Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Этиология и патогенез дерматозов 14
1.2. Иммуномодуляторы, механизм действия 17
1.3. Фармакологические свойства тилорона 27
1.4.фармакологические свойства перфторана 34
Заключение 42
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1. Экспериментальные животные (биологические тест-системы) 44
2.1.1. Методика моделирования простого контактного дерматита 46
2.1.2. Методика моделирования ожоговой раны 49
2.1.3. Методика моделирования патологических изменений кожи при денервации и нарушении кровоснабжения 49
2.1.4. Методика трансабдоминальной катетеризации двенадцатиперстной кишки 55
2.1.5. Статистическая обработка результатов 57
Заключение 58
Глава 3. Определение острой токсичности тилорона при ректальном, подкожном и внутримышечном введении ...59
3.1. Экспериментальные животные 59
3.1.1. Экспериментальные группы 59
3.1.2. Результаты исследования 60
3.1.3. Статистическая обработка результатов 75
Заключение 75
Глава 4. Изучение терапевтической активности различных форм тилорона на экспериментальных моделях патологии кожи 77
4.1. Исследование терапевтической активности тилорона на модели ожоговой раны 77
4.1.1'. Экспериментальные животные 78
4.1.2. Экспериментальные группы 79
4.1.3. Статистический анализ 81
4.1.4. Результаты* исследования 81
4.2. Исследование терапевтической активности тилорона» на экспериментальной моде ли' простого контактного дерматита 87
4.2.1. Экспериментальные группьг 88
4.2.2. Статистическая обработка результатов 89
4.2.3. Результаты исследования 89
4.3. Исследование терапевтической активности тилорона при патологии кожи вызванной нарушением кровоснабжения и иннервации 90
4.3.1. Экспериментальные животные 91
4.3.2. Экспериментальные группы 91
4.3.3. Статистическая обработка результатов 93
4.3.4. Результаты.исследований 93
4.4. Исследование терапевтической активности тилорона при введении катетером в двенадцатиперстную кишку 104
4.4.1. Экспериментальные животные 105
4.4.2. Статистическая обработка результатов 106
4.4.3. Результаты и исследования 106
Заключение 108
Глава 5. Исследование терапевтической активности тилорона в комбинации с перфтораном при патологии кожи 110
5.1. Экспериментальные животные ill
5.1.1. Экспериментальные группы 111
5.1.2. Статистическая обработка результатов 113
5.1.3. Результаты исследования 114
Заключение 115
Обсуждение результатов исследования 116
Выводы 127
Список литературы: 130
- Иммуномодуляторы, механизм действия
- Методика моделирования простого контактного дерматита
- Методика трансабдоминальной катетеризации двенадцатиперстной кишки
- Исследование терапевтической активности тилорона» на экспериментальной моде ли' простого контактного дерматита
Введение к работе
Актуальность исследования. На рубеже XX и XXI веков регистрируется прогрессивный рост заболеваемости дерматозами. Болезни кожи и подкожной клетчатки, по данным Федеральной службы государственной статистики, занимают в Российской Федерации третье место по количеству диагнозов, установленных впервые в жизни [Адаскевич В.П., Козин В.М., 2009 г.; Бутов Ю.К., Скрипкин Ю.С., 2009 г.]. По результатам зарубежных исследований, 10% первичных обращений к врачам общей практики обусловлены дерматологическими заболеваниями [Томас П. Хэбиф., 2008 г.]. Одним из клинических проявлений сосудистой и неврологической патологии являются ишемические и нейротрофические расстройства кожи преимущественно нижних конечностей. Хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей страдает около 2-3% населения планеты [Dormandy J., 1999 г.]. У большого количества этих больных возникают трофические нарушения кожи нижних конечностей. По данным Американской Ассоциации диабетологов настоящее время в мире насчитывается более 150 миллионов больных сахарным диабетом. При длительно существующем сахарном диабете почти у 80% лиц наблюдаются различные дерматозы, связанные с нарушением макро и микроциркуляции, диабетической полинейропатией, снижением защитной функции кожи. При различных этиологии и патогенезе, клинических проявлениях и течении дерматозы имеют общий патогенетический механизм - значимые отклонения в иммунной реакции организма. Клетки эпидермиса и дермы участвуют в продукции иммунорегуляторных цитокинов, которые контролируют все последовательные этапы адекватной защитной реакции кожи до полной или частичной репарации. В системе цитокинов особое значение имеют интерфероны, выполняющие роль мессенджеров межклеточного взаимодействия иммунокомпетентных клеток, регулируя интенсивность и продолжительность иммуновоспалительного ответа [Симбирцев А.С., 2004 г.].
В настоящее время при лечении дерматозов традиционно используются нестероидные противовоспалительные препараты, регенеранты и репаранты для местного и системного применения, однако индукторы интерферона и заменители компонентов крови не применяются.
Одним из самых эффективных индукторов эндогенного интерферона у человека является тилорон - низкомолекулярный синтетический индуктор интерферона ароматического ряда, относящийся к производным флуоренона [Ершов Ф.А., Киселёв О.И., 2005 г.; Филиппова Т.О., Головенко Н.Я., 2006 г.]. Способность перфторана – перфторуглеродного соединения, адсорбировать и отдавать большие количества газов, улучшать метаболизм и газообмен на уровне тканей, может иметь лечебный эффект при дерматозах обусловленных локальным нарушением артериального кровотока и иннервации.
Представляется актуальным исследование терапевтической активности тилорона на экспериментальных моделях дерматозов в виде монотерапии и в комбинации с перфтораном.
Цель исследования: Изучение противовоспалительной и репаративной активности тилорона при различных путях введения в виде монотерапии и в комбинации с перфтораном на экспериментальных моделях патологии кожи.
Задачи исследования:
1. Провести исследования по определению ЛД50 и категории токсичности тилорона при ректальном, подкожном и внутримышечном введении согласно международной системы классификации токсичности веществ GHS (Globally Harmonized Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures: Acute toxicity hazard categories).
2. Разработать экспериментальные модели химически индуцированного облигатными раздражителями простого контактного дерматита и патологических изменений кожи при денервации и нарушении кровоснабжения.
3. Провести исследование противовоспалительного и репаративного эффекта тилорона при различных путях введения на экспериментальных моделях патологии кожи.
4. Определить эффективность комбинации тилорона с перифокальным подкожным обкалыванием перфтораном на экспериментальных моделях патологии кожи.
5. На основании полученных данных сформулировать рекомендации по клиническому применению тилорона при патологии кожи.
Научная новизна исследования. Ввиду отсутствия литературных данных впервые определены ЛД50 и категория токсичности тилорона при ректальном, подкожном и внутримышечном введении по международной системе классификации токсичности веществ GHS соответствующие 3 категории токсичности.
Разработаны новые экспериментальные модели простого контактного дерматита и патологических изменений кожи при денервации и нарушении кровоснабжения, которые могут быть рекомендованы для неклинических исследований лекарственных препаратов.
Разработана оригинальная методика трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника для длительного энтерального введения исследуемых веществ.
Проведено исследование противовоспалительного и репаративного эффекта тилорона при различных путях введения в виде монотерапии и в комбинации с подкожным перифокальным обкалыванием перфтораном на экспериментальных моделях патологии кожи. Впервые доказана терапевтическая эффективность тилорона при наружном, подкожном и тонкокишечном введении в виде монотерапии и в комбинации с перфтораном на экспериментальной модели патологии кожи, вызванной нарушением иннервации и кровоснабжения.
Научно-практическая значимость исследования. Выполненное исследование по изучению эффективности различных лекарственных форм тилорона на экспериментальной модели патологии кожи, вызванной нарушением кровоснабжения и иннервации, является обоснованием целесообразности проведения их клинических испытаний. Разработанные экспериментальные модели простого химического контактного дерматита, патологических изменений кожи при локальном нарушении артериального кровотока и иннервации пригодны для изучения ранозаживляющих эффектов, как физических агентов, так и фармакологических веществ. Разработанная методика трансабдоминальной катетеризации тонкого кишечника может быть использована в практике физиологических исследований и неклинического испытания энтеральных лекарственных средств. Полученные данные о синергизме терапевтического эффекта комбинации тилорона с перифокальным подкожным обкалыванием перфтораном при патологии кожи могут служить основанием для дальнейших клинических исследований. Выявленный достоверный терапевтический эффект трансабдоминального введения тилорона в тонкий кишечник, является обоснованием разработки кишечнорастворимых (защищенных) пероральных лекарственных форм тилорона. Можно предположить увеличение эффективности защищенных пероральных форм тилорона и при других патологических состояниях. Доказана неэффективность мази тилорона при экспериментальном простом контактном дерматите и пероральных и инъекционных форм тилорона при ожоговой ране.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты проведённых исследований включены в план НИР кафедры биологии, физиологии и патологии, биохимии и микробиологии ПятГФА (акты об использовании результатов НИР, составленные на основе информационного письма «Фармакологическое исследование тилорона в эксперименте» от 20 апреля 2011 года).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. ЛД50 тилорона при однократном внутримышечном введении является 180 мг/кг при однократном подкожном введении 300 мг/кг, при ректальном введении 800 мг/кг. Тилорон при ректальном, подкожном и внутримышечном введении относится к 3 категории токсичности в соответствии с международной системой классификации токсичности веществ GHS.
2. Разработанные экспериментальные модели простого контактного дерматита, патологии кожи при нарушении артериального кровотока и иннервации, трансабдоминального тонкокишечного катетера могут быть рекомендованы для физиологических и неклинических исследований.
3. Тилорон при наружном, подкожном и тонкокишечном введении оказывает выраженное противовоспалительное и репаративное действие на экспериментальной модели патологии кожи, вызванной нарушением кровоснабжения и иннервации.
4. Доказана неэффективность мази тилорона при экспериментальном простом контактном дерматите, пероральных и инъекционных форм тилорона при ожоговой ране, внутрижелудочного введения водного раствора тилорона при патологии кожи, вызванной денервацией и нарушением кровоснабжения.
5. Выявленный достоверный терапевтический эффект трансабдоминального введения тилорона в тонкий кишечник при экспериментальной патологии кожи служит обоснованием разработки кишечнорастворимых (защищенных) пероральных лекарственных форм тилорона.
6. Выявлен синергизм при комбинированном использовании тилорона и перфторана при патологии кожи.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии, филиала Учреждения Российской Академии Наук Института биоорганической химии им. академиков и (ФИБХ) и Пущинского Государственного Университета (ПущГУ).
Апробация работы и публикация результатов исследования. Материалы диссертации доложены на Второй научно-практической конференции с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2010), III Международной научно-практической конференции «Наука и современность -2010» (Новосибирск, 2010), II Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, 2010), Конференции "Информация о лекарственных средствах - качественному использованию лекарств" (Казань, 2010).
По результатам исследования опубликовано 10 работ, в том числе 4 в изданиях рекомендуемых ВАК.
По результатам исследования получен патент «Способ ускорения заживления кожных повреждений, вызванных денервацией и нарушением кровоснабжения», регистрационный № 2423971, от 20.07.2011 г. Авторы Бондаренко Д.А., Мурашев А.Н., Межбурд Е.В.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, в том числе описание материалов и методов, результаты исследования, обсуждение и выводы. Список литературы, состоит из 102 отечественных и 32 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 22 рисунками.
Иммуномодуляторы, механизм действия
Арсенал лекарственных средств, традиционно используемых в целях иммунотерапии, постоянно растёт. Согласно классификации, предложенной. J.W. Hadden и дополненной отечественными иммунологами, все фармакологические иммуномодуляторы разделены на следующие группы: микробные; тимические, костномозговые, цитокины, нуклеиновые кислоты, растительные, химически.чистые иммуномодуляторы [91,1 19] .
Важнейшими" факторами» регуляции защитных реакций человека, в, том числе"реакций воспалениями иммунитета являются цитокины синтезируемые лимфоидными и нелимфоидными клетками.
В настоящее время уже выделено более 200 различных цитокинов, осуществляющих сложные межклеточные и межсистемные взаимодействия. К цитокинам относятся интерфероны, интерлейкины, хемокины, колоние-стимулирующие факторы, трансформирующие ростовые факторы, группа фактора некроза опухолей и некоторые другие. Основными клетками-продуцентами цитокинов иммунной системы являются Т-хелперы и макрофаги, которые выполняют главные функции в поддержке приобретенного и врожденного иммунитета. Т-хелперы 1 типа (ТНГ) продуцируют ИФН-у, ин-терлейкин-2, фактор некроза, осуществляют хелперную- функцию в формировании. клеточного иммунитета, участвуют в опосредованных клетками воспалительных реакциях, тогда как Т-хелперы 2 типа (ТН2). продуцируют -интерлейкины-4, -5, -6; -9, -10, -13, участвуют в формировании гуморального иммунитета. ТН1 и ТН2 участвуют в различных ответных реакциях на патогенное воздействие инфекционных агентов. Резюмируя, любой иммунный ответ развивается в направлении либо ТН1-, либо ТН2-типа.
В иммунной системы цитокины выполняют функции медиаторов, мес-сенджеров межклеточных взаимодействий, регулируют интенсивность и продолжительность иммуновоспалительного ответа, осуществляют взаимосвязь между неспецифическими защитными реакциями и специфическим иммунитетом. Кроме того цитокины осуществляют контроль системы крове творения, принимают участие в неспецифических защитных реакциях организма, влияя на течение воспалительных процессов, свертывание крови, артериальное давление.
Цитокины действуют по эстафетному принципу: воздействие цитокина на клетку вызывает образование ею других цитокинов (цитокиновый каскад) [71]. Цитокины могут влиять на пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность клеток-мишеней. На тканевом уровне цитокины ответственны за развития воспаления; а затем регенерацию тканей. При развитии системной воспалительной реакции (острофазового ответа) цитокины оказывают влияние практически на все органы и системы организма, участвующие в регуляции гомеостаза. На уровне целостного организма цитокины осуществляют связь между иммунной, нервной, эндокринной, кроветворной и другими системами и служат для их вовлечения в организацию и регуляцию защитных реакций воспаления и иммунного ответа, а также регулируют ряд нормальных физиологических функций [18]. Эта важнейшая для всей системы цитокинов функция связана с двумя основными направлениями биологического действия цитокинов - защитой от инфекционных и повреждающих агентов и восстановлением поврежденных тканей [70]:
Экспрессия генов цитокинов начинается в ответ на проникновение в организм патогенов, антигенное раздражение или повреждение тканей. Цитокины в первую очередь регулируют развитие местных защитных реакций, в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и эпителия. Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции с ее классическими проявлениями: развитием отека, покраснением, появлением болевого синдрома и нарушением функции, являющейся основным механизмом реализации врожденного иммунитета. Одновременно цитокины активируют метаболизм соединительной ткани, стимулируют пролиферацию фибробластов и клеток эпителия, что чрезвычайно важно для заживления повреждения и восстановления поврежденной структуры тканей [68, 69]. Цитокины выделены в?новую самостоятельную систему регуляции; ОСНОВНЫХ функций организма; существующую наряду с нервной;и эндокринной; системами и связанную в первую очередь с поддержанием гомеостаза при внедрении патогенов.и нарушении целостности тканей [70].
Єреди многочисленных цитокинов; обладающих; контрольно - регуля-торнымш функциями., особое место отводится интерферонам. Интерфероны (ИНФ) - это семейство гликопептидов,впервые обнаруженные Айзеке № Лин-демаш BJ 1957 году как белковые факторы, определяющие феномен интерференции,. то: есть невосприимчивости биологическою системы: к повторному заражению вирусом! Интерфероны. образуются? в- организмах многих животных, штакже- синтезируются! inr vitro; в. клетках самых; различных типов; как. нормальных,, так w злокачественных, хотят и: вг весьма разных: количествах. бщим их свойством;является нарушение.репликации вирусов в обработанных интерфероном-клетках. За это они и получили свое название, от английского to interfere:— мешать, (вирусам осуществлять синтез своей РНК и белков). Учение об ИФН оформилось в.-быстро развивающийся междисциплинарный; интегративный раздел биологии - интерферонологию [12].
К настоящему времени: известно около 20 ИФН; различающихся!; по структуре: и биологическим свойствам. Они; относятся к классу индуцибель-ных белков позвоночных и: представляют собой? гликопротеиды с молекулярной массош 20-30 Кд. Интерфероногенез; складывается из нескольких:этапов. (индукция; продукция; действие, эффекты) и представляет своеобразную цепную реакцию в ответ на сигнал тревоги (различные заболевания)»[25].
Методика моделирования простого контактного дерматита
Моделирование простого контактного дерматита было» выполнено на 8 самцах белых половозрелых мышей стока CD-I массой 21-27 грамм. К началу введения веществ возраст животных составлял 8-10 недель.
С целью моделирование простого контактного дерматита у всех животных (день 0) удаляли шерстный покров с участка кожи в области спины площадью 2x2 см. Для этого проводили депиляцию косметическим кремом «Veet» производства Reckitt Benckiser (дерматологически апробирован): нанося крем на область депиляции, равномерно растирая пальцем руки (скребок не использовался для уменьшения травмирования кожи), шерсть и остатки крема удаляли бумажной салфеткой, смоченной водой. Для предупреждения самотравмирования и вылизывания области дерматита на животных надевали защитные воротники и содержали индивидуально. Развитие дерматита провоцировали нанесением, на кожу растворов формальдегида различной концентрации. При эпикутанном воздействии этого вещества развивается разной степени коагуляционный некроз в форме струпа, после отторжения, которого выявляется язва, заживающая рубцом. Растворы наносили, прижимая к коже в течение 4-5 секунд кусочек резиновой губки стандартного размера (1,5x1,5 см), смоченный раствором формальдегида. Аппликации начинали через 2 дня после депиляции, проводя серию обработок 5% раствором формальдегида через день в течение 14 дней, то есть 7-кратно. Затем с 18-го дня исследования проводили серию обработок 10% раствором формальдегида через день в течение 14 дней (7-кратно). При моделировании простого контактного дерматита ежедневно с 1 по 45 день наблюдали за макроскопическими изменениями кожного покрова, проводили световую микроскопию и делали фотографии с помощью исследовательского микроскопа Olympus ВХ60, компьютерную обработку которых выполняли программой Image Tool v2.0.
С третьего дня от начала эксперимента на коже в области нанесении формальдегида образовались очаги локальной гиперемии (рис. 1-А), которые к 5 дню стали приобретать характер сливной эритемы, наблюдалась десква-мация эпидермиса и отек участка кожи, контактирующего с формальдегидом (рис. 1-Б). К 15-ому дню у животных отмечалось повреждение кожных покровов с образованием геморрагической корки (рис. 1-В). На 29-й день эксперимента наблюдалось отторжение струпа с образованием эрозии, окруженной зоной выраженной эритемы (рис.1-Г). После образования эрозии аппликации были прекращены. Наблюдалось уменьшение зоны перифокально-го воспаления с сохранением эрозии в течение 6 дней. Полное заживление происходило на 45 день (рис. 1-Д).
Примечание: А. 3 день с начала нанесения формальдегида(стрелками отмечены зоны локальной гиперемии); Б. 5 день с начала нанесения формальдегида (стрелкой отмечена сливная эритема); В. 15 день с начала нанесения формальдегида (стрелкой отмечена геморрагическая корка); Г. 29 день с начала нанесения формальдегида (стрелкой №1 отмечена эрозия окруженная зоной эритемы (стрелка №2)); Д. 45 день (15 день после прекращения обработки пораженного участка формальдегидом). О тяжести развившегося дерматита судили по площади поражения, длительности клинических проявлений. Данные о динамике размеров площади контактного дерматита (где 0 - это первый день нанесения) в зависимости от длительности аппликаций формальдегида представлены в рисунке 2.
Как видно из представленного рисунка максимальная площадь поражения развилась к 27-му дню эксперимента, регресс воспаления завершился к 45-му дню исследования. Дифференциально-диагностическими критериями отличия от аллергического контактного дерматита являлись четкость границ повреждения кожи в пределах нанесения раздражителя, отсутствие полиморфизма дерматологических изменений, быстрота восстановления исходных параметров кожного покрова после устранения раздражителя [9]. Результаты исследований показали, что дерматит вызванный формальдегидом сопровождался существенными изменениями кожного покрова характерными для простого контактного дерматита.
При« моделировании ожоговой раны у аутбредных крыс SD перед операцией производилась однократная внутрибрюшинная инъекция для наркотизации животных. В качестве наркотизирующих средств использовался ке-тамин в сочетании с ксилазином в дозе 80-100 мг/кг + 10 мг/кг соответственно. Непосредственно перед моделированием раны удалялся шерстный покров в межлопаточной области путем выщипывания. Рана моделировалась путем ожога поверхности кожи диаметром 7 мм термостатируемой плашкой. Плашка нагревалась до 80С, затем накладывалась в межлопаточную область животного. На поверхности кожи плашка находилась 10 сек., что позволяло моделировать у всех животных стандартные размеры раны по площади и глубине повреждения! тканей, моделируя ожог третьей А степени (частичное поражение дермы, дном раны служит неповреждённая часть дермы с оставшимися эпителиальными элементами). После проведения процедуры животные помещались в индивидуальные клетки со стерильной подстилкой, и за ними проводилось наблюдение до выхода из наркоза.
Методика трансабдоминальной катетеризации двенадцатиперстной кишки
Для длительного энтерального введения исследуемого вещества разработана методика трансабдоминальной катетеризации двенадцатиперстной кишки. Катетеризация двенадцатиперстной кишки производилась следующим образом. Перед операцией животных взвешивали и рассчитывали объем анестезирующих средств. После наркотизации животного (кетамин + ксилозшг (20мг/мл) 1:1, 0.1мл на ЮОгр массы животного) приступали к подготовке операционного поля: сначала удаляли шерсть в межлопаточной области, поскольку в дальнейшем оттуда выводился катетер. Подготавливали операционное поле в брюшинной области: удаляли шерсть, кожу обрабатывали дезинфицирующим средством «Декосепт». Наркотизированное животное помещали на операционный столик, на спину, фиксировали за лапки. Кожу обрабатывали 0,5 % раствором хлоргексидина биглюконата на 70%-ном этаноле. Операционное поле изолировали стерильной марлевой салфеткой и делали продольный разрез кожи длиной около Зсм. Края брюшной стенки раздвигали с использованием ранорасширителей. При помощи пинцетов осторожно выделяли участок тонкого кишечника на расстоянии 2см от желудка. В нижней выделенной части участка тонкой кишки специальной иглой делали прокол. В образовавшуюся фистулу вводился катетер специальной формы. Эластичные «ушки» позволяли безопасно, не растягивая края отверстия, ввести его через фистулу и зафиксировать там, а внешний ободок препятствовал дальнейшему проникновению катетера в кишечник.
Контуры фистулы обшивались и стягивались кисетным швом. Катетер фиксировался швами к брюшным стенкам и выводился под кожей в межлопаточную область. Для этого высвобождались от фиксаторов лапки животного, разрез прикрывался марлевой салфеткой, крысу переворачивали на живот, кожу в межлопаточной области обрабатывали дезинфицирующим средством «Декосептом», делали поперечный разрез кожи длиной около 5мм. Затем в разрез вставляли стальную трубку диаметром 3-4 мм, которую аккуратно проводили подкожно до разреза в брюшинную область, проталкивали катетер в трубку и выводили в межлопаточную область. Трубку вынимали из-под кожи. Конец катетера фиксировали лейкопластырем. Разрез закрывали прерывистым швом. Крысу переворачивали на спину, накладывали прерывистый шов на операционную рану в области брюшины. В качестве шовного материала и для лигатур использовался Поликон (№000) - полифиламентная резорбируемая антимикробная полиамидная нить. Во время операции использовались только стерильные материалы.
Для всех данных была применена описательная статистика: подсчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением N представлены в итоговых таблицах. Для определения достоверности межгрупповых различий данные проанализированы тестом Mann-Whitney для непараметрических данных. Статистический анализ проводился программой Statistica ver. 7.0. в среде Windows (критерий Стьюдента). Для статистической оценки различий использовали ANOVA с последующим применением рангового теста Дункана. Различия считали статистически значимыми при Р 0,05. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенного исследования разработаны методологические подходы моделирования простого химического контактного дерматита на мышах CD-I путем кожных аппликаций формальдегидом и патологических изменений кожи ступни задних лап у крыс SD при перерезке больше-берцового нерва и перевязке подколенной артерии. Показано, что аппликации 5% формальдегидом в течение 14 дней через день, затем 10% формальдегидом в таком же режиме вызывают у мышей CD-I простой химический контактный дерматит. У крыс SD через 3-5 дней после нарушения иннервации и ишемии задних конечностей начинали появляться патологические изменения кожи стопы, которые прогрессивно нарастали в последующие 2-2,5 недели, после достижения максимальной площади сохранялись на протяжении 9 дней и заживали на 7 неделе эксперимента.
Разработанные модели могут быть использованы при изучении рано-заживляющих эффектов, как физических агентов, так и фармакологических веществ, при проведении неклинических испытаний.
Оригинальная методика трансабдоминальной катетеризации двенадца-. типерстнои кишки позволяет проводить длительное энтеральное введение испытуемых препаратов при проведении неклинических испытаний и физиологические исследования.
Исследование терапевтической активности тилорона» на экспериментальной моде ли' простого контактного дерматита
В клинической, практике врачи — дерматологи часто сталкиваются с контактной- гиперчувствительностыо кожи, которая проявляется в- виде воспаления, возникающего после непосредственного воздействия на кожу различных химических- веществ: химические вещества на производстве и в быту, лекарственные, парфюмерно-косметические средства. Контактный.дерматит встречается у 5-10% населения. Показатель заболеваемости контактным дерматитом в1, разных странах варьирует в зависимости от степени- индустриализации и воздействия различных химических факторов [34, 95]. Кожа, выполняющая функцию барьерного органа, обладает относительно автономными. собственными структурами иммунного реагирования , [102]. Как иммунный орган кожа, клетки эпидермиса и дермы способны служить микроокружением для лимфоцитов, участвовать в продукции иммунорегуляторных цитокинов и развитии локального иммунного ответа. Высокая миграционная способность иммунокомпетентных клеток, их постоянная рециркуляция обеспечивает устойчивую связь кожи с центральными органами иммунитета. Любое нарушение целостности внешних границ организма-вызывает активизацию иммунной системы кожи с целью устранения локальной агрессии. В. большинстве случаев, патологическому воздействию экзогенных факторов способствуют дополнительные факторы, нарушающие- механизмы защиты организма и приводящие к изменению его реактивности. Bs исследованиях последних десятилетий доказана тесная взаимосвязь патогенеза большинства дерматологических заболеваний с нарушениями в иммунной сфере [72, 73]. Уникальность кожи как органа состоит в том, что она доступна к непосредственному нанесению лекарственных средств на кожный покров. Наружная терапия- позволяет получить достаточно быстрый и выраженный терапевтический ответ при подавляющем большинстве дерматозов. Поэтому местное лечение играет важную, а порой и приоритетную роль в купировании воспали 88 тельных симптомов кожных заболеваний. Лекарственные вещества, испо.ль_ зуемые в наружной терапии, проникают вглубь кожи через кератиновый слой путем абсорбции. При этом неповрежденный кератиновый слой выступает в роли депо, из которого препарат проникает в более глубокие слои кожи, &Ь1_ зывая длительный лечебный эффект [2]. В; связи с вышеизложенным представляется перспективным исследование эффективности иммуномодулятора тилоронашри наружном применении на экспериментальной-модели простого контактного дерматита индуцированного аппликациями формальдегида:
Моделирование контактно го дерматита были выполнены на 20 самц;ах белых половозрелых мышей стока CD-I массой 21-27 грамм. Начальная индивидуальная масса животных не отличалась более чем на 10%, от средне массы,животных всей группы. К началу введения веществ возраст животных составлял 8-10 недель. Животные были разделены на 2 группы по 10 особей В обеих группах развитие дерматита индуцировали через 2 дня после депиляции кожи-спины аппликациями 5-Ю % водных растворов формальдегида На 26 день после начала моделирования контактного дерматита, когда площадь поражения достигла 100 мм2 в основной группе ежедневно на область дерматита стала наноситься мазь тилорона (состав: тилорон - 1г ПЭО-40О 39;2г (80%), ПЭО-1500 - 9,8г (20%)) по 0;3 грамма. В контрольной -группе в качестве плацебо наносили мазеобразующую основу - ПЭО-400 - 39 9 (80%), ПЭО-1500 - 9,8г (20%). Исследуемые препараты предоставлены ЗАО «Биологические исследования и Системы» г.Пущино.
В начале эксперимента животные находились под постоянным наблюдением в течение первых суток, в последующие дни - периодически, утром и вечером. Общая длительность экспериментов составляла шесть недель. Отклонений, влияющих на качество и целостность полученных данных, и/или их интерпретацию не было. 4.2.2. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Для каждой экспериментальной группы были подсчитаны средние значения и их стандартные ошибки. Для определения достоверности различий между группами был использован тест Mann-Whitney. Статистический анализ проводился с помощью программы Statistica 7.0. Различия считали статистически достоверными при Р 0.05.
Рост сосудистых и неврологических заболеваний в промышленно развитых странах в последнее время принимает характер пандемии, приобретая в связи с этим особо актуальную медицинскую и социальную роль. Одним из клинических проявлений данной патологии являются нейротрофические и ишемические расстройства кожи преимущественно нижних конечностей [3]. При нарушении иннервации и ишемии кожи развивается? сначала локальная воспалительная реакция, а при массивном повреждении тканей системная воспалительная реакция в механизме которых играет роль запуск цитокино-вого каскада [1]. Данные изменения обычно протекают на фоне снижения иммунологической реактивности организма, которая негативно влияет на восстановление целостности повреждённой ткани. Для эффективного восстановления тканей кожи необходимо, чтобы воспалительный процесс, как защитная реакции организма, протекал адекватно степени и объёму повреждения. Рациональные способы иммунокоррекции позволяют индуцировать адекватную иммунологическую реакцию [83]. В связи с этим представляется перспективным исследование эффективности тилорона при лечении патологических процессов кожи с малой тенденцией к заживлению возникающих на фоне нарушенной трофики тканей и реактивности организма вследствие внешних или внутренних воздействий, которые по своей интенсивности выходят за пределы адаптационных возможностей организма.
