Введение к работе
Актуальность темы
Антифосфолипидный синдром (АФС) – клинико-лабораторный симптомокомплекс, характеризующийся рецидивирующими венозными и артериальными тромбозами, акушерской патологией, тромбоцитопенией и гиперпродукцией антифосфолипидных антител (аФЛ) (Hughes G.R.V., 1983; Насонов Е.Л. и соавт., 1987; Алекберова З.С. и соавт., 1988). аФЛ – гетерогенная группа аутоантител, распознающих антигенные детерминанты анионных и нейтральных фосфолипидов (ФЛ) и комплексные эпитопы, образующиеся в процессе взаимодействия ФЛ и фосфолипидсвязывающих белков плазмы крови (Roubey R.A., 1996). Обязательные методы лабораторной диагностики АФС включают обнаружение волчаночного антикоагулянта (ВА) с помощью фосфолипидзависимых коагуляционных тестов и определение 2-гликопротеин – 1 (2-ГП 1) зависимых антител к кардиолипину (аКЛ) класса IgG и IgM стандартным иммуноферментным методом (Harris E.N., 1990; Galli M. И соавт., 1990; Matsuura E. И соавт., 1990; McNeil H.P. и соавт., 1990; Brandt J.T. и соавт., 1995; Pierangeli S.S. и соавт., 1998; Wilson W. A. и соавт., 1999; Баркаган З.С. и соавт., 2000). Вместе с тем определение ВА и аКЛ не позволяет выявить весь спектр аФЛ, ассоциирующихся с различными клиническими проявлениями АФС. При наличии у пациентов характерных клинических признаков АФС и низкоположительных или отрицательных результатов тестирования ВА и аКЛ рекомендуется использовать дополнительные лабораторные методы для диагностики АФС, в первую очередь, иммуноферментный анализ (ИФА) антител к 2-ГП I (а2-ГП I) классов IgG и IgM (Cabral A.R. и соавт., 1996; . и соавт., 2006). Клиническое значение аКЛ и а2-ГП I класса IgА, а также антител к другим ФЛ и кофакторным белкам (фосфатидилсерину, фосфатидилинозитолу, фосфатидилэтанола-мину, фосфатидилхолину, смеси ФЛ, протромбину – ПТ, комплексу фосфатидилсерин/ПТ, белкам C, S, Z и аннексину V) остается неясным. По мнению большинства исследователей эти субтипы аФЛ не являются лабораторными критериями достоверного АФС, однако могут оказаться полезными для диагностики «вероятного» или «пре – АФС» (Harris E.N., Pierangeli S.S., 2000; Asherson R.A., 2006; . и соавт., 2006). К одной из наиболее сложных проблем лабораторной диагностики АФС относится недостаточно высокая специфичность аКЛ. Показано, что, а2-ГП I обладают большей специфичностью, но меньшей чувствительностью в отношении диагностики АФС по сравнению с аКЛ (., ., 1999). Однако в целом результаты изучения диагностической точности иммуноферментного метода определения аФЛ носят противоречивый характер и зависят от выбранного уровня позитивности, подбора групп больных АФС и методических особенностей анализа аФЛ.
аФЛ являются не только серологическим маркером и критерием диагноза АФС, но и патогенетическим медиатором тромбозов и акушерской патологии при АФС (Pierangeli S.S., Harris E.N., 1996; . и соавт., 2002; Насонов Е.Л., 2004; De Groot P.G., Derksen R.H.W.M., 2005; Giannokopoulos B. и соавт., 2007). Механизмы патогенетического действия аФЛ связаны с подавлением функциональной активности белков каскада свертывания крови (Shibata S. и соавт., 1994; De Groot P.G. и соавт., 1996), угнетением фибринолиза (., ., 1995), повреждением эндотелиальных клеток (Del Papa N. и соавт., 1997), активацией тромбоцитов (. и соавт., 2001; . и соавт., 2003) и моноцитов (. и соавт., 2004).
Важным фактором поражения сосудистой стенки при АФС служит активация/дисфункция эндотелиальных клеток, индуцированная провоспалительными цитокинами (фактором некроза опухоли – ФНО, интерлейкином - 1 – ИЛ-1, интерфероном - ИФН), а также 2-ГП 1 зависимыми аФЛ, антиэндотелиальными клеточными антителами и антителами к ДНК, обладающими способностью перекрестно реагировать с эндотелием (Salogin K.V. и соавт., 1992; Cinez D.B. и соавт., 1998). Это проявляется гиперэкспрессией клеточных молекул адгезии (КМА), синтезом провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6), простагландинов, оксида азота, что ассоциируется с развитием тромботической васкулопатии, характерной для АФС. Основными серологическими маркерами дисфункции эндотелия являются растворимые (р) КМА и антиген фактора Виллебранда (ФВАг). Повышение концентрации рКМА (рVCAM-1, pICAM-1, pP-селектина, рЕ-селектина) и ФВАг в сыворотке крови наблюдается при многих воспалительных, аутоиммунных, инфекционных, опухолевых заболеваниях, атеросклеротическом поражении сосудов, системных васкулитах (Насонов Е.Л., Баранов А.А., Шилкина Н.П., 1999). Данные о связи гиперпродукции рКМА и ФВАг с развитием тромботических осложнений при АФС немногочисленны и противоречивы (Nassonov E. и соавт., 1994; Баранов А.А., 1998; Kaplanski G. и соавт., 2000).
Другой механизм активации эндотелия при АФС и СКВ опосредуется С-реактивным белком (СРБ), который усиливает экспрессию КМА на мембране эндотелиальных клеток (., ., 2003; Jialal I. и соавт., 2004; . и соавт., 2004; . и соавт., 2005). В последние годы СРБ, определяемый в сыворотке высокочувствительными (вч) иммунохимическими методами (вч-СРБ), рассматривается в качестве лабораторного маркера субклинического воспаления сосудистой стенки и возможного патогенетического медиатора тромбоза и атеротромбоза при АФС и СКВ (Насонов Е.Л., 2004). Поэтому изучение связи между сывороточной концентрацией вч-СРБ и клинико-лабораторными проявлениями АФС представляет несомненный интерес.
Внимание исследователей привлекает значение клеточных иммунных реакций в патогенезе АФС (Papo T. и соавт., 1994; Blank M. и соавт., 1995; Visvanathan S., McNeil H.P., 1999; . и соавт., 2002). Показано, что развитие АФС ассоциируется с поляризацией клеточного иммунного ответа по Th1 типу, характеризующегося 2-ГП 1 зависимым синтезом ИФН и ИЛ-2 CD4+ Т-лимфоцитами (Karakantza M. и соавт., 2004). Однако комплексное исследование цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18 и др.), участвующих в регуляции воспаления и антигенспецифического иммунного ответа, при АФС не проводилось. Также в рамках АФС мало изучено клинико - патогенетическое значение интегрального маркера активации клеточного иммунитета – неоптерина и Т-клеточного фактора пролиферации и дифференцировки В-клеток – рCD40 лиганда, играющих важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний и кардиоваскулярных осложнений (Насонов Е.Л., 2004).
Изучение лабораторных биомаркеров АФС представляется актуальным как с теоретических позиций в плане расшифровки иммунологических механизмов развития тромботической васкулопатии, так и с практической точки зрения для определения оптимальных подходов к диагностике, оценке активности, тяжести течения, прогноза и результатов лечения заболевания.
Цель исследования
Изучить особенности иммунологических нарушений при АФС в сопоставлении с клиническими проявлениями заболевания, оценить роль лабораторных иммунологических маркеров в диагностике и оценке прогноза АФС.
Задачи исследования
1. Разработать стандартный метод ИФА для количественного определения IgG/IgM аКЛ в сыворотке крови.
2. Изучить связь между уровнем аФЛ в сыворотке крови и основными клиническими признаками АФС.
3. Оценить диагностическую точность и прогностическое значение ИФА аКЛ, а2 - ГП I и аПТ при АФС.
4. Исследовать сывороточный уровень лабораторных маркеров активации/дисфункции эндотелия - рКМА (рVCAM-1, pICAM-1, pP- селектина, рЕ-селектина) и ФВАг при АФС и оценить их связь с клинико-лабораторными проявлениями ПАФС и СКВ с АФС.
5. Определить сывороточную концентрацию вч-СРБ и его связь с развитием повреждения сосудистой стенки при ПАФС и СКВ с АФС.
6. Изучить клинико-патогенетическое значение серологических маркеров активации клеточного иммунитета при АФС, включая цитокины и их растворимые рецепторы (ФНО и рФНОРI, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18), рCD40лиганд и неоптерин.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное изучение иммунологических факторов повреждения сосудистой стенки при ПАФС и ВАФС, включая исследование аутоантител (аФЛ), показателей активации клеточного иммунитета (цитокины, рCD40-лиганд, неоптерин), маркеров дисфункции эндотелия (рКМА и ФВАг) и белков острой фазы воспаления (вч-СРБ), в зависимости от основных клинических проявлений заболевания.
Показано, что для диагностики и оценки прогноза АФС наиболее точными и эффективными тестами являются методы ИФА IgG аКЛ и IgG а2 – ГП I, причем у IgG аКЛ выше диагностическая чувствительность, а у IgG а2 – ГП I – диагностическая специфичность.
При изучении маркеров активации эндотелия отмечена связь между гиперпродукцией рЕ-селектина у больных ПАФС и развитием венозных тромбозов и акушерской патологии. Выявлено увеличение концентрации ФВАг в сыворотках больных ПАФС и ВАФС, сопровождавшееся наличием венозных тромбозов в анамнезе и поражением клапанов сердца.
Впервые установлено повышение базального уровня вч-СРБ у больных ПАФС, сопоставимое с таковым у больных ВАФС и СКВ. Показано, что при АФС увеличение концентрации вч-СРБ ассоциируется с высоким риском кардиоваскулярных осложнений и наличием артериальных тромбозов.
При анализе показателей активации клеточного иммунитета продемонстрировано увеличение сывороточной концентрации Th1 цитокинов (ФНО, ИЛ-18) и рФНО-РI при ПАФС и ВАФС; Th2 цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-10) при ВАФС. Выявлено, что повышение концентрации ИЛ-10 сопровождается уменьшением числа случаев тромбозов в анамнезе и снижением индекса повреждения, в то время как гиперпродукция ИЛ-18, ассоциируется с атеротромботическими нарушениями. При АФС установлена положительная корреляция значений рCD40 лиганда с увеличением числа случаев тромботических осложнений и наличием венозных тромбозов в анамнезе. Впервые обнаружено повышение уровня неоптерина при ПАФС и ВАФС, наиболее выраженное у больных с поражением клапанов сердца.
Доказана тесная взаимосвязь между образованием антифосфолипидных аутоантител, активацией эндотелиальных клеток, нарушениями Т – клеточной иммунорегуляции и хроническим субклиническим воспалением сосудистой стенки в развитии тромботической васкулопатии при АФС.
Практическая значимость
На основе полученных данных определен комплекс наиболее информативных и адекватных методов ИФА аФЛ для диагностики АФС и прогнозирования риска развития тромботических осложнений и акушерской патологии при данном заболевании. Обнаружение в сыворотках больных аКЛ и/или а2 - ГП I классов IgG и IgM в концентрации, превышающей M+5SD у доноров (IgG аКЛ 25,0 GPL, IgM аКЛ 24,7 MPL, IgG а2 - ГП I 15,3 ЕД/мл и IgM а2 - ГП I 17,0 ЕД/мл), рекомендуется использовать в качестве лабораторных критериев диагностики АФС. Для диагностики тромбозов наиболее полезными лабораторными тестами являются ИФА IgG аКЛ и ИФА IgG а2 – ГП I, акушерской патологии – ИФА IgG аКЛ. Наиболее полезными прогностическими маркерами тромбозов служат положительные результаты ИФА IgG а2 – ГП I, ПНБ – ИФА IgG аКЛ.
Повышенные уровни рЕ-селектина, ФВАг, вч-СРБ и рCD40 лиганда в сыворотках больных АФС являются дополнительными лабораторными маркерами тромботических осложнений данного заболевания.
Измерение сывороточной концентрации рКМА (рVCAM-1, рЕ-селектина, рР-селектина), ФВАг, цитокинов и их растворимых рецепторов (ИЛ-6, ФНО, рФНО-РI, ИЛ-10, ИЛ-18), неоптерина позволяет уточнить активность патологического процесса при ВАФС.
Положения, выносимые на защиту
1. Иммунологическими маркерами для диагностики АФС являются IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM а2 – ГП I, для прогнозирования риска тромботических осложнений и акушерской патологии при АФС – IgG/IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I.
2. Увеличение сывороточной концентрации рКМА и ФВАг отражает активацию/повреждение эндотелиальных клеток при АФС.
3. Повышенные уровни цитокинов, рCD40 лиганда и неоптерина в сыворотках больных АФС свидетельствуют о выраженной активации клеточного иммунитета при данном заболевании.
4. Увеличение продукции вч-СРБ является важным фактором тромбообразования при АФС.
Внедрение в практику
Методы определения аФЛ, рКМА, ФВАг, цитокинов, неоптерина, рCD40 лиганда и вч-СРБ внедрены в работу клинических подразделений ГУ Института ревматологии РАМН, в практику ГУ Научного центра неврологии РАМН, НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ РКНПК Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи, ММА им. И.М. Сеченова и других лечебных учреждений г. Москвы.
Материалы работы использовались в написании главы «Методы определения антител к фосфолипидам» в монографии «Патология сосудов при антифосфолипидном синдроме. Клиника, диагностика, лечение» (Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, Н.П. Шилкина, З.С. Алекберова. – М. – Ярославль, 1995), главы «Лабораторная диагностика системных васулитов» в монографии «Васкулиты и васкулопатии» (Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, Н.П. Шилкина. – Ярославль: Верхняя Волга, 1999), главы «Клиническое значение антифосфолипидных антител» в монографии «Антифосфолипидный синдром» (Е.Л. Насонов. – М., Литтерра, 2004), методического пособия «Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний» (М.: Биохиммак, 2006), главы «Лабораторная диагностика» в национальном руководстве по ревматологии (М.: Гэотар-Медиа, 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 50 печатных работ: 37 статей, 13 тезисов, 11 из которых в иностранной печати.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на Четвертой конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа (Великий Новгород, 2004), научно-практической конференции «Проблема тромбозов в ревматологии» (Москва, 2004), Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2004, 2005, 2006), IV Съезде ревматологов России (Казань, 2005), ежегодном Европейском конгрессе ревматологов EULAR (Вена, 2005; Амстердам, 2006), 10-ой Всероссийской конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), научно-практической конференции «Роль воспаления в развитии ревматических заболеваний» (Москва, 2006), VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007), научно-практическом семинаре «Проблемы диагностики аллергии и аутоиммунных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2007), 10-ом юбилейном научно-образовательном форуме «Кардиология - 2008» (Москва, 2008), IV Всероссийской конференции «Инновационные технологии в ревматологии» (Нижний Новгород, 2008). Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании Ученого Совета ГУ Института ревматологии РАМН 10 апреля 2008 года.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 262 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 31 отечественных и 369 зарубежных источников. Диссертация проиллюстрирована 127 таблицами и 34 рисунками.
