность тока разряда — около 0.5 А/см . Подробное описание использовавшейся методики и влияния параметров осаждения на состав и характеристики получаемого материала представлено в работах [122, 123].
В зависимости от условий синтеза были осаждены графитовые пленки двух типов, различающихся пространственной ориентацией графеновых слоев. В случае пленок, получаемых осаждением на кремнии при длительности процесса более 45 мин, атомные слои графита были ориентированы примерно перпендикулярно поверхности подложки и формировали кристаллиты нанометровой толщины. При этом размеры таких кристаллитов в других направлениях могли составлять до нескольких микронов. Для пленок, осаждавшихся на никелевых подложках при длительностях процесса до 15 мин, атомные слои графита были ориентированы вдоль поверхности подложки. Толщина таких пленок по нашей оценке составляла от нескольких А до единиц нанометров [123].
В экспериментах использовали А и X вирусы картофеля (АВК и ХВК), выделенный из листьев инфицированных растений, как описано в [124]. Листья гомогенизировали в 0,2 М буфере А следующего состава: 0,2 М HEPES, рН 8,0; 0.01 М ЭДТА и 0.15% 2-меркаптоэтанол, полученный гомогенат осветляли с помощью повторных циклов центрифугирования при 8000xg и фильтрации. К супернатанту добавляли последовательно Тритон Х-100, ПЭГ с мол.весом 6000 и NaCl. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием, и вирусные частицы экстрагировали в буфере А, содержащем 1% Тритон X экстракт центрифугировали при 10000xg, и полученный супернатант ультрацентрифугировали при 95000xg. -100. Осадок вируса растворяли в 100 мМ HEPES, рН 8,0 и ультрацентрифугировали через слой 30% сахарозы. Полученный осадок вируса растворяли в 100 мМ HEPES, рН 8,0.
Спектроскопия комбинационного рассеяния в массивных образцах графита и тонких графитовых пленках
Для установления общих для всех графитоподобных материалов закономерностей в спектрах КРС были исследованы образцы объемного графита и тонких (малослойных) графитовых пленок. В качестве объектов исследований использовались углеродные пленки, полученные осаждением из газовой смеси метана и водорода, активированной разрядом постоянного тока (см. гл.2). Характерный вид таких пленок представлен на рис. 21 а и б, соответственно.
В аналогичных с пленками условиях проводилось исследование КРС для образца высокоориентированного пиролитического графита типа SPI-3 GRADE (производство компании SPT West Chestr, PA 19381 USA). Это может быть связано как с относительно большим количеством структурных дефектов в кристаллитах, входящих в состав таких пленок, так и с ориентацией атомных слоев в этих кристаллитах перпендикулярно подложке, т.е. вдоль направления лазерного луча [134]. Для наглядности показаны спектры, зарегистрированные при использовании лазеров с энергией квантов 1,17 эВ (длина волны 1064 нм, спектр 1), 2,41 эВ (длина волны 514 нм, спектр 2) и 3,8 эВ (длина волны 325 нм, спектр 3). Результаты исследований, проводившихся с использованием излучения с другой энергией квантов (1,9 эВ - длина волны 647,1 нм, 2,3 эВ - длина волны 532 нм и 2,5 эВ -длина волны 488 нм) указаны в виде точек, соответствующих положениям линий D и 2D.
Экспериментальные точки, отражающие зависимость положения линий D и 2D от энергии квантов возбуждающего излучения, представлены на Рис. 23 и Рис. 24. Как следует из приведенных на этих рисунках данных, КРС частота этих линий увеличивается с увеличением энергии квантов возбуждающего излучения, как и в случае одностенных углеродных нанотрубок (Рис. 20). Такое поведение соответствует действию механизма двойного резонанса и ходу дисперсионных зависимостей для электронов и фононов в графите и графитоподобных материалах. При этом в области малых значений энергии квантов эта зависимость имеет форму, близкую к линейной. Наиболее существенным различием спектров КРС, представленных на рис. 32 и 33, является практически полное отсутствие линии D для пленок, полученных на никеле при осаждении с длительностью процесса 5 мин. Поскольку наличие этой линии в спектре обусловлено КРС с участием дефектов, то на основании полученных данных можно утверждать, что такие пленки имеют существенно более высокий уровень структурного упорядочения по сравнению с пленками, полученными при более длительном осаждении (60 мин). По данным СТМ исследований пленки, полученные при осаждении длительностью 5 мин, имеют атомарно гладкую поверхность в пределах протяженных областей размером порядка 1 микрометра (см. Рис. 22). Это позволяет сделать заключение, что такие пленки представляют собой графитовый материал, состоящий из атомных слоев, располагающихся вдоль поверхности подложки и имеющий степень структурного упорядочения сравнимую с квази-монокристаллическим графитом.
Таким образом, проведенное систематическое исследование КРС в нано-структурированных графитовых пленках и ВОПГ, полученных плазмохимическим осаждением показало, что как и в случае одностенных углеродных нанотрубок, экспериментально наблюдаемые закономерности поведения КРС в этих материалах соответствуют модели двойного резонанса и демонстрируют линейное увеличение частоты доминирующего фонона в двухфононном спектре КРС (Рис.23, Рис.24) при увеличении энергии фотонов возбуждающего излучения вплоть до 2.7 эВ. 3.3 Разработка метода получения графена на различных подложках
Для анализа характеристик кластеров графена, содержащих счетное число атомных слоев прежде всего необходимо было разработать соответствующую методику получения образцов. В наших экспериментах был исследован графен, произведенный методом микромеханического расщепления (ММР) [137-139]. Были использованы образцы, полученные из двух различных источников. В качестве эталона был взят образец, произведенный компанией Graphene Industries, содержащий графеновые кластеры на подложке из монокристаллического кремния, покрытого слоем оксида. На поверхности образца содержались кластеры различной толщины, в том числе охарактеризованные производителем как однослойные. Проведенное нами исследование образца методом растровой электронной микроскопии
Слои графена загибаются и образуют складчатые структуры. (РЭМ) показало (Рис. 25), что эти кластеры, хотя и имеют достаточно обширные плоские участки (1-20 мкм), все же не являются однородным по толщине [138]. Однако, данный образец по своим геометрическим характеристикам не мог быть использован для дальнейших экспериментов с помощью КРС и АСМ методик. Поэтому нами были изготовлены собственные образцы кластеров графена. Для этого была использована как стандартная, так и модифицированная ММР-методика.
Описанная в работе [14] методика ММР, была модифицирована и адаптирована для применения в существующих условиях, а также для выявления дополнительных возможностей варьирования характеристик получаемых кластеров и методов их диагностики. В ходе работы впервые были получены образцы, представляющие собой отдельные кластеры одно и и-слойного графена, нанесенные не только на подложки Si:Si02, но также на подложки Si:ZnS и Si:Zr02 [139]. В экспериментах использовался кристалл высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ).
Такие кристаллы широко применяются в сканирующей зондовой микроскопии в качестве подложек с атомарно-гладкой поверхностью, которую можно получить, используя для расщепления такие простейшие инструменты как канцелярский скотч, скальпель или лезвие бритвы. Аналогичный механизм лежит и в основе метода MMR На первом этапе необходимо получить чистую свежесколотую поверхность графита. После чего эта поверхность приводится в плотный контакт с подложкой. В результате длительного взаимодействия с подложкой некоторые участки верхних слоев графита отрываются от кристалла и остаются на подложке после окончания взаимодействия кристалла графита с подложкой.
Для наблюдения графеновых кластеров были использованы следующие типы подложек: - монокристаллический кремний с 300-нм слоем напыленного оксида кремния (стандартная подложка); - монокристаллический кремний с 150-нм слоем оксида циркония; - монокристаллический кремний с 270-нм слоем сульфида цинка. Полученные образцы имели следующий вид (Рис.26): на поверхности подложки наблюдались кластеры графена различного цвета, что свидетельствует об их различной толщине [15, 16]. Геометрические параметры приготовленных образцов были подобраны таким образом, чтобы обеспечить возможность проведения их исследования методом атомно-силовой микроскопии для точного измерения толщины полученных кластеров графена.
АСМ исследование бактериального флуоресцентного сенсора
Для проведения дальнейших экспериментов по воздействию углеродных наноструктур на биологические объекты был использован биолюминесцентный бактериальный сенсор. В современной токсикологии активно используют новый класс аналитических систем - биологические сенсоры, чувствительным элементом которых являются клетки бактерий, обладающие способностью к биолюминесценции. Биолюминесцентный метод, основанный на использовании таких сенсоров, применяют для оценки качества воды рек, искусственных и естественных водоемов, атмосферных осадков, грунтовых вод, питьевой воды, стоков промышленных предприятий и очистных сооружений, воды после фильтраций и регенераций и т.п. Люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для быстрых качественных и количественных измерений. Различной природы внешние воздействия на бактериальные светящиеся клетки и, опосредованно, на их метаболизм приводят к изменению интенсивности их биолюминесценции .
В данной работе был использован биосенсор на основе генно-инженерного штамма Escherichia coli К12 TG1, несущего lux-оперон. Для понимания изменений, происходящих в морфологии био люминесцентных бактерий при воздействии какого-либо агента необходимо было охарактеризовать исходные бактерии.
Анализ полученных АСМ изображений показал, что популяция исходной суспензии бактерий была достаточно гетерогенна по размерам и морфологии и содержала около 95% морфологически полноценных клеток. Значительные различия в морфологии бактерий являются следствием того, что клетки находятся на разных стадиях деления и развития. В случае гибели и разрушения бактериальной клеточной стенки происходит значительное уплощение бактериальной клетки: средняя толщина полноценной бактерии составляет 200-330 нм, в то время как толщина разрушенной клетки не превышает 80 нм. 4.3 Изучение нитевидных РНК-содержащих растительных вирусов с помощью АСМ
В работе было исследовано три вида нитевидных растительных вирусов: А и X вирусы картофеля (АВК и ХВК), а так же вирус табачной мозаики (ВТМ). Была проанализирована стабильность данных вирусов при нанесении их на поверхность слюды для получения АСМ изображений, а также в процессе сканирования. Для А и X вирусов картофеля был исследован процесс их взаимодействия с белками CI [144] и 25К [145], соответственно [146].
Частицы А и X вирусов имеют схожую структуру и лишь незначительное отличие в размерах. По результатам АСМ исследования средняя длина частиц АВК составляет 700+50 нм, диаметр 10±2 нм; частицы ХВК немного короче - их длина -500 нм и диаметр 12±2 нм. На поверхности наблюдаются частицы вируса, имеющие гладкую нитеобразную форму. Зачастую частицы вирусов картофеля образуют цепочки, состоящие из двух-четырех частиц.
Частицы вируса табачной мозаики имеют меньшую длину 360±50 нм и несколько больший диаметр 16 нм. Однако, они в большей степени, чем вирусы картофеля склонны к образованию цепочек. Одиночные частицы составляют лишь малую часть из всех наблюдаемых на поверхности. При этом количество вирусов в одной цепочке может достигать 6-8 штук. На Рис.39 представлено распределение по длинам наблюдаемых частиц вирусов обоих типов.
Для сканирования использовался режим прерывистого контакта, чтобы избежать механического повреждения частиц вирусов или их перемещения по поверхности при взаимодействии с зондом АСМ. Рис. 38. АСМ изображение частиц А вируса картофеля (а) и вируса табачной мозаики (б), нанесенных на поверхность слюды.
Зачастую под влиянием внешних факторов, таких как условия выделения и хранения, частицы вирусов картофеля теряют стабильность. В таких случаях при исследовании образцов методом АСМ наблюдающиеся частицы вирусов имели структуру «бусины на нити» (Рис. 40). Средняя шероховатость вдоль такой частицы составляет 1.1 нм. Диаметр этих частиц значительно увеличен по сравнению со стандартными параметрами (примерно в 2.5 раза). Наличие вирусных частиц с такой структурой может свидетельствовать о дезорганизации белков оболочки и нестабильности частиц.
С помощью АСМ было показано, что такие частицы А и X вирусов картофеля могут быть стабилизированы при взаимодействии с белками CI и 25К соответственно [146]. В результате такого взаимодействия отдельные белки оболочки вирусных частиц плотнее прилегают друг к другу, что приводит к формированию гладкой нитевидной структуры, характерной для стабильных вирусных частиц (Рис. 41). В то же время было обнаружено, что добавление этих белков к стабильным частицам не влияло на их структуру.
Для проведения экспериментов по наблюдению с помощью атомно-силового микроскопа частицы вирусов были нанесены из водной среды на поверхность слюды. В результате наблюдений было установлено, что такие условия не влияют на стабильность частиц. Рнс.40. АСМ изображения дестабилизированных частиц А и X вируса картофеля.
