Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Препараты и биологически активные вещества пептидной структуры
1.1.1 Применение веществ пептидной структуры в 10
фармакотерапии тревожных состояний
1.1.2 Кортикотропин-рилизинг фактор 15
1.1.3 Вазопрессин 16
1.1.4 Агонисты ГАМКд рецепторов 17
1.1.5 Агонисты, антагонисты серотониновых 5-НТ-рецепторов 18
1.1.6 Антагонисты глутаматных рецепторов 19
1.1.7 Антагонисты нейрокининовых рецепторов 20
1.1.8 Антагонисты холецистокининовых рецепторов 21
1.1.9 Эндопептиды и их производные
1.2 Рекомбинантный эритропоэтин человека 28
1.3 Феназепам - отечественный анксиолитик бензодиазепинового ряда
1.4 Подходы к разработке наноразмерных систем доставки
1.4.1 Современные достижения в использовании наносомальных лекарственных форм
1.4.2 Фармакокинетика цианоакрилатных наночастиц 35
1.4.3 Методы получение наночастиц
1.4.3.1 Анионная полимеризация 43
1.4.3.2 Диспергирование полимеров 46
1.4.4 Требования к качеству наносомальных лекарственных форм 48
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1 материалы и реактивы 51
2.2 Методики синтеза и анализа тетрапептида
2.2.1 Методика синтеза тетрапептида 55
2.2.2 Методика снятия со смолы полученного пептида 61
2.2.3 Методика очистки татрапептида 62
2.2.4 Анализ структуры и чистоты пептида 63
2.3. Методы получения и анализа наноразмерных форм 65
2.3.1 Методика получения наночастиц 65
2.3.2 Методика определения степени сорбции веществ на 67
поверхности наночастиц
2.3.3 Методы идентификации субстанции феназепама 68
2.3.4 Количественный анализ наносомальной формы феназепама и субстанции феназепама
2.3.5 Определение размера наночастиц 76
2.4 Методы изучения специфической активности
2.4.1 Методика изучения седативного эффекта 77
2.4.2 Методика вращающегося стержня для изучения миорелаксантного действия
2.4.3 Методика изучения анксиолитического эффекта 79
2.4.4 Моделирование гипоксических состояний для изучения 81
антигипоксантной активности наночастиц с эритропоэтином
2.4.5 Методика определения РЭЧ в гомогенатах мозга 82
экспериментальных животных
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1 Синтез и изучение свойств тетрапептида 84
3.1.1 Стратегия конструирования тетрапептида 84
3.1.2 Определение структуры и чистоты синтезированного пептида Phe-P-Ala-Glyrp-NH2
3.1.3 Изучение анксиолитической активности тетрапептида
3.1.4 Выводы по пункту 3.1 91
3.2 Разработка состава и технологии получения полимерных наночастиц с тетрапептидом
3.2.1 Теоретическое и экспериментальное обоснование состава и технологии получения наночастиц на основе алкилцианоакрилатов
3.2.1.1 Выбор мономера для получения наночастиц 94
3.2.1.2 Выбор концентрации мономера 96
3.2.1.3 Выбора агента, обеспечивающего необходимое значение рН среды
3.2.1.4 Выбор скорости перемешивания 97
3.2.1.5 Получение ПБЦА-наночастиц 98
3.2.1.6 Влияние рН дисперсионной среды на размеры наночастиц и степень включения тетрапептида
3.2.1.7 Исследование морфологической структуры наночастиц 103
3.2.1.8 Выбор поверхностно-активного вещества 104
3.2.1.9 Влияние продолжительность инкубации и ПС-80 на степень сорбции тетрапептида
3.2.2 Технологическая схема получения наночастиц с тетрапептидом
3.2.3 Контроль качества и исследование стабильности в процессе хранения наночастиц с тетрапептидом
3.2.4 Изучение специфической активности наночастиц с тетрапептидом
3.2.5 Выводы по пункту 3.2 122
3.3 Разработка состава и технологии получения полимерных наночастиц с феназепамом
3.3.1 Подходы к созданию наночастиц с феназепамом 124
3.3.2 Определение влияния значения рН на размер наночастиц 126
3.3.3 Зависимость степени включения от времени введения субстанции
3.3.4 Влияние соотношения вещество/органический растворитель на степень включения феназепама
3.3.5 Влияние продолжительности перемешивания на степень включения
3.3.6 Зависимость степени включения от интенсивности перемешивания
3.3.7 Определение степени включения и нагрузки на полимер 136
3.3.8 Технологическая схема получения ПБЦА-НЧ с феназепамом 137
3.3.9 Контроль качества и исследование стабильности в процессе хранения наночастиц с включенным феназепамом
3.3.10 Изучение специфической фармакологической активности ПБЦА-НЧ с феназепамом
3.3.11 Выводы по пункту
3.4 Разработка состава и технологии получения полимерных наночастиц с эритропоэтином
3.4.1 Общая характеристика эритропоэтина 15 5
3.4.2 Выбор оптимального значения рН дисперсионной среды 156
3.4.3 Влияние продолжительность инкубации и ПС-80 на степень 158 сорбции эритропоэтина
3.4.4 Изучение противогопоксической активности наночастиц с 161
ЭПО
3.4.5 Выводы по пункту 3.4 166
Общие выводы 167
Список литературы
- Агонисты, антагонисты серотониновых 5-НТ-рецепторов
- Методика снятия со смолы полученного пептида
- Стратегия конструирования тетрапептида
- Контроль качества и исследование стабильности в процессе хранения наночастиц с тетрапептидом
Введение к работе
Актуальность темы
Современный ритм жизни, неблагоприятные экологические условия, сложная социальная обстановка в мегаполисах приводят к увеличению числа нервно-психических расстройств непсихотического типа («пограничных состояний»), и, как следствие, увеличение потребления препаратов нейротропного действия, таких как анксиолитики, препараты снотворного действия, психостимуляторы. При этом эффективность терапии во многом остается недостаточной, что объясняется следующими причинами. С одной стороны, длительный прием таких препаратов, как бензодиазепины, приводит к развитию толерантности, что, в свою очередь, влечет за собой увеличение количества принимаемого препарата и, соответственно, как следствие, усиление токсического действия. С другой стороны, большинство лекарственных веществ, обладают неселективным действием и в незначительной степени проникают через ГЭБ.
Одним из способов решения данной проблемы является использование высокоселективных нейротропных веществ, к числу которых относятся соединения эндогенного происхождения, в частности пептидной структуры или их искусственные аналоги. Эндогенные пептиды обладают высокой селективностью действия к определенным группам рецепторов, подвергаются естественной биологической деградации и не оказывают токсического эффекта на организм. В этой связи разработка пептидных препаратов для терапии пограничных состояний является перспективным направлением фармакологии и фармацевтической технологии.
Однако, использование лекарственных средств на основе пептидов связано со сложностями, в частности с протеолизом пептидазами крови при введении в организм.
Возможный способ решения данной проблемы – создание наноразмерных систем доставки. Наночастицы позволяют осуществить доставку веществ направленно: внутрь клеток, через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и т.п.. При этом обеспечивается защита сорбированного или включенного в наночастицы вещества от воздействия агрессивных факторов внутренней среды организма, таких как хлористоводородная кислота и ферменты, входящие в состав желудочного сока; от разрушения протеазами крови и др., что позволяет увеличивать эффективность препарата.
Перенос через ГЭБ актуален для такого вещества, как рекомбинантный эритропоэтин человека (РЭЧ), способного предотвращать гибель нейронов in vitro и in vivo, однако высокая молекулярная масса и значительная степень гликозилирования молекулы РЭЧ существенно снижают его проникновение в мозг при внутривенном введении.
Использование наноразмерных носителей актуально и при применении традиционных анксиолитиков бензодиазепинового ряда, в частности феназепама, т.к. позволяет снизить присущие им нежелательные эффекты: миорелаксацию и седацию.
Таким образом, в работе предлагается использовать преимущества наноразмерных форм препаратов для повышения эффективности новых и традиционных лекарственных препаратов нейротропного действия, а также снижения выраженности нежелательных эффектов.
Цель исследования
Теоретически и экспериментально обосновать технологические и фармакологические аспекты применения наноразмерных систем доставки препаратов нейротропного действия.
Задачи исследования
-
Разработать подходы к целенаправленному синтезу пептидов с анксиолитическими свойствами.
-
Разработать технологию получения наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.
-
Разработать подходы к стандартизации наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.
-
Изучить основные технологические факторы, влияющие на получение наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.
-
Провести сравнительное фармакологическое изучение полученных наноразмерных форм препаратов нейротропного действия.
Научная новизна результатов исследования
В результате проведенных исследований синтезирован оригинальный тетрапептид (ТП) структуры Phe--Ala-Gly-Trp-NH2 и показана его анксиолитическая активность, получен патент «Тетрапептид, обладающий анксиолитическим действием» (№2429003 от 20.09.2011).
Впервые на основе комплекса физико-химических, технологических и биофармацевтических исследований разработаны составы наночастиц (НЧ) на основе полибутилцианоакрилата (ПБЦА) с тетрапептидом и феназепамом, получена экспериментальная форма наночастиц с эритропоэтином на основе ПБЦА, а также разработаны технологические схемы получения стабильных лиофилизатов наночастиц тетрапептида и феназепама.
Изучены физико-химические и технологические характеристики полученных экспериментальных наносомальных форм тетрапептида, феназепама и рекомбинантного эритропоэтина человека.
Изучена специфическая активность полученных экспериментальных форм на лабораторных животных. Показано, что применение наночастиц тетрапептида Phe--Ala-Gly-Trp-NH2 обеспечивает повышение анксиолитической активности и пролонгирование действие вещества в сравнении с субстанцией, а в случае использования наноносителей феназепама снижение нежелательных миорелаксантного и седативного действия при сохранении выраженного анксиолитического эффекта.
На модели ПБЦА-НЧ с рекомбинантным эритропоэтином человека показано, что использование наночастиц, нагруженных биологически активными веществами, обеспечивает их доставку через неповрежденный ГЭБ при внутривенном введении.
Практическая значимость полученных результатов
На основании проведенных исследований разработаны:
Оригинальное лекарственное вещество – тетрапептид структуры: Phe--Ala-Gly-Trp-NH2;
Состав экспериментальной лекарственной формы наночастицы с феназепамом (лиофилизат для инъекций)
Состав наноразмерной формы тетрапептида анксиолитического действия (лиофилизат для приготовления назальных капель);
Состав наноразмерной формы рекомбинантного эритропоэтина человека;
Технология получения лиофилизата наночастиц тетрапептида (Лабораторный регламент, апробированный в лаборатории биологически-активных соединений НИИ фармации).
Положения, выносимые на защиту
результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию стратегии синтеза соединения – тетрапептида Phe--Ala-Gly-Trp-NH2 , а также состава и технологии получения его экспериментальной формы с наночастицами;
результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию состава и технологии получения экспериментальной формы феназепама с наночастицами;
результаты теоретических и экспериментальных исследований по разработке технологии получения наноразмерной формы эритропоэтина;
результаты исследований физико-химических и технологических характеристик полученных наноразмерных форм биологически-активных соединений;
результаты изучения специфической активности полученных наноразмерных форм на лабораторных животных.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на заседании №4 от 15.11.2011 межкафедральной научно-практической конференции на кафедре фармацевтической технологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.
Положения и практические результаты работы доложены на VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность (Москва, 2009 г.).
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и внедрения в практику.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 – Технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.
Связь задач исследования с проблемным планом
Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер Государственной регистрации 01.2.00606352).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ полностью отражающих ее содержание, в том числе 2 статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ и патент «Тетрапептид, обладающий анксиолитическим действием» (№2429003 от 20.09.2011).
Объем и структура диссертации
Агонисты, антагонисты серотониновых 5-НТ-рецепторов
До 20% населения в развитых странах мира страдают различными невротическими нарушениями (неврозами), а современный ритм жизни, ситуации повышенного эмоционального напряжения, социальная обстановка в мегаполисах приводят к дополнительному увеличению числа регистрируемых невротических расстройств в среднем на 10% от указанного количества [138].
Распространение этой патологии в популяции чревато не только социально-экономическими проблемами, в частности увеличением расходов на лечение, на оплату дней нетрудоспособности и др., но и существенно сказывается на качестве жизни индивидуума и его межличностных отношениях.
Одним из характерных клинических проявлений неврозов являются тревожные расстройства, которые вызывают дезадаптацию и десоциализацию личности, ухудшая психоэмоциональное состояние человека [47]. Тревожные расстройства являются наиболее распространенными (до 70%) формами депрессивных состояний непсихотического генеза. Осложненные тревожностью неврозы имеют более сложную клиническую картину, тревога может стать самостоятельным патогенетическим фактором, что еще больше осложняет терапию заболевания. Длительная тревожность (и/или фобия) способствует формированию психосоматической патологии, ухудшает течение и прогноз уже имеющихся соматических заболеваний [30; 95].
Вместе с тем, тревожные и тревожно-фобические состояния могут быть как проявлениями неврозов, так и самостоятельными нозологическими формами (генерализованное тревожное расстройство, панические атаки, социальная фобия и др.), в том числе и в сочетании с депрессивной симптоматикой. Тревожные расстройства характерны для пожилых людей, у которых с возрастом происходит усугубление клинической картины.
Для терапии невротических состояний применяют препараты нейротропного действия, в частности антидепрессанты, седативные и снотворные средства, анксиолитики. При этом эффективность терапии во многом остается недостаточной, что может объясняться двумя основными причинами. С одной стороны, длительный прием некоторых групп препаратов, в частности бензодиазепинов, производных фенотиазина, приводит к развитию к ним толерантности, что, в свою очередь, влечет за собой увеличение принимаемых доз препарата и усиление токсического эффекта. С другой стороны, большинство лекарственных веществ, оказывая неселективное действие на организм, только в незначительной части попадает в орган/клетку-мишень.
Создание необходимой терапевтической концентрации лекарственного средства в месте локализации патологии вызывает необходимость введения избыточного количества лекарственных веществ, что приводит к развитию серьезных побочных эффектов, в частности, нарушениям функции печени, почек, сердечно-сосудистой системы.
Терапия тревожных расстройств достаточно сложна и не всегда эффективна. В первую очередь, это связано с недостаточным пониманием патогенеза заболевания. По современным представлениям, развитие тревоги не является результатом дисфункции какой-либо одной нейромедиаторной системы, а отражает возникновение системного регуляторного дисбаланса различных нейромедиаторов на самых разных уровнях структурно-функциональной организации - от молекулярного до уровня целостного мозга [29; 32; 165]. Ключевое место в формировании отмеченного дисбаланса традиционно отводят ГАМК-ергической системе (ГАМК - гамма-аминомасляная кислота). В то же время в последние годы появляется все больше данных, свидетельствующих о важной роли в патогенезе тревожности серотониновой дисфункции - гиперактивности серотонинергическои системы, а также глутаматнои и неиропептиднои медиации.
Для лечения тревожных расстройств применяют анксиолитики (от лат. anxietas - тревожное состояние, страх + греч. lytikos - способный растворять, ослабляющий), или транквилизаторы (от лат. tranquillo - успокаивать) -психотропные средства, снижающие выраженность или подавляющие тревогу, страх, беспокойство, эмоциональное перенапряжение.
Согласно классификации по механизму действия [66], все анксиолитики подразделяются на традиционные анксиолитики (прямые агонисты ГАМК-А-бензодиазепинового рецепторного комплекса, производные бензодиазепина, препараты разного химического строения (мепробамат, бенактизин, мебикар, оксилидин и др.) и новые анксиолитики. К числу последних можно отнести: - частичные агонисты (абекарнил, золпидем, зопиклон), эндогенные регуляторы (производные карболина, никотинамида) и мембранные модуляторы (мексидол, афобазол) ГАМК-А-рецепторов; - глутаматергические анксиолитики (конкурентные и неконкурентные антагонисты NMDA (Ы-метил-Б-аспартатного) рецептора, антагонисты АМПК (а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол пропионовой кислоты) рецептора, лиганды глицинового участка); - серотонинергические анксиолитики: агонисты и частичные агонисты серотониновых 1А-рецепторов (буспирон, гепирон и др.), антагонисты 1С-, 1D-, 2А-, 2В-, 2С-рецепторов (ритансерин, алтансерин и др.), серотониновых ЗА-рецепторов (закоприл, ондансентрон и др.); - р-адреноблокаторы (пропранолол и др.); - метаболиты нуклеиновых кислот (уридин, калия оротат и др.); -вещества, влияющие на энергетический статус мозга: лиганды аденозиновых рецепторов (А1), вещества, влияющие на биоэнергетический обмен мозга (литонит, никогамол, никотинат рубидия); -гормональные вещества (кортикотропин-рилизинг-гормон, эпифизарный гормон мелатонин и др.); -анксиолитики на основе нейропептидов (пептиды холецистокинина, нейропептид Y, энкефалины, селанк, ноопепт и его метаболит, ингибиторы пролилэндопептидазы и др.); -биологически активные соединения различных фармакологических групп: антагонисты ог-рецепторов; антагонисты нейрокинина 1; агонисты гистаминовых НЗ-рецепторов; ингибиторы МАО-А (моноаминоксидаза), ДОФА-декарбоксилазы (дигидроксифенилаланин); препараты из других групп психотропных средств; препараты растительного происхождения и др.
Далеко не все из вышеперечисленных соединений нашли свое применение в клинике. Многие из упомянутых веществ либо прошли только доклинический этап исследований, либо находятся в той или иной фазе клинических испытаний.
Отечественная клиническая практика располагает небольшим выбором анксиолитиков. Подавляющее большинство использующихся препаратов относится к бензодиазепиновым производным. Бензодиазепины - наиболее распространенные и популярные транквилизаторы [190]. Они обладают широким спектром фармакологического действия, включающим анксиолитическое, седативное, снотворное, миорелаксирующее, противосудорожное, амнестическое и др. Однако, по мере накопления клинического опыта применения классических бензодиазепинов (хлордиазепоксида, диазепама, оксазепама, лоразепама, феназепама и др.) на первый план стали выступать побочные эффекты данных лекарственных средств, нередко перекрывающие их достоинства и приводящие к развитию серьезных осложнений и, в итоге, к отмене терапии.
Методика снятия со смолы полученного пептида
Принцип метода заключается в следующем: полимер растворяется в органическом растворителе (дихлорметан, хлороформ и др.). Лекарственное вещество растворяется или диспергируется в растворе полимера, затем смесь эмульгируется в водном растворе при помощи сурфактантов (твин-80, полоксамер-188, желатин, поливиниловый спирт и др.) для получения эмульсии «вода-масло», возможно получение эмульсии «вода-масло-вода». После получения стабильной эмульсии, органический растворитель испаряют путем повышения температуры и/или продолжительного перемешивания [187]. При этом, для получения частиц необходимого размера используют высокоскоростную гомогенизацию или ультразвуковое диспергирование. Существенным недостатком метода, применительно к промышленному производству, являются значительные энергозатраты.
Метод спонтанного эмульгирования диффузией растворителя Является модификацией метода испарения растворителя [178]. В неводную фазу вместе с гидрофобным органическим растворителем (дихлорметан, хлороформ) вводят водорастворимые жидкости (ацетон, метанол). На границе раздела фаз происходит спонтанная диффузия водорастворимой жидкости, вследствие чего образуется область турбулентности, формирующая частицы мельчайших размеров. За счет варьирования количеств водорастворимой жидкости, вводимых в неводную фазу, можно регулировать размер получаемых частиц. Методы применения сверхкритических жидкостей Выделяют два основных метода применения сверхкритических жидкостей: метод быстрого распыления сверхкритического раствора (RESS rapidexpansionofsupercriticalsolution), метод сверхкритического антирастворителя (SAS - supercriticalantisolvent). Основой методов является изменения растворяющей способности сверхкритических жидкостей при изменении внешних условий.
При использовании RESS-метода основа для получения наночастиц растворяется в сверхкритической жидкости и этот раствор распыляется при помощи форсунки. После распыления растворяющая способность жидкости резко падает и растворенное вещество осаждается, при этом оно оказывается абсолютно свободным от растворителя.
Данный метод широко применялся в 90-е годы ХХвека для получения частиц из биодеградирующих полимеров, в частности полимера молочной кислоты. Равномерное распределение лекарственного вещества внутри полимерной матрицы достигалось для полимеров с низкой молекулярной массой (менее 10000). Большинство высокомолекулярных полимеров мало или совсем не растворимы в сверхкритических жидкостях, что ограничивает применение данной технологии [178].
В SAS-методе раствор основного строительного компонента наночастиц в органическом растворителе, содержащийся в осадительном сосуде, насыщают сверхкритической жидкостью. Под большим давлением некоторое количество анти-растворителя проникает в жидкую фазу, таким образом растворяющая способность падает растворенное вещество осаждается. После осаждения, когда достигается рабочее давление, антирастворитель удаляется из сосуда, чтобы остался только растворитель. Когда количество растворителя снижается до желаемого уровня, давление снимается, и твердый продукт отделяется. Схема метода SAS показана на рисунке 6. Polymer
В модификации метода SAS [164] твердое вещество сначала растворяют в подходящем растворителе и затем этот раствор быстро вводится в сверхкритическую жидкость через узкую форсунку. Сверхкритическая жидкость полностью извлекает растворитель, вызывая осаждение нерастворимого в ней вещества в виде мелких частиц. Этот метод, называемый также методом газового анти-растворителя (GAS - gas anti-solvent), успешно применяется для синтеза как микро-, так и наночастиц.
Наносомальные лекарственные формы - относительно молодые, первые работы по их изучению появились порядка 30 лет назад. За это время сформировался ряд критериев, по которым определяют качество наносомальных лекарственных форм.
К важнейшим параметрам относят размер наночастиц, способность к биодеградации, степень включения биологически-активного вещества. В Германии нормативной документацией устанавливается размер наночастиц -не более 500 нм. Требование к размерам обусловлено диаметром мельчайших капилляров - порядка 1 мкм [131,149,150]. Биодеградация - является обязательным требованием к наночастицам, в связи с чем широкое применение получили НЧ на основе полиакрилатов, широко используемых в хирургической практике. Активно используются для получения наночастиц эудрагиты, фосфолипидные основы.
Степень включения является важным параметром не только для лабораторной технологии, но и для возможного производства. Высокая степень включения позволяет понизить затраты на производство препарата, снизить его себестоимость.
Использование наночастиц возможно как в качестве самостоятельной лекарственной формы, так и в комбинации с уже существующими, такими как капсулы, аэрозоли, инъекционные лекарственные формы и др. При производстве каждой из этих форм могут предъявляться определенные специфические требования, так важной проблемой в технологии изготовления инъекционных лекарственных форм является выбор метода стерилизации [20]. Среди всех методов стерилизации наиболее надежным и технологичным являются термический и радиационный. Однако применение термической обработки для стерилизации полиалкилцианоакрилатных (ПАЦА) наночастиц невозможно из-за низкой термостойкости дисперсионных сред и составляющих их компонентов. Так, температура размягчения полиизобутилцианоакрилата - 105 С [72]. Группой исследователей изучалась возможность применения радиационной стерилизации при изготовлении инъекционной формы ампициллина на основе полиалкилцианоакрилатных наночастиц. Показано, что глубина радиационного разрушения отдельных компонентов системы зависит от многих факторов, таких, как характер среды (водная суспензия или лиофилизированный порошок), природа компонентов, составляющих систему из наночатсиц, структура твердой матрицы, т.е. распределение компонентов в наночастицах (либо твердый раствор, либо смесь компонентов в различных фазах и т.д.) и ряда других. Основным видом косвенного воздействия при радиолизе наносистем с ампициллином являются реакции активных частиц, образующихся в водной фазе и диффундирующих к поверхности. При этом известно, что гамма-облучение полиметилциананакрилата (гомолога полиизобутилцианакрилата) происходит уменьшение молекулярной массы пропорционально дозе [20].
Исследования показали, что степень разложения наночастиц за счет прямого действия облучения дозами от 20 до 30 кГр не может превысить 5%. Такое изменение не должно приводить к ухудшению свойств наночастиц в целом, что подтверждается данными физико-химических и микробиологических исследований.
Стратегия конструирования тетрапептида
В диапазоне 1 - 6% концентрация мономера цианоакрилатов не оказывает значительного влияния на размер наночастиц. Повышение концентрации мономера приводит к увеличению концентрации наночастиц, чем к изменению их свойств, при этом увеличивается вязкость раствора, что может снижать устойчивость коллоидной системы. При концентрации БЦА выше 7 - 10% суспензия теряет текучесть, и синтез наночастиц в таких условиях проводить нецелесообразно. При низкой концентрации мономера (значитетельно менее 1%) высока полидисперсность наночастиц, при повышении концентрации она снижается и перестает существенно меняться в диапазоне 1 - 6% [104, 105]. Кроме того, при низкой концентрации понижается абсолютное количество лекарственного вещества, которое может сорбироваться на полимерной матрице. Исходя из этих данных, для получения НЧ с последующей сорбцией препарата использовали концентрацию БЦА 1% по объему.
Значение рН реакционной среды является важнейшим фактором, определяющим характеристики как полимера, так и образующихся наночастиц. В нейтральных условиях, то есть в заведомом избытке инициатора, полимеризация происходит обвально с образованием агломератов [117]. По этой причине наночастицы получают в кислой среде. Для обеспечения необходимого значения рН дисперсионной среды и прохождения анионной полимеризации используют янтарную, аскорбиновую и другие кислоты. Для выбора рН-обсеспечивающего агента нами были получены образцы пустых ПБЦА-НЧ с лимонной и соляной кислотами. Полученные данные представлены на рис. 26. соляная кислота
Показано, что увеличение скорости перемешивания с 1200 до 3000 об/мин приводит к повышению полидисперсности наночастиц из ПБЦА, при этом собственно размер частиц практически не меняется [104, 105]. Данное наблюдение может быть связано с тем, что при увеличении кинетической энергии растущих частиц растет их способность преодолевать силу отталкивания и сливаться друг с другом [85,145]. На первом этапе полимеризации, когда исчезает эмульсия мономера, необходима высокая скорость перемешивания, чтобы максимально «раздробить» эмульсию. Вместе с тем, высокая скорость перемешивания приводит к вспениванию ПАВа, а полимеризация проходит на границе раздела фаз газ-жидкость, что приводит к высокой степени агломерации частиц (Рис. 27)
Свойства готового продукта зависят от ряда технологических факторов: типа/концентрации мономера, рН полимеризационной среды, вид агента, обеспечивающего необходимые значения рН среды, типа поверхностно-активного вещества, температуры дисперсионной среды, скорости перемешивания, объема смеси, типа емкости, применение нейтрализации, режима лиофилизации.
Степень сорбции также зависит от времени инкубации, введения полисорбата-80 для покрытия готовой системы.
В химический стакан отвешивали 100,0 мг порошка полоксамера-188 и 10,0 мл воды дистиллированной. В полученный раствор добавляли 0,1 г янтарной кислоты, устанавливали на магнитную мешалку на 10 мин до полного растворения янтарной кислоты. На магнитной мешалке устанавливали температуру 35±2С и скорость 500 об/мин. 2. Введение БЦА в дисперсионную среду. Спустя 10 минут перемешивания в систему по каплям вводили 100 мкл бутилцианоакрилата. Через 1-2 минуты появлялось помутнение раствора, свидетельствовавшее о начале полимеризации. 3. Полимеризация бутилцианоакрилата. Перемешивали полученную систему на магнитной мешалке в течение 2 часов под тягой при t=35 С, скорости вращения = 500 об/мин.
Лиофилизат наночастиц разводили водой очищенной и ресуспендировали. К полученной суспензии ПБЦА наночастиц прибавляли ПС-80 в концентрации 0,4% по массе после чего вводили 100 мг субстанции тетрапептида и инкубировали при перемешивании на магнитной мешалке при скорости 1000 об/мин в течение 8 часов.
В ходе проведения исследований последовательно было изучено влияние каждого фактора на характеристики наночастиц и степень сорбции.
Инициаторами полимеризации являются гидроксид-ионы, терминаторами - протоны, таким образом, рН является важнейшим фактором, определяющим свойства наночастиц.
Чем выше рН, тем быстрее исчезает «первичная» эмульсия. Для наночастиц из ПБЦА при рН 2 это происходило в диапазоне 30-60 минут, при рН 2,5 и 3 - еще быстрее. При более высоких значениях рН быстрее достигается равновесие, как по размеру, так и по молекулярной массе [85]
При высоких значениях рН (более 4) полимеризация проходит слишком быстро, молекулы мономера и растущие полимерные цепи не успевают диффундировать из «капелек». Показано, что при рН 5 уже через 5-10 минут молекулярная масса полимера устанавливается на определенном уровне и в дальнейшем не меняется. В этих условиях наночастицы не формируются, процесс приводит появлению агрегатов и образованию аморфной полимерной массы. Напротив, при слишком низком значении рН (значительно менее 1) полимеризация проходит медленно, и наночастицы набухают свободным мономером. Такие «полужидкие» наночастицы склонны к необратимой коагуляции друг с другом, что приводит к образованию частиц большого размера [85, 104, 105].
С целью изучения зависимости степени сорбции от размера наночастиц, изготавливали ряд образцов с различными значениями рН дисперсионной среды, что позволило получить НЧ различного диаметра.
Ниже представлены результаты измерения размеров наночастиц (Табл. 3, рис. 28) на основе бутилцианоакрилата в 6 образцах, полученных при рН 1.9, 2.0, 2.4, 2.6, 2.8 и 3.0. Аппроксимация была проведена способом линейного сглаживания (у=тх+Ь), причём величина достоверности (R2) больше 0.8 линейного (R2 = 0.8764).
Контроль качества и исследование стабильности в процессе хранения наночастиц с тетрапептидом
В результате проведенных экспериментов показано, что степень включения ФЗ в наночастицы зависит от соотношения компонентов, при этом оптимальными соотношениями феназепам/ацетон (мг/1 мл) являются 10:1 и 20:1, что объясняется относительно быстрым испарением ацетона из системы. Соотношения 1:1,3:1 и 5:1 имеют меньшую степень включения, что может объясняться более длительным удалением растворителя и, как следствие, образованию частиц сосформированным матриксом и затрудненной диффузия лекарственного вещества внутрь наночастиц. Вместе с тем, при соотношении 50:1 степень включения самая низкая. Это вызвано тем, что ацетон слишком быстро испаряется и феназепам, как нерастворимый компонент, переходит в дисперсионную среду. При этом, часть ФЗ оседает на стенках стакана до включения в матрикс частиц.
Таким образом, на основании полученных данных для дальнейшей работы было выбрано соотношение компонентов 20 мг феназепама в 1 мл ацетона.
Взаимодействие субстанции лекарственного вещества с наночастицами происходит после перехода ФЗ из растворителя в дисперсионную среду по ферментному типу «ключ-замок» [132,133 Д]. В связи с этим, необходимо было найти точку максимального включения субстанции феназепама в зависимости от продолжительности перемешивания.
Как видно из рисунке 30 через 2 часа перемешивания значение степени включения достигает 75,7 %. При более продолжительном перемешивании статистически значимого увеличения степени включения не происходит, что объясняется полным удалением органического растворителя и переходом всего ФЗ в дисперсионную среду после 2 часов перемешивания. На основании полученных данных нами было выбрано время перемешивания 2 часа.
Необходимость в определении данного параметра была обусловлена использованием органического растворителя - ацетона. Процесс формирования наночастиц в технологии анионной полимеризации в значительной степени зависит от того, насколько быстро удалится органический растворитель и изменится показатель растворимости полимера, при этом показатель не должен превышать оптимум, так как биополимеры, очень чувствительны к температурным колебаниям [132]. Соответственно, и температура среды подбиралась с учетом физико-химических свойств ацетона, испаряющегося уже при комнатной температуре. Совокупный анализ факторов позволил остановиться на температуре полимеризационной среды -40 С.
Значение интенсивности вращения магнитной мешалки подбиралось исходя из следующих лимитирующих факторов: слишком низкое значение приведет к увеличению времени испарения органического растворителя и недостаточно быстрому образованию активной поверхности полимера, слишком же интенсивное перемешивание станет причиной вспенивания и увеличения частоты поверхностно-опосредованных явлений. Технологически оптимальные показатели определялись в системе при интенсивности вращения магнитной мешалки 1000 об/мин.
Одним из основных критериев оценки качества наносомальных форм является нагрузка субстанции на полимер. После выявления основных технологических параметров мы изучили степень нагрузки на полимер в полученной наносомальной форме.
Анализируя представленные данные можно сделать вывод о том, что при оптимальных условиях получения наночастиц степень включения достигает максимальных значений начиная с минимальных концентраций. При этом, целесообразно использовать соотношение субстанция феназепама/полимер = 30 мг/100 мкл, позволяющее оптимизировать технологическую схему получения наночастиц.
Полученные экспериментальные данные позволили обосновать оптимальную технологию и состав для получения лиофилизированной лекарственной формы в виде порошка для инъекций. Приготовление дисперсионной среды. На весах взвешивают необходимые количества полоксамера 188 для получений 1% концентрации, лимонной кислоты и помещают в лабораторный стакан. Мерным цилиндром отмеряют нужный объем воды очищенной и приливают к содержимому колбы. Стакан ставят на магнитную мешалку и включают перемешивание (1000 об/мин). Перемешивают до полного растворения. Полноту растворения проверяют визуально. (20 - 25) С.
Растворение феназепама. Поступившая на производство субстанция феназепама должна храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25С. Субстанция ФЗ должна соответствовать параметрам НД. На весах взвешивают в стеклянный флакон необходимое количество (точная навеска) субстанции. С помощью пипетки добавляют необходимое количество ацетона в соотношении 20:1 (мг ФЗ : мл ацетона). Встряхивают до полного растворения.
Введение мономера. В дисперсионную среду при постоянном перемешивании со скоростью 1000 об/мин и температуре 25С по каплям вводят необходимое количество бутилцианоакрилата. О начале полимеризации свидетельствует помутнение раствора и приобретение молочно-белого оттенка спустя несколько минут после введения. Дисперсионную среду с мономером оставляют перемешиваться 45 минут.
Введение раствора феназепама. В дисперсионную среду с полимеризованным бутилцианоакрилатом вводят раствор феназепама в ацетоне Перемешивание. Полученную суспензию перемешивают в течение 2 часов. Фильтрование. После перемешивания из лабораторного стакана суспензию наночастиц переливают в фильтрующую воронку. Фильтр с диаметром пор 1 мкм в фильтрующей воронке подсоединяют к колбе Бунзена, которую в свою очередь подсоединяют к насосу, и проводят фильтрацию суспензии. Полимер, оставшийся на фильтре отбрасывают.
Центрифугирование. Наночастицы отделяют от водной фракции на центрифуге. Заполняют банки для центрифугирования содержимым реактора из емкости, уравновешивают банки на весах и помещают в центрифугу. С помощью специальной программы, согласно инструкции по работе с центрифугой, запускают процесс. Параметры процесса: температура 20 С, скорость вращения 4500 об/мин, время вращения 10 минут. Затем методом декантации удаляют надосадочную жидкость (водную фракцию). Банки наполняют вновь и процесс повторяют до тех пор, пока все содержимое реактора не будет обработано. Осадок промывают небольшим количеством воды и количественно переносят в лоток для замораживания. Осадок из последних центрифужных банок перемешивают и также помещают в лабораторный стакан.
Введение криопротектора. В полученную суспензию вводят криопротектор D-маннитол 3% по массе и перемешивали на магнитной мешалке в течение 15 минут при скорости 500 об/мин до равномерного распределения маннитола.
Замораживание. Из лабораторного стакана суспензию наночастиц переливают в лоток для замораживания и помещают в морозильникна необходимое время (зависит от объема препарата). Процесс заморозки отмечают в маршрутной карте. Лоток маркируют и замороженный препарат в лотке помещают в морозильную камеру. Температуру хранения отмечают в маршрутной карте.
