Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Современные представления о патогенезе сахарного диабета 9
1.2. Виды и механизмы развития осложнений сахарного диабета 11
1.3. Свободно-радикальное окисление и его роль в патогенезе сахарного диабета 16
1.4. Антиоксидантная система организма и ее роль в патогенезе осложнений сахарного диабета 22
1.5. Влияние антиоксидантов на течение «окислительного стресса при сахарном диабете 26
1.6. Моделирование сахарного диабета 32
Глава 2. Материалы и методы 38
Глава 3. Экспериментальное моделирование сахарного диабета 46
3.1. Аллоксановый диабет 46
3.2. Стрептозотоциновый диабет 54
Глава 4. Оценка эффективности препаратов антиоксидантного типа действия в моделях экспериментального сахарного диабета 60
4.1. Влияние на течение аллоксанового диабета 60
4.2. Влияние на течение стрептозотоцинового диабета 67
Глава 5. Влияние препаратов антиоксидантного типа действия на функциональное состояние периферической нервной системы, процессы памяти, состояние иммунитета, уровень апоптоза в условиях аллоксанового диабета и на показатели конканавалин а-обусловленного воспаления 74
5.1. Процессы памяти 74
5.2. Нервно-мышечная передача 75
5.3. Состояние иммунитета, уровень апоптоза, противовоспалительная активность 77
Обсуждение полученных результатов 81
Список литературы 98
- Антиоксидантная система организма и ее роль в патогенезе осложнений сахарного диабета
- Влияние антиоксидантов на течение «окислительного стресса при сахарном диабете
- Влияние на течение стрептозотоцинового диабета
- Состояние иммунитета, уровень апоптоза, противовоспалительная активность
Введение к работе
Сахарный диабет (СД) является актуальной проблемой современной эндокринологии. Наиболее частой причиной инвалидности и преждевременной смерти больных СД является развитие сосудистых осложнений (микро- и макроангиопатии) и нейропатии [8, 9, 11, 33, 35, 36, 72, 97, 109, 121]. Сложный патогенез данного заболевания включает генетические факторы, иммунологические; нарушения и нарушение всех видов обмена веществ, что приводит к метаболическим сдвигам и запускает каскад реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Разработка средств и методов лечения СД, оказывающих влияние на различные звенья патогенеза, является актуальной задачей эндокринологии.
На сегодняшний день терапия СД направлена на снижение уровня глюкозы крови путем восполнения дефицита инсулина его аналогом или же стимуляцию секреции островковых клеток и повышение утилизации глюкозы периферическими тканями введением сахароснижающих препаратов [2, 8, 9, 36, 42, 77, 79, 133, 138]. Подобная тактика лечения не учитывает необходимость воздействия и на другие звенья патогенеза СД, лежащие в основе развития диабетических осложнений [1, 34, 58, 62, 89, 93, 95,102,129].
По данным многочисленных исследований значительная роль в патогенезе сахарного диабета и его осложнений принадлежит окислительному стрессу [31, 34, 58, 61,125,132, 150, 153, 165]. Установлена четкая корреляционная зависимость между гипергликемией и степенью выраженности окислительного стресса, наличие которого сопровождается активированием процессов перекисного окисления липидов [10, 34, 102, 160, 175, 180]. Нарушения в системе ПОЛ, наряду с метаболическими и генетическими факторами, обусловливают развитие сосудистых и неврологических осложнений диабета [9, 36, 40, 54, 55, 70,129,165].
Таким образом, актуальными являются исследования, направленные на поиск новых лекарственных средств, обеспечивающих профилактику и
5 терапию поздних осложнений СД с учетом патогенетических механизмов их развития.
К подобным средствам фармакологической коррекции можно отнести препараты, восстанавливающие нарушения клеточного метаболизма, в первую очередь, антиоксиданты-антигипоксанты.
Цель исследования
Экспериментальное изучение специфической фармакологической активности комплексного препарата «Цитофлавин», обладающего антиокси-дантной и метаболотропной активностью в условиях модели декомпенсиро-ванного сахарного диабета как средства профилактики и терапии поздних осложнений СД.
Задачи исследования
Изучить дозозависимые эффекты диабетогенов аллоксана и стреп-тозотоцина в отношении летальности животных (крысы), показателей, характеризующих клиническую картину заболевания, уровня содержания глюкозы и длительности гипергликемического периода, инсулинпродуци-рующей функции Р-клеток поджелудочной железы, углеводного и липидно-го обменов, функциональной активности печени и почек, процессов пере-кисного окисления липидов и антиоксидантной защиты. Выбрать дозы диабетогенов, вызывающие экспериментальный диабет тяжелой степени (де-компенсированный диабет).
Изучить влияние препарата «Цитофлавин» и эталонного средства для лечения поздних осложнений сахарного диабета — «а-липоевая кислота» - на течение клинической картины, состояние углеводного и липидного обменов, процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной защиты в условиях экспериментального декомпенсированного диабета различного генеза.
3. Изучить влияние препарата «Цитофлавин» в сравнении с препара- I том «а-липоевая кислота» на процессы нервно-мышечной передачи и когни- j тивные функции, состояние митохондриальной активности спленоцитов и уровень апоптоза в них в условиях декомпенсированного аллоксанового диабета. Изучить влияние препарата «Цитофлавин» в сравнении с препаратом «а-липоевая кислота» на показатели конканавалин А-обусловленного воспаления.
Научная новизна
Впервые проведена экспериментальная оценка эффективности препарата «Цитофлавин» в условиях декомпенсированного экспериментального диабета различного генеза. В отличие от стандартных антидиабетических препаратов продемонстрировано выраженное позитивное влияние на состояние липидного обмена, системы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты организма (АОЗ), лежащих в основе патогенеза осложнений сахарного диабета. Эффективность изученного препарата превосходила эффективность эталонного средства для лечения поздних осложнений диабета - «а-липоевая кислота».
Впервые установлено, что введение препарата «Цитофлавин» способствует экспериментальной коррекции неврологических и когнитивных нарушений в модели декомпенсированного СД, что обусловлено входящими в спектр фармакологической активности препарата антиоксидантной и ме-таболотропной активностью и иммунопротективными свойствами.
Положения, выносимые на защиту
Препарат «Цитофлавин», обладая невыраженным по сравнению со стандартными антидиабетическими препаратами антигипергликемическпм действием, значительно превосходит их по степени корригирующего воздействия на состояние липидного обмена, процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной системы защиты организма в уело-виях декомпенсированного экспериментального диабета различного генеза.
Препарат «Цитофлавин» вызывает выраженный регресс патологических изменений афферентной чувствительности и функционального со-стояния нервно-мышечной передачи, а также когнитивных нарушений, обусловленных действием диабетогена - аллоксана.
7 3. В основе терапевтической эффективности препарата «Цитофлавин» в отношении поздних осложнений* сахарного диабета лежит позитивное влияние на состояние процессов липопероксидации и активности анти-оксидантной системы, нарушения липидного обмена, изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, а также наличие в спектре его фармакологической активности противовоспалительного действия.
Научно-практическая значимость
Полученные данные представляют собой экспериментальное обоснование роли препарата «Цитофлавин» как средства профилактики поздних осложнений сахарного диабета на гомеостатическом уровне при экспериментальном сахарном диабете.
Показано, что в основе экспериментальной терапевтической эффективности изученного препарата лежит коррекция биоэнергетических нарушений, обусловленных действием диабетогенов.
Результаты настоящего исследования определяют перспективность применения препаратов антиоксидантного/метаболического типа действия, в том числе «Цитофлавина», в комплексной терапии сахарного диабета с целью снижения риска развития осложнений, сопутствующих данному за-болеванию и приводящих к инвалидизации и преждевременной смерти.
Апробация и публикация материалов исследования
Материалы диссертации изложены на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» в СПб МАЛО (Санкт-Петербург, 2006, 2009), на XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в С-Пб, 2009», заседаниях Ученого совета и межлабораторных заседаниях ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России.
Реализация работы
Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Сахарный диабет». Результаты работы реализованы в научно-исследовательской деятельности ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА РФ.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированы 24 таблицами, 6 рисунками и 1 схемой. Диссертация состоит из введения,,обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, главы с обсуждением результатов исследований, выводов, списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 96 отечественных и 91 иностранных источников.
Антиоксидантная система организма и ее роль в патогенезе осложнений сахарного диабета
Для поддержания ПОЛ на определенном оптимальном уровне в организме задействовано несколько компонентов антиоксидантной системы организма, различающихся по своим свойствам. Антиоксиданты представлены следующими группами соединений [95]: 1) ферменты: супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, глутатионзави-симые пероксидазы и трансферазы; 2) фитонутриенты: витамины С и А, семейство токоферола (а-, р-, у-, 5-токоферолы), каротены (около 500 соединений), флавониды и полифенолы (около 4000-5000 соединений), селен и различные микроэлементы; 3) липоевая кислота и ее восстановленная форма - липоат; 4) секвестранты металлов: альбумин, трансферрин, ферритин; 5) другие антиоксиданты: глутатион, таурин, убихинон, ураты. Механизмы антиоксидантной защиты включают в себя как ферментативные, так и неферментативные процессы. Примером некаталитической реакций разрушения радикалов является гидролиз. Детоксикация перекис-ных радикалов обеспечивается липидной антиоксидантной системой токоферола и нелипидной - глутатиона. Ферментная антиокислительная система представлена супероксиддисмутазои, каталазои, пероксидазой. Эта система инактивирует свободные радикалы с помощью потока протонов, источником которых является фонд НАДФН. Важную роль в антиоксидантной защите клеток играют СОД и каталаза [44, 51, 95,117, 139]. Полную ликвидацию последствий «окислительного стресса» осуществляет глутатионовая система (глутатион, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза). Отдельные элементы системы защиты действуют комплексно и потенцируют эффекты друг друга [72, 90, 95, 104, 114]. Литературные данные свидетельствуют о низкой антиокислительной активности пожелудочной железы, а также ферментов антиперекисной защиты гутатионредуктазы, глутатионпероксидазы и СОД [27, 44, 46, 51, 56, 57,125,139].
Диабетогены оказывают цитотоксический эффект, ингибируя СОД в {3-клетках. СОД является основным ферментным фактором защиты внутри клетки; ее роль заключается в превращении супероксид-аниона в менее ак тивный окислитель — перекись водорода, которая затем элиминируется ка талазой до молекул воды и молекулярного кислорода [44, 180]. Имеются сведения о том, что медь-цинксодержащая СОД присутствует в достаточном количестве в Р-клетках островков Лангерганса, что, вероятнее всего, обес печивает их гомеостаз [72, 125]. В то же время, многие авторы утверждают, что при сахарном диабете отмечается дефицит СОД. Считается, что сниже ние активности СОД менее чем на 50 % от нормального уровня создает ус ловия для неконтролируемого увеличения концентрации супероксидных анион-радикалов, что может привести к необратимым изменениям в клетках [44, 72, 95]. Имеются сведения, что у больных ИЗСД 1 типа в дебюте забо левания имеется увеличение активности СОД, что, по-видимому, носит за щитный характер и отражает адаптационные возможности организма [72, 120]. "; " Каталаза, также как и СОД, является основным антиокислительным ферментом всех клеток организма. В клетках каталаза, в основном, сосредоточена в пероксисомах, в которых содержатся и ферменты, продуцирующие перекись водорода, необходимую в ходе ряда процессов жизнедеятельности организма, в частности, в процессах неспецифической иммунной защиты. Активность этого фермента зависит от наличия сульфгидрильной оснащенности ее активного центра. Это обуславливает чувствительность каталазы к тиоловым ядам, в число которых входит и диабетоген аллоксан, одним из механизмов действия которого считается повреждение тиоловых групп [12, 20, 29, 46, 62, 83,104,175]. В литературе данные об активности каталазы у больных сахарным диабетом весьма противоречивы. Так, по мнению Лебедева Е.А. и соавт. (1997), каталазная активность у больных СД 1 типа не имеет отличий от контрольных значений, при этом данный факт не зависит от наличия или отсутствия у них осложнений [59]. Другие исследователи, напротив, выявили значимое снижение каталазы в сыворотке больных сахарным диабетом 1 и 2 типа по сравнению со здоровыми лицами. В другом литературном источнике имеются указания на повышение уровня каталазы у больных сахарным диабетом 1 типа [35]. Иностранные исследователи не выявили различий уровня каталазы между пациентами с низким и высоким уровнем активности ПОЛ. Никифоров О.Н. с соавт., (1997) представили данные о наличие дисбаланса в активности каталазы, который не ликвидируется у больных с сахарным диабетом 1 типа при нормализации углеводного обмена [71].
СОД и каталаза обладают слабой активностью по отношению к ли-пидным пероксидам, образующимся при интенсификации процессов ПОЛ [45]. Инактивация этих продуктов осуществляется системой глутатиона.
Глутатион восстанавливает дегидроаскорбиновую кислоту прямым и неферментативным путем до аскорбиновой кислоты. Эта реакция является одним из основных механизмов антиоксидантной системы. При этом клетки периферических тканей поглощают экзогенную дегидроаскорбиновую кислоту и в присутствии глутатиона конвертируют ее в цитоплазме в аскорбиновую кислоту. Восстановление глутатиондисульфида в глутатион катализируется глутатион редуктазой и требует участия NADPH в качестве кофактора. Недостаточность глутатиона снижает содержание аскорбиновой кислоты в тканях и одновременно повышает концентрацию дегидроаскорби-новой кислоты. Снижение уровня ВГ создает условия для окисления SH 25 групп, входящих в состав множества ферментов и структурных белков. В результате блокируются функции таких ферментов как Г-6-ФДГ, лактатде-гидрогеназы, моноаминоксидазы, АТФ-азы, каталазы, ГР и др. [44, 90,104].
Уменьшение антирадикальной емкости тиоферментов ослабляет устойчивость организма к гипоксии [81, 128, 153]. Согласно данным Билич И.Л. и Тригулова B.C. (1982) при СД отмечается значимое снижение активности в крови SH-групп у лиц как в состоянии компенсации, так и в состоянии декомпенсации [16].
К числу глутатион-зависимых ферментов относится глутатионперок-сидаза (ГП), которая участвует в утилизации Н2О2 и элиминации гидроперекисей жирных кислот и других органических перекисей. ГП обладает большим сродством к перекиси водорода, чем, например, каталаза [45, 50, 81]. Щербачева Л.Н. с соавт. (1994) приводят данные о снижении активности ГП у детей, страдающих СД 1 типа. Аналогичные результаты были получены и в работе Frantisek V. et al. (2000), причем наиболее выраженное снижение активности ГП отмечалось в стадии декомпенсации сахарного диабета и в случаях, когда диабету сопутствует ИБС [127]. По данным других исследований активность ГП не изменялась как при впервые диагностируемом, так и длительно текущем заболевании.
Глутатионтрансфераза (ГТ) восстанавливает уровень гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот (арахидоновой, линоленовой), моно-нуклеотидов, ДНК, а также фосфолипидов, участвуя в защите билипидного слоя мембран [29, 44]. Восстановленный глутатион (ВГ) необходим для нормальной работы глутатион-зависимой АО системы. Поддержание его достаточного количества в клетке осуществляется ферментами обмена глу-татиона, к которым относится глутатионредуктаза и Г-6-ФДГ.
Влияние антиоксидантов на течение «окислительного стресса при сахарном диабете
Витамин С, или аскорбиновая кислота - водорастворимый витамин, играет активную роль в нескольких процессах, включая защиту от инфекции, повышении иммунности, в процессах заживления ран, а также принимая участие в образовании антистрессовых гормонов. Витамин С в виде ионов аскорбата является одним из активных элементов системы антиокси-дантной защиты, предохраняя липиды от окисления их пероксидными радикалами. Исследованиями последних лет установлено, что витамин С необходим для тканевого роста, восстановления и новообразования сосудов [154, 164]. Содержание витамина С в плазме крови больных диабетом коррелирует с уровнем тликолизированного гемоглобина —HbAlс [171]. Установлено, что терапия витамином Q прерывает повреждающее действие свободных радикалов, уменьшает степень проявления инсулиновой резистентности [9, 140,170].
Витамин Е (а-токоферол) относится к наиболее сильнодействующим природным антиоксидантам и является «первой линией обороны» клеточных и субклеточных мембранных фосфолипидов от атаки их свободными радикалами. При этом в ингибировании ПОЛ участвуют только восстановленные (фенольные) формы витамина Е, а восстановителем антиоксидант-ных свойств токоферола является аскорбиновая кислота. Витамин Е предупреждает образование конечных продуктов гликозилирования нативных ЛНП, стабилизирует плазматические мембраны клеток и лизосом, способствуя тем самым сохранению их целостности и функциональной активности [162]. Кроме того, витамин Е обладает наибольшей тропностью к внутренней мембране митохондрий, где замедляет разобщение процессов окислительного фосфорилирования. В организме витамин Е выполняет функцию антиоксиданта, ингибирует перекисное окисление липидов и удаляет свободные радикалы, включая синглетный кислород, который является мощным окислителем. Витамин Е при взаимодействии с пероксидными радикалами липидов восстанавливает их в гидропероксиды, превращаясь в токо - 29 ферол-хинон, который экскретируется почками [169]. Сахарный диабет сопровождается повышением частоты врожденных уродств, о чем свидетельствуют как клинические, так и экспериментальные данные. Причиной этого является наличие окислительного стресса при диабете, а применение витамина Е в период беременности у диабетических крыс снижает как степень выраженности окислительного стресса, так и тератогенный эффект сахарного диабета [182]. Терапия витамином Е больных сахарным диабетом сопровождается улучшением у них показателей фибринолитической активности, уменьшением гиперкоагуляционных свойств крови, снижением скорости гликозилирования липопротеинов низкой плотности и прогрессирования атеросклероза [131,162,169,178].
Витамин А и каротеноиды (а-/р каротин, р-криптоксантин, ликопен, лютеин, зеаксантин, астаксантин, кантаксантин) являются также антиокси дантами. Показано, что р-каротин, астаксантин, ликопен и кантаксантин in vitro и in vivo (добровольцы) превращают наиболее агрессивный оксидант — синглетный кислород - в менее агрессивную и более стабильную его форму [178]. Среди эссенциальных микроэлементов наиболее выраженными анти-оксидантными свойствами обладает селен (Se), являющийся компонентом жизненно необходимого фермента - глутатионпероксидазы, который относится к одному из основных ферментов антиоксидантного действия.
В поддержании антиоксидантного состояния клетки, наряду с ферментами и витаминами и другими соединениями, активное участие также принимает коэнзим Q10. Коэнзим Q10 образуется в организме, а также поступает в организм с пищей. Он является восстановительным компонентом мито-хондриальной дыхательной цепи и защищает липопротеины низкой плотности от окислительного повреждения [159].
В последние годы появилось множество сообщений о возможности компенсации метаболических нарушений при сахарном диабете, приводящих к энергетическому истощению Р-клеток, с помощью эфиров янтарной кислоты, которые способны проникать внутрь панкреатических Р-клеток, участвовать в цикле Кребса и, восстанавливая синтез АТФ, влиять на секрецию инсулина [44, 50,102, 145]. Установлено, что сукцинат является источником восстановительных эквивалентов в клетке, при этом, его продукция и скорость окисления возрастают в условиях гипоксии. Это обусловлено способностью янтарной кислоты (ЯК) и ее соединений выступать в роли анти-оксидантов, устраняющих радикало-опосредованное окисление органических веществ [48, 49]. In vitro показана способность метиловых эфиров янтарной кислоты стимулировать секрецию инсулина Р-клетками поджелудочной железы крыс с такой же скоростью, как и глюкоза, но независимо от концентрации последней; [44]. Повышение секреции инсулина отмечено и при введении метиловых эфиров ЯК животным с экспериментальным диабетом. Эффективно как парентеральное, так и пероральное введение препаратов. В доклинических исследованиях эффективности производного янтарной кислоты - фенсукцинала было выявлено наличие антиоксидантной активности, стимулирующего действия на регенерацию панкреатических Р-клеток и их защита от цитотоксической и аутоиммунной агрессии, протек-тивного эффекта в отношении диабетических микроангиопатий у животных с абсолютной и относительной инсулиновой недостаточностью и превентивное влияние на развитие инсулинорезистентности [32]. Показана причинно-следственная связь между стимулирующим действием сукцината на синтез и на секрецию инсулина (3-клетками. Такой механизм исключает истощение секреции, как, например, при неумеренном применении стимуляторов экзоцитоза — сульфаниламидов.
Влияние на течение стрептозотоцинового диабета
Эксперименты выполнены на 710 крысах-самцах линии Wistar, массой 180-220 г и 30 мышах линии СВА, массой 20-24 г, выращенных в питомнике РАН «Рапполово».
Карантин проводили в течение 14 дней. Животные содержались в условиях вивария Института токсикологии на стандартном рационе и при свободном доступе к воде. Условия содержания животных и проведения экспе-риментов соответствовали требованиям GLP (Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных, 1996). Эвтаназию осуществляли мгновенной декапитацией. Моделирование хронической инсулиновой недостаточности В эксперименте модель абсолютной инсулиновой недостаточности у мелких лабораторных животных достигается введением химических веществ, избирательно повреждающих Р-клетки поджелудочной железы. Аллоксановый диабет у крыс-самцов моделировали путем введения свежее приготовленного раствора аллоксана гидрата (Alloxan monohydrate, ICN, MP Biomedicals, USA; lot no: 9536F), в дозе 100 и 150 мг/кг, подкожно однократно после предварительного 18-24 ч. голодания. Стрептозотоциновыи диабет моделировали путем однократного внут-рибрюшинного введения стрептозотоцина в дозе 45 и 50 мг/кг после 18-24 часового голодания животных. Перед введением стрептозотоцин (ICN, MP Biomedicals, USA; lot no: 2126F) растворяли в 0ДМ растворе цитратного буфера (рН 1,5). Наличие сформировавшегося экспериментального сахарного диабета подтверждали с помощью оценки уровня глюкозы и длительности гиперг-ликемического периода. В исследовании были использованы следующие субстанции или лекарственные препараты: «Цитофлавин», производства ООО НТФФ «Полисан», - субстанция комплексного препарата, в состав которого входят на одну таблетку: янтарная кислота - 300 мг, никотинамид - 25 мг, рибоксин (инозин) - 50 мг, рибофлавин мононуклеотид — 5 мг. Препарат «Цитофлавин» является комплексным цитопротектором, антиоксидантом, состоит из естественных метаболитов организма и витаминов, содержит янтарную кислоту, инозин, никотинамид, рибофлаина мононуклеотид натрия. Препарат оказывает антигипоксическое и антиоксидант-ное действие, положительно влияет на процессы энергообразования в клеї-ке, уменьшает продукцию свободных радикалов и восстанавливает активность ферментов антиоксидантной защиты [44, 48, 80, 81]. Липоевая (тиоктовая) кислота, производства эспарма ГмбХ / esparma GmbH (Osterweddingen, Germany). Метформин, производства Польфа-Кутно А/О (Польша). Манинил, производства Berlin-chemie AG (Menarini Group, Germany). Дозы препаратов были определены с учетом коэффициента переноса доз животных с человека на грызунов. Цитофлавин вводили в дозе, равной 100 мг/кг [48]. Препарат сравнения липоевая (тиоктовая) кислота (эспарма ГмбХ / esparma GmbH, Osterweddingen, Germany) вводили в дозе 20 мг/кг; метформин (Польфа-Кутно А/О, Польша) вводили в дозе 100 мг/кг и манинил (Berlin-chemie AG, Menarini Group, Germany) в дозе 0,4 мг/кг. Все исследуемые препараты вводили внутрижелудочно с помощью атравматического металлического зонда в виде крахмальной,, или водной взвеси, начиная со следующего дня после введения диабетогена, в течение 14 дней. Определение уровня инсулина в сыворотке проводили с помощью иммуноферментного набора (Rat Insulin ELISA, DRG, Германия) на имму-ноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С (С-Петербург, Россия). Условия хранения материала соблюдались согласно рекомендациям используемого набора. Для учета объема выпитой и выделенной жидкости суточную мочу собирали, поместив животных на 1 сутки в индивидуальные обменные клет ки «Texnoplast» (Италия), при этом доступ к воде и пище не был ограничен. Кровь для биохимических исследований получали пункцией хвостовой ве ны. ,; Уровень глюкозы определяли глюкозооксидазным фотометрическим методом [91]. Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) определяли унифицированным методом Севела-Товарека. Общий белок определяли биуретовым методом [91], холестерин — фенольным энзиматическим методом [85]. Триглицериды определяли энзиматическим методом по конечной точке [179]. Содержание креатинина определяли по реакции Яффе псевдокинетическим методом [110, 185], концентрацию мочевины уреазным фс-нолгипохлоритным методом [85].
В исследованиях использовали унифицированные методы лабораторной диагностики, приборы и стандартные наборы реактивов фирмы «Ми-цар», «Ольвекс Диагностикум» (Санкт-Петербург).
Анализ мочи проводили с помощью тест-полосок Penta Phan Чешской фирмы «Lachema», удельный вес мочи определяли с помощью рефрактометра ИРФ-22.
Состояние системы ПОЛ оценивали по концентрации малонового ди-альдегида (МДА) по методу Uchiyama М. в модификации Глушкова СИ. [86, 182]. О состоянии АОЗ судили по активности каталазы в эритроцитах, ГР, ГП, Г-б-ФДГазы, СОД, ВГ и SH-групп. Содержание ВГ определяли по методу Ellman G. (1959) в модификации Глушкова СИ. (1998), уровень SH-групп определяли по реакции с реактивом Эллмана [104,123], каталазы - по методу Королюка М.А. (1988). Определение активности СОД проводили в крови, по методике, описанной Дубининой Е.Е. и соавт. (1983) в основе которой лежит определение степени ингибирования восстановления тетразо-лия нитрасинего в присутствии НАДН и феназинметасульфата [38,117]. Ак-тивость ГП определяли по методу Гавриловой А.Р. [27], ГР — методом Carlberg I. и Mannervik В. [114,152], Г-6-ФДГазы - по методу Kornberg A. et al (1955) [139].
Изучение состояния суммационной способности ЦНС и нервно-мышечной системы: ЭМГ и вызванные потенциалы (ВП) мозга - способы измерения электрических импульсов нервной системы для оценки ее функции. ЭМГ (игольчатая) - используется для диагностики невропатий. ВП - как проводится импульс от чувствительных рецепторов конечностей по структурам ЦНС, т.е. в пределах спинного и головного мозга. Оценка функции ЦНС, например, при сосудистых заболеваниях головного и спинного мозга.
Известно, что одним из наиболее распространенных методов исследования безусловно-рефлекторной деятельности ЦНС является метод определения суммации пороговых показателей импульсов (СПП). В то же время данный метод позволяет судить и о степени выраженности нервно-мышечной дистрофии. Для определения СПП задние лапы крыс помещают на электроды, на которые подают переменный ток увеличивающегося напряжения до отдергивания животными лапы. Данное напряжение регистрируется как величина СПП [84].
Для определения спонтанной и вызванной электромиографии, характеризующей состояние периферической нервной системы, крыс помещали в клетки-пеналы и с помощью тонких игольчатых электродов фиксировали электрическую активность икроножных мышц в течение 2-х минут. После этого определяли мышечную реакцию на дозированное механическое раздражение хвоста - силу сдавления увеличивали до голосовой реакции. Механическое раздражение проводили только до появления голосовой реакции.
Состояние иммунитета, уровень апоптоза, противовоспалительная активность
Исследования, результаты которых описаны в главе 3, продемонстрировали наличие дозовой зависимости в действии диабетогенов аллоксана и стрептозоцина как в отношении летальности, так и интегральных показателей, характерных для клинического течения Сд.
Необходимость проведения исследований, посвященных изучению дозозависимых эффектов диабетогенов в отношении не только уровня гликемии, но и остальных показателей, характеризующих основные звенья патогенеза развития осложнений СД, была обусловлена рядом причин. Одной из них та, что компенсаторные и репаративные механизмы, срабатывающие в дебюте заболевания и ограничивающие степень деструктивных изменений в организме, при хроническом воздействии или при молниеносном тяжелом течении заболевания становятся неэффективными [35].
У выживших животных, получивших максимальные дозы диабетоге-нов, наблюдалось прогрессирующее снижение массы тела, гиподинамия, неопрятность, пилоэрекция, кровоточивость десен, шатание и выпадение зубов. Выраженность гипергликемическои реакции, при этом, также носила дозозависимый характер. По данным иммуноферментного анализа у животных имело место падение уровня инсулина, коррелировавшее с содержанием уровня глюкозы. Наряду с гипергликемией у животных развивалась ги-перлипидемия, которая проявлялась увеличением содержания холестерина, липопротеинов холестерина низкой плотности (ХЛ ЛПНП), триглицеридоь, снижением содержания липопротеинов холестерина высокой плотности (ЛПВП). У животных наблюдалось повышение активности фермента АлАТ, что соответствовало развитию цитолитического синдрома. В ткани поджелудочной железы животных происходила массивная гибель (3-клеток с деструкцией островков Лангерганса. Степень грануляции, при этом, соответствовала объемному количеству имеющегося инсулина. Тяжелая степень экспериментального СД сопровождалась усилением процессов ПОЛ и снижением активности АОЗ организма. Подобные изменения являются манифестационными признаками де-компенсированного СД и в клинике [8]. Как следует из данных, полученных при исследованиях на больных [9, 34, 72], не только показатели углеводного обмена, ни и липидный профиль, показатели ПОЛ, скорость проведения импульса по нервному волокну и ряд других показателей при компенсированном и декомпенсированном СД достоверно различаются.
Полученные нами данные свидетельствовали о глубоких нарушениях гомеостаза, развивающихся при экспериментальном СД. Это проявлялось нарушением инсулинопродуцирующей функции Р-клеток, что вело к патологическим изменениям углеводного и липидного обменов и сопровождалось усилением ПОЛ и угнетением ферментативного звена АОЗ. Негативные изменения со стороны системы ПОЛ-АОЗ, в свою очередь, являются основой (предпосылкой) для развития сосудистых и неврологических осложнений СД (ретинопатии, нефропатии, ишемической болезни сердца и мозга, атеросклероза сосудов нижних конечностей, диабетической стопы).
Таким образом, на основании результатов, полученных с использованием методических подходов различного уровня, были выбраны дозы диа-бетогенов, вызывающие развитие декомпенсированного СД, с целью изучения антидиабетической активности препарата «Цитофлавин» в сравнении с эталонным препаратом «а-липоевая кислота» и стандартными антидиабетическими препаратами.
В клинической практике показано, что с помощью инсулина и стандартных антидиабетических препаратов возможно несколько снизить уровень жирных кислот в крови и подавить их митохондриальное окисление, активизируя гликолиз и окислительное фосфорилирование глюкозы [30, 42, 60, 61]. Однако, в значительном количестве случаев, применение стандартной антидиабетической терапии не позволяет добиться полной компенсации состояния углеводного обмена, при этом сохраняются выраженные нарушения липидного обмена.
Синдром хронической гипергликемии обуславливает и повышение скорости аутооксиления глюкозы с последующим увеличением свободных радикалов и развитием окислительного стресса, играющим существенную роль в развитии многочисленных осложнений СД [8, 36, 72]. Стандартная антидиабетическая терапия, и в этом случае, далеко не эффективна; достижение компенсации углеводного обмена является необходимым, но недостаточным условием эффективной профилактики и терапии осложнений СД [6, 9,13, 67, 68, 77].
В главе № 4 рассмотрены результаты изучения влияния препарата «Цитофлавин» в сравнении с эталоном - ос-липоевой кислотой, препараты которой обладают доказанной клинической эффективностью [3] и включены в Российский федеральный стандарт терапии диабетических нейропатий [35], и стандартными антидиабетическими препаратами - метформин и ма-нинил - на показатели углеводного и липидного обменов, а также состояние системы ПОЛ-АОЗ в условиях экспериментального декомпенсированного аллоксанового и стрептозотоцинового СД.
Анализ полученных данных показал, что стандартные противодиабе-тические препараты более эффективно предотвращали гибель животных и нормализовали уровень глюкозы крови, чем цитофлавин и липоевая кислота. В то же время препараты антиоксидантного типа действия в. гораздо большей степени, чем стандартные антидиабетические препараты, обладали гиполипидемическим действием: значительно снижали уровень общих ли-пидов, триглицеридов, липопротеидов НП и повышали содержание липо-протеидов ВП. Эффективность цитофлавина, при этом, превосходила эффективность эталонного препарата. Аналогичные данные по влиянию препарата
