Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Основные сведения о патогенезе гипоксии 14
1.1.1. Гипоксия - типовой патологический процесс 14
1.1.2. Патогенез вторичной тканевой гипоксии 15
1.2. Основы теории свободно-радикальной патологии 19
1.2.1. Роль кислорода в жизни клеток и тканей 19
1.2.2. Активные формы кислорода 20
1.2.3. Источники активных форм кислорода в физиологических условиях 22
1.2.4. Свободнорадикальное окисление биомолекул 24
1.2.5. Образование активных форм кислорода при гипоксии 25
1.2.6. Антиоксидантная система защиты организма 27
1.2.7. Антиоксидантные препараты 33
1.3. Роль лизосомального фермента катепсина D в норме и при патологии 36
1.3.1. Лизосомы - внутриклеточные органеллы 36
1.3.2. Катепсин D и его роль в жизни клеток 36
1.4. Основы фармакологии экдистероидов 40
1.4.1. Краткие сведения об экдистероидах 40
1.4.2. Механизм действия экдистероидов 41
1.4.3. Основные эффекты экдистероидов на организм млекопитающих 45
1.4.4. Влияние экдистероидов на процессы свободнорадикального окисления и состояние лизосомальных мембран 47
Глава 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Введение 49
2.2. Схема эксперимента 49
2.3. Моделирование острой гипоксической гипоксии 52
2.4. Исследование морфологических изменений при тотальной ишемии миокарда 53
2.5. Модельные системы для изучения антиоксидантной активности in vitro 54
2.6. Биохимические методы исследования 58
2.7. Методы статистического анализа полученных результатов 65
Глава 3. Результаты исследования 67
3.1. Влияние фитоэкдистерона на резистентность крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии 67
3.2. Влияние фитоэкдистерона на морфологические изменения в миокарде при тотальной ишемии 71
3.3. Исследование прямой антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vitro 77
3.3.1. Влияние фитоэкдистерона на аутоокисление кверцетина и адреналина in vitro 77
3.3.2. Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое аскорбат-зависимое ПОЛ 80
3.3.3. Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое ПОЛ 83
3.4. Исследование антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vivo 86
3.4.1. Влияние фитоэкдистерона на концентрацию МДА в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 86
3.4.2. Влияние фитоэкдистерона на уровень безбелковых SH-групп в мозге, миокарде и печени крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 87
3.4.3. Влияние фитоэкдистерона на уровень белковых SH-групп в мозге, миокарде и печени крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 89
3.4.4. Влияние фитоэкдистерона на общую емкость антиокси-дантной системы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 91
3.4.5. Влияние фитоэкдистерона на активность супероксид-дисмутазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 98
3.4.6. Влияние фитоэкдистерона на активность каталазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 100
3.4.7. Влияние фитоэкдистерона на активность глутатион-S-трансферазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 102
3.4.8. Влияние фитоэкдистерона на активность глутатион-редуктазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 103
3.4.9. Влияние фитоэкдистерона на активность глутатион-пероксидазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 105
3.5. Влияние фитоэкдистерона на общую активность катепсина D в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести 107
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 109
Выводы 119
Практические рекомендации 121
Список литературы 122
- Антиоксидантная система защиты организма
- Биохимические методы исследования
- Влияние фитоэкдистерона на морфологические изменения в миокарде при тотальной ишемии
- Влияние фитоэкдистерона на общую емкость антиокси-дантной системы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести
Введение к работе
Актуальность исследования
Экдистероиды – это липофильные полигидроксилированные стероиды, участвующие в жизнедеятельности большинства живых организмов. Они обнаружены во всех главных типах высших растений: папоротникообразных, голосеменных и покрытосеменных (фитоэкдистероиды); грибах (микоэкдистероиды); организме насекомых, ракообразных, нематод (зооэкдистероиды) (Volodin V.V. et al., 2002; Lafont R.J. et al., 2003).
Являясь у насекомых гормонами линьки, у млекопитающих экдистероиды выполняют регуляторные функции и оказывают разнообразные биологические эффекты (Сыров В.Н., 1994; Lafont R.J. et al., 2003). Выделяют следующие основные виды действия: анаболическое (Сыров В.Н. и соавт., 2012; Raskin I.A., 2009), актопротекторное (Dinan L.N, 2009), иммуномодулирующее (Dinan L.N., 2009), антигипергликемическое ( L.L. et al., 2011; Dinan L.N., 2009;), нейропротекторное (Luo C.W. et al., 2011), кардиопротекторное ( L.L. et al., 2011) и ряд других.
Установлено, что свое действие в организме насекомых экдистероиды реализуют через специфические рецепторы, являющиеся членами ядерного суперсемейства рецепторов (Henrich V.C., 2012). Их структура сходна со структурой других рецепторов стероидных гормонов (глюкокортикостероидов, половых гормонов, витамина D3 и ретиноидов) (Evans R.M., 1988).
В организме млекопитающих экдистероидные рецепторы до сих пор не найдены, и механизмы реализации их эффектов окончательно не установлены (Lafont R.J. et al., 2003). Предполагается, что они могут встраиваться в липидный мембранный бислой, изменяя структуры окружающих белков (Tuganova A.V., 1996), регулировать функционирование системы вторичных посредников (Lafont R.J. et al., 2003; Raskin I.A., 2009) и модулировать активность рецепторов (Tsujiyama S.W. et al., 1995).
Гипоксия – типовой патологический процесс, лежащий в основе патогенеза большинства заболеваний (Черешнев В.А. и соавт., 2009; Semenza G.L., 2011). Тяжесть течения и исход многих из них в конечном итоге определяются особенностями вторичных неспецифических метаболических расстройств, степенью дестабилизации клеточных мембран, а также возможностями реактивации структурных и ферментных белков в условиях гипоксии (Чеснокова Н.П. и соавт., 2006). Поэтому в лекарственную терапию разнообразных заболеваний, сопровождающихся развитием гипоксии, входят антигипоксанты – вещества, повышающие адаптацию и резистентность организма к недостатку кислорода. Влияние экдистероидов на устойчивость организма к гипоксической гипоксии в доступной научной литературе нами обнаружено не было.
В то же время, исследования, проведенные в 60–80-х гг. ХХ века показали, что в патогенезе наиболее распространенных заболеваний человека (патология сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной систем, злокачественные новообразования и др.) важную роль играют активные формы кислорода (АФК) (Semenza G.L., 2011). Последние являются инициаторами реакций свободно-радикального окисления, которые, в свою очередь, вызывают окислительную модификацию липидов, белков, нуклеиновых кислот, что, в ходе развития патологического процесса, может приводить к гибели клетки по апоптотическому или некротическому механизмам (Губский Ю.И. и соавт., 2008). Кроме того, было обосновано представление об общебиологической роли АФК, определенное количество которых образуется нейрохимическими и биоэнергетическими системами клетки в нормальных условиях, играя существенную роль в различных сторонах ее жизнедеятельности (Беленичев И.Ф. и соавт., 2004).
В последнее время активно изучается состояние лизосом и активность лизосомальных гидролаз при различных патогенных воздействиях (Пупышев А.Б., 2011). Это связано с тем, что была установлена важная роль лизосомальных ферментов в развитии не только некроза, но и апоптоза, опухолевого метастазирования и клеточной дифференцировки (Sheikh A.M. et al., 2010).
Таким образом, выявление у экдистероидов способности повышать резистентность организма к гипоксии, воздействовать на развитие свободно-радикальных реакций и снижать активность лизосомальных протеиназ может лежать в основе их биологической и фармакологической активности, а также последующего клинического применения.
Цель исследования
Изучить антигипоксическое и антиишемическое действие фитоэкдистерона, его влияние на развитие свободно-радикальных реакций и активность катепсина D в опытах in vitro и in vivo.
Задачи исследования
-
Изучить влияние фитоэкдистерона на резистентность беспородных белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.
-
Исследовать действие фитоэкдистерона на морфологические изменения миокарда животных в условиях его острой тотальной ишемии.
-
Оценить прямую антиоксидантную активность фитоэкдистерона in vitro в сравнительном аспекте.
-
Изучить влияние фитоэкдистерона на выраженность окислительного стресса и состояние антиоксидантной системы при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.
-
Исследовать воздействие фитоэкдистерона на общую активность катепсина D при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.
-
Сравнить антигипоксическое, антиишемическое и антиоксидантное действие фитоэкдистерона и милдроната и их влияние на активность катепсина D.
Научная новизна
В работе впервые:
установлена антигипоксическая активность фитоэкдистерона на модели тяжелой острой гипоксической гипоксии;
выявлено антиишемическое и кардиопротекторное действие фитоэкдистерона при тотальной ишемии миокарда;
установлена способность фитоэкдистерона ингибировать аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов и стимулировать, в высоких концентрациях, генерацию супероксидного анион-радикала in vitro;
выявлено, что применение фитоэкдистерона у крыс приводит к органоспецифическому снижению выраженности окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести;
установлена способность фитоэкдистерона снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D в головном мозге и миокарде крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.
Практическая значимость работы
Антигипоксическое, антиишемическое, антиоксидантное действие фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), и его способность снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D по выраженности сопоставимы с эффектами милдроната.
В работе продемонстрирована относительная безопасность изученного вещества по его влиянию на биохимические показатели, характеризующие состояние оксидантной и антиоксидантной систем головного мозга, миокарда и печени интактных белых крыс.
Полученные результаты позволяют рекомендовать фитоэкдистерон для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также клинической практике в целях комплексной терапии гипоксических состояний и патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса и активацией лизосомальных протеиназ.
Положения, выносимые на защиту
Курсовое пероральное ежедневное введение фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии и повышает устойчивость кардиомиоцитов к тотальной ишемии.
Фитоэкдистерон в опытах in vitro дозозависимо ингибирует железоиндуцируемое аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс.
Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней до воздействия гипоксической гипоксии средней тяжести приводит к снижению выраженности органных проявлений окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени крыс и уменьшению общей активности катепсина D в головном мозге и миокарде.
По антигипоксическому, антиишемическому, антиоксидантному действию и по влиянию на общую активность катепсина D фитоэкдистерон сопоставим с препаратом метаболического действия – милдронатом.
Личное участие автора
Автором самостоятельно подготовлен аналитический обзор литературы по изучаемой проблеме (100%), составлена программа исследования (80%), проведены эксперименты in vitro и in vivo (100%), биохимические и морфологические исследования (80%), обработка и интерпретация данных (90%), подготовка публикаций по диссертационной работе (75%). В целом его личный вклад в исследование превышает 85%.
Апробация работы
Результаты исследования доложены на II Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2007» (Санкт-Петербург, 2007); XV Межрегиональной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009); IV Международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2010); XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); Итоговой научной конференции студентов и молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, 2011); XI Всероссийской выставке Научно-технического творчества молодежи (Москва, 2011); IV Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2011» (Санкт-Петербург, 2011); XVIII Межрегиональной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2012); IV Съезде фармакологов России (Казань, 2012). Работа удостоена гранта «УМНИК 2011». По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Внедрение результатов в практику
Основные положения работы используются в учебном процессе при обучении студентов, клинических интернов и ординаторов на кафедре фармакологии с курсом фармации и фармакотерапии ФДПО, патофизиологии, фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 147 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1), материалы и методы исследования (глава 2), результаты исследования (глава 3), обсуждение полученных результатов (глава 4), выводы и практическая значимость.
Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 22 таблицами. Список литературы включает 115 источников отечественной и 137 – зарубежной литературы. Работ, опубликованных за последние 5 лет, более 25%.
Антиоксидантная система защиты организма
В физиологических условиях процессы ПОЛ протекают сбалансировано, благодаря многокомпонентной антиоксидантной системе, обеспечивающей модификацию свободных радикалов и перекисных соединений [39, 51, 62, 98, 199].
Система антиоксидантной защиты организма, в ее современном представлении, состоит из двух основных звеньев: ферментативного и неферментативного (низкомолекулярного) [98]. Неферментативное звено представлено водо- и жирорастворимыми веществами экзогенного и эндогенного происхождения [57].
Согласно В.З. Панкину (2001), в клетке можно выделить три основных линии защиты от свободных радикалов [62].
Первая линия защиты клеточно-тканееых структур организма предусматривает возможность детоксикации опасных АФК (d" и Н2О2) с участием супероксиддисмутазы и каталазы (или глутатионпероксидазы), что позволяет предотвратить образование НО" при протекании реакций Фентона и Хабера-Вайса.
Супероксиддисмутаза (супероксид супероксид оксидоредуктаза, СОД, КФ 1.15.1.1.) — семейство ферментов, осуществляющих дисмутацию супероксидных анион-радикалов [18, 178, 185, 252].
В зависимости от иона металла, в активном центре фермента различают несколько изоферментов СОД: Cu,Zn - содержащая интрацеллюлярная СОД (СОД-1), Cu,Zn - содержащая экстрацеллюлярная СОД (СОД-3) и Мп-содержащая митохондриальная СОД(СОД-2) [18,100].
Считается, что основным регулятором активности СОД в клетке является уровень 02 \ который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего фактора. Причем, индукция СОД связана с усилением синтеза фермента в клетке de novo [98, 236].
Образующийся в результате реакции (1) пероксид водорода — более сильный окислитель, чем 02"", к тому же, дающий начало образованию чрезвычайно активного ОН -радикала. В условиях дефицита каталазы и глутатионпероксидазы высокая активность СОД может служить причиной развития деструктивных процессов [86].
Вместе с тем, СОД, удаляя 02 исключает его взаимодействие с NO, тем самым предотвращая образование пероксинитрита - гораздо более опасного прооксиданта и окислителя, чем пероксид водорода. Кроме того, удаление Ог необходимо для защиты от окисления внутриклеточного глутатиона, который в восстановленном состоянии выступает эффективной ловушкой свободных радикалов [86, 98, 163, 188].
Каталаза (КФ 1.11.1.6) - фермент, катализирующий двухэлектронное восстановление пероксида водорода до воды [98, 138, 228, 244, 247]: 2Н202 - 2Н20 + 02 (13).
Каталазная активность клетки локализована, в основном, в пероксисомах. Частично каталаза локализуется в микросомах и, в меньшей мере, в цитозоле. Полагают, что каталаза не имеет высокого сродства к Н2О2 и не может эффективно обезвреживать это соединение при низких концентрациях, имеющихся в цитозоле. В пероксисомах, где концентрация Н2О2 высока, каталаза, напротив, активно ее разрушает [98]. Каталаза относится к ферментам, которые наиболее длительно сохраняют высокую активность, а скорость реакции разложения пероксида лимитируется лишь скоростью диффузии субстрата к активному центру фермента [221,244].
Если, несмотря на функционирование СОД и каталазы, происходит образование НО , и он индуцирует окисление липидов, образующиеся липидные радикалы нейтрализуются второй линией защиты клеточно-тканевых структур организма, основную роль в которой играет витамин Е (альфа-токоферол). В результате взаимодействия с данным природным фенольным антиоксидантом образуются липогидропероксиды (LOOH), потенциальная опасность которых для клетки состоит в том, что эти соединения крайне нестойки и могут разлагаться с образованием вторичных алкоксильных радикалов (LO ), инициирующих зарождение новых цепных реакций [62, 98].
Препятствием накоплению вторичных радикалов служит третья линия защиты клеточно-тканевых структур организма, представленная, прежде всего, глутатион-зависимыми ферментами — глутатионпероксидазами и глутатион-8-трансферазами. Также к ней относят ферменты, обеспечивающие регенерацию глутатиона.
Глутатионпероксидазы (глутатион: перекисъ-водорода-оксидо-редуктаза, G-per, КФ 1.11.1.9) - группа ферментов, инактивирующая пероксид водорода и органические гидроперекиси, в том числе, гидроперекиси высших жирных кислот, как свободных, так и в составе фосфолипидов биомембран [39, 58, 62, 164, 165]. G-per катализирует реакцию восстановления пероксида водорода до воды и органических гидроперекисей до спиртов, с использованием глутатиона (GSH), который в ходе реакции переходит в окисленную форму (GSSG) [164, 212]:
2 GSH + Н202 - GSSG + 2 Н20 (14),
2 GSH + ROOH - GSSG + GOH +H20 (15).
G-per обладает в 1000 раз большим сродством к пероксиду водорода, чем каталаза. В этой связи, G-per рассматривают в качестве антиоксидантного фермента, имеющего первостепенное значение в защите клетки от постоянно образующегося пероксида водорода [98,165].
По структуре выделяют Se-содержащие G-per и бесселеновую G-per. В свою очередь, в семействе Se-содержащих G-per выделяют четыре типа ферментов. Три из них являются ферментами, молекулы которых состоят из четырех субъединиц - «классическая G-per-І», найденная в цитозоле и митохондриях большинства клеток млекопитающих, особая G-per-Gl выделена из цитозоля клеток печени и кишечника человека, а также G-per плазмы крови [58, 62, 122, 164]. Кроме того, в ряде тканей животных и человека обнаружена еще одна форма Se-содержащей G-per, молекула которой состоит из одной субъединицы [216].
Селеновые G-per регулируют биосинтез эйкозаноидов, контролируют содержание органических гидроперекисей, и, опосредованно, - активность циклооксигеназы и липооксигеназы, участвуя в патогенезе воспалительного ответа [187]. G-per принадлежит активная роль в защите лизосомальных мембран от перекисного окисления [124].
G-per, не содержащая селен, катализирует восстановление гидроперекисей органических соединений, в том числе, и полиненасыщенных жирных кислот. Однако, ее эффективность в отношении Н2О2 чрезвычайно низка. Существует мнение, что не содержащая селена G-рег идентична ферментам семейства глутатион-8-трансфераз, которые в большей степени связаны с детоксикацией продуктов ПОЛ, генерируемых в эндоплазматическом ретикулуме при метаболизме ксенобиотиков. Бесселеновая G-per локализована в митохондриальных мембранах печени, почек, сердца [58, 173].
Активность G-per регулируется доступностью восстановленного глутатиона, количество которого зависит от активности глутатионредуктазы, содержания НАДФН2 и работы пентозофосфатного цикла [98, 164].
Глутатионредуктаза (НАДФНг-окисленный глутатион оксидоредуктаза, G-red, КФ 1.6.4.2) — фермент, осуществляющий регенерацию GSH из GSSG через НАДФН2-зависимое восстановление [33, 193,218]: GSSG + НАДФН2 + ІҐ - 2GSH + НАДФ+ (16).
Биологическое значение G-red заключается в возможности обеспечения клеток восстановленной формой глутатиона без повышения его синтеза [98, 188]. G-red обладает высокой субстратной специфичностью по отношению к глутатиону, однако, также может катализировать и восстановление ряда других соединений, имеющих дисульфидную связь. Скорость образования GSH в реакции, катализируемой G-red, зависит от уровня НАДФН2 в клетке. Содержание последнего определяется активностью пентозофосфатного пути, а также активностью некоторых ферментов, обеспечивающих альтернативное продуцирование НАДФН2 (например, НАДФ-изоцитратдегидрогеназы) [98, 188]. В настоящее время описаны два изофермента G-red - цитозольная и митохондриальная формы, кодирующиеся одним геном [100].
Глутатион-Б-трансфераза (глутатион-Я-трансфераза, Gr, КФ 2.5.1.18) - семейство ферментов, играющих важную роль в детоксикации электрофильных алкилирующих агентов. Ферменты, обладающие глутатионтрансферазной активностью, широко распространены в природе и принадлежат к трем основным семействам. Два из них, цитозольные и митохондриальные Gr, относятся к водорастворимым белкам, a Gr третьего семейства, локализованы в микросомах и являются липофильными. В настоящее время липофильные Gr носят название «мембранные» белки метаболизма эйкозаноидов и глутатиона (MAPEG, membraneassociated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism) [45, 171].
У млекопитающих Gr представлены преимущественно цитозольным семейством. В печени человека оно составляет 2-4% цитозольного белка [45]. Цитозольное семейство Gr включает 3 группы изоферментов - М, Р и Т, имеющих разную органную локализацию [100]. Так, Gr Ml экспрессируется в высокой концентрации в печени, тогда как другие изоферменты группы М и группы Р определяются преимущественно во внепеченочных тканях [100, 170, 184].
Биохимические методы исследования
Для оценки выраженности патологических изменений при ОГТ средней тяжести и оценки эффективности применения фитоэкдистерона проведено исследование свободнорадикального статуса и активности катепсина D в мозге, сердце и печени лабораторных животных. Измерение экстинкции выполняли на биохимическом анализаторе Humalaizer 2000 и спектрофотометре Shimadzu UV-150-02.
2.6.1. Подготовка биологического материала для оценки свободнорадикального статуса
Сразу после забора материала навески тканей (головной мозг, печень, сердце) взвешивали на аналитических электронных весах OHAUS Adventurer (с точностью до 1 мг). Затем гомогенизировали при t +2 С в 0,05 М изотоническом фосфатном буфере с рН 7,4 на холоде, с использованием роторного высокоскоростного гомогенизатора DIAX 900 (насадка 6G), со скоростью 24000 об/мин в течение 60 сек. Гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин 10 минут (t+2C). Часть полученного супернатанта замораживали, другую часть подвергали биохимическим исследованиям в день забора материала. Замороженные пробы до момента определения активности ферментов хранили в вертикальной морозильной камере SANYO Ultra LOW MDF-192 при -29 С не более трех недель.
2.6.2. Определение концентрации малонового диальдегида (по R. Hoss в модификации Н.Д. Стальной и Т.Г. Горишвили, 1987)
Принцип метода: метод основан на способности некоторых конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в кислой среде реагировать с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК), с эквимолярным образованием окрашенного комплекса, который имеет максимум поглощения при 532 нм [20, 104]. Традиционно считается, что этой реакцией определяется содержание малонового диальдегида (МДА), хотя, по данным ряда исследователей, с ТБК реагирует не только непосредственный предшественник МДА - эндопероксид, но и некоторые другие продукты ПОЛ [46]. Во избежание разночтений, в дальнейшем мы будем говорить об определении количества МДА, так как данное допущение существенно сути полученных результатов не меняет. Определение концентрации МДА характеризует активность ПОЛ в исследуемой ткани.
Ход исследования. После подготовки биологического материала в пробе производили осаждение белков 30% раствором трихлоруксусной кислоты. Осадок отделяли центрифугированием при 800 g в течение 15 минут. Надосадок использовали для проведения количественного анализа. Реакционная смесь содержала 1,0 мл супернатанта и 2,0 мл 0,5% водного раствора ТБК. Смесь инкубировали при 98 С на водяной бане в течение 15 минут, остужали до комнатной температуры и определяли оптическую плотность на спектрофотометре Shimadzu UV-150-02 при длине волны 532 нм.
Концентрацию МДА рассчитывали с использованием коэффициента молярной экстинкции 1,56-105 см -М 1. Полученные результаты выражали в нмоль/мг белка.
2.6.3. Определение емкости антиоксидантной системы исследуемых тканей (по A.L. Tappel, 1959)
Принцип метода: суммарную емкость антиоксидантной системы (АОС) оценивали по динамике накопления МДА в гомогенате тканей в течение 20 минут инкубации при 37С со свободным доступом кислорода и интервалом определения МДА 5 минут. Так как в гомогенате присутствуют только эндогенные антиоксидантные системы исследуемой ткани, то чем быстрее и стремительнее будет накапливаться МДА, тем ниже, антиоксидантная емкость изучаемой ткани [78, 120, 145].
Ход исследования. Готовили реакционную смесь (в достаточном для опыта количестве), содержащую гомогенат и изотонический фосфатный буфер рН 7,4, в соотношении 1:3, после чего помещали ее на водяную баню при t 37,0 С. Каждые 5 минут из этой смеси отбирали пробу и определяли в ней количество МДА. Длительность опыта - 20 минут.
2.6.4. Определение сульфгидрильных (тиоловых) групп в гомогенате тканей (Habeeb, 1972)
Принцип метода: метод основан на способности тиоловых групп восстанавливать дисульфид 5,5-дитиобис(2-нитробензоат) (ДТНБ), растворённый в абсолютном этаноле (реагент Эллмана - G.Z. Ellman, 1959) с образованием эквивалентного количества окрашенных жёлтых анионов 2-нитро-5-тиобензоата. Реакция проходит при рН = 7,4 и комнатной температуре (22С - 25С). Количество аниона определяется по приросту поглощения раствора на спектрофотометре Shimadzu UV-150-02 при длине волны 412 нм [149].
Ход исследования. Реакционная смесь для определения содержания общих тиоловых групп в образце содержала фосфатный буфер рН 7,4; 0,3% раствор додецил-сульфата натрия; 0, 2 М раствор этилендиаминтетраацетата (ЭДТА). Наличие детергента додецил -сульфата натрия в реакционной смеси необходимо для разрушения третичной и четвертичной структуры белков, с целью обнажения скрытых внутрибелковых тиоловых групп. После 20 -минутного периода деградации белка в реакционную смесь добавляли 0,05 мл реактиав Эллмана (5.9 мМ ДТНБ в абсолютном этаноле) и через 10 минут регистрировали спектр поглощения. Для определения в образце небелковых SH-групп, осаждали белок абсолютным этанолом, центрифугированием при 800 g. К 1 мл надосадка прибавляли 0,2 М раствор ЭДТА и 0,04 мл реактива Эллмана. Спектрофотометрировали реакционную смесь через 10 минут после добавления раствора ДТНБ. Расчет содержания сульфгидрильных групп в образцах проводили, с учетом коэффициента молярной экстинкции 0,0136 см -нмоль"1. Полученные результаты выражали в мкмоль/мг белка.
2.6.5. Определение активности глутатионпероксидазы (D.E. Paglia, W.N. Valentine W.N. в модификации В.З. Панкина, 1976)
Принцип метода: кинетическое спектрофотометрическое определение активности фермента глутатионпероксидазы основано на регистрации уменьшения оптической плотности опытного образца при 340 нм (лампа D3), t - 37С в результате протекания следующих реакций:
НАДФН2 служит донором редуцирующих эквивалентов для реакции ферментативного восстановления глутатиона, который окисляется в реакции ферментативного восстановления гидроперекиси третбутила (гидроперекись третбутила (ГПТБ) - специфический субстрат для действия Se-зависимой глутатионпероксидазы). Чем выше активность глутатионпероксидазы, тем интенсивнее будет окисляться НАДФНг, что отразится на интенсивности поглощения света с длиной волны 340 нм (она уменьшится) [60,211].
Ход исследования. 1,9 мл реакционной смеси содержал: 1,2 мл — 0,05 М изотонического фосфатного буфера, рН 7,4; 0,1 мл - 1 мМ ЭДТА; 0,1 мл -0,12 мМ НАДФН; 0,2 мл - 1,85 мМ раствора восстановленного глутатиона; 0,5 ЕД глутатионредуктазы; 0,2 мл — 0,2 мМ гидроперекиси трет-бутила и 0,1 мл изучаемого образца. Реакцию начинали добавлением ГПТБ. Реакционную смесь инкубировали при температуре 37 С, в течение 3-х минут. Оптическую плотность регистрировали на биохимическом анализаторе Humalaizer 2000 при длине волны 340 нм. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для окисления 1 мкМ восстановленного глутатиона в минуту, в условиях определения. Результаты активности выражали в нмоль НАДФН2/минх мг белка.
2.6.6. Определение активности глутатион-Б-трансферазы (J.N. Keen, W.B. Iakoby, 1978)
Принцип метода: кинетическое спектрофотометрическое определение активности фермента глутатион-8-трансферазы основано на регистрации увеличения оптической плотности опытного образца при 340 нм, в результате реакции конъюгации глутатиона и 1-хлор-2,4-динитробензола (ХДНБ)[182].
Ход исследования. 1,9 мл реакционной смеси содержал 1,5 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4; 0,2 мл 1 мМ восстановленного глутатиона; 0,06 мл 1 мМ 1-хлор-2,4-динитробензола; 0,2 мл 1мМ ЭДТА и 0,1 мл гомогената. Гидрофобный субстрат (ХДНБ) растворяли в 96% этаноле с таким расчётом, чтобы конечная концентрация этанола в инкубационной среде не превышала 3%. Кинетику образования конъюгатов глутатиона измеряли спектрофотометрически, по определению оптической плотности при длине волны 340 нм на биохимическом анализаторе Humalaizer 2000, при температуре 25С.
За единицу активности глутатион-8-трансферазы принимали количество фермента, необходимое для конъюгирования 1 мкМ глутатиона за 1 минуту. Активность выражали в нмоль ХДНБ/минх мг белка.
Влияние фитоэкдистерона на морфологические изменения в миокарде при тотальной ишемии
Влияние профилактического применения фитоэкдистерона и милдроната на морфологические изменения в миокарде изучены на модели его тотальной ишемии.
В серии контроля ишемии сразу после забоя фуксинофильный субстрат в кардиомиоцитах интактных крыс наблюдался редко, его удельная площадь составила 0,25+0,019 мм /мм (табл. 3, рис. 4). В полях зрения микроскопа обнаруживались единичные, диффузно расположенные кардиомиоциты с явлениями слабовыраженной фуксинофилии изотропных и анизотропных дисков. Через 15 минут удельная площадь поражения увеличилась на 96,0% и достигла 0,49±0,027 мм /мм (рис. 5).
Характер фуксинофилии (миокардиострофии) был различен. В некоторых кардиомиоцитах этот субстрат занимал отдельные сегменты, четко отграниченные вставочными дисками. Часто наблюдались клетки, лишенные поперечной исчерченности, «заполненные» однородной, гомогенной фуксинофильной массой. 30-минутная экспозиция острой тотальной ишемии сердечной мышцы обусловила более выраженную фуксинофилию - удельная площадь поражения возросла на 144,0% и достигла 0,61 ±0,031 мм /мм (рис. 6). В очагах дистрофии кардиомиоциты были набухшие, лишены поперечной исчерченности, с явлениями кариопикноза и кариолизиса, с утолщенными вставочными дисками. Часто наблюдалась фрагментация дисков и вакуолизация цитоплазмы.
Сразу после забоя у крыс, профилактически получавших фитоэкдистерон (рис. 7) и милдронат, гистологическая картина миокарда (рис. 10) не отличалась от группы контроля ишемии, что подтверждала величина удельной площади фуксинофильного субстрата, равная, соответственно, 0,27±0,025 мм2/мм2 и 0,23±0,021 мм2/мм2. 15-минутная экспозиция миокарда на фоне профилактического применения фитоэкдистерона (рис. 8) приводила к снижению удельной площади поражения на 36,7% (р 0,05), а на фоне введения милдроната (рис. 11) - на 14,3% (р 0,05).
Слабовыраженный фуксинофильный субстрат локализовался в отдельных сегментах диффузно расположенных мышечных клеток по ходу изотропных, анизотропых, а также вставочных дисков. У животных, профилактически получавших милдронат, в миокарде встречались клетки, лишенные поперечной исчерченности.
Через 30 минут ишемии, на фоне предварительного назначения фитоэкдистерона (рис. 9), удельная площадь фуксинофильного субстрата уменьшилась на 42,6% (р 0,05) по сравнению с данными контроля ишемии, а на фоне применения милдроната (рис. 12) - лишь на 23,0% (р 0,05).
Морфологические изменения сводились к локальному отсутствию поперечной и продольной исчерченности у отдельных, диффузно расположенных кардиомиоцитов. В единичных клетках наблюдалась фрагментация на уровне вставочных дисков, некоторые клетки были набухшими. Значительно реже встречались небольшие очажки некроза ткани.
Следует отметить, что на 15-ой минуте ишемии при профилактическом введении фитоэкдистерона обнаруживалась достоверно меньшая площадь фуксинофильного субстрата по сравнению с серией применения милдроната (р 0,05).
Таким образом, фитоэкдистерон обладает выраженными антиишемическим и кардиопротекторным эффектами, превосходящими на ранних сроках ишемии действие средства метаболической коррекции -милдроната.
Влияние фитоэкдистерона на общую емкость антиокси-дантной системы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести
Исходный уровень МДА в мозге интактных крыс составил 13,32±1,05 нмоль/мг ткани (табл. 11, 12). Инкубирование гомогената мозга при свободном доступе кислорода сопровождалось постепенным повышением содержания МДА, которое достигало своего максимума к 20-ой минуте, превышая начальное значение на 191,1% (р 0,05). Максимальный прирост концентрации МДА (на 8,3±0,71 нмоль/мг белка) наблюдался на 10-ой минуте опыта, что свидетельствует о наибольшем истощении естественной антиоксидантной системы защиты в указанное время инкубации.
Введение фитоэкдистерона в течение 7 дней интактным животным незначительно снижало базальный уровень МДА на 5,1% (р 0,05) по сравнению с исходными показателями. Инкубирование гомогената мозга также приводило к повышению содержания МДА к 20-ой минуте опыта на 191,1% (р 0,05). Но максимальный прирост концентрации конечного продукта ПОЛ, в отличие от интактных животных, происходил на 15-ой минуте инкубации (на 7,56±0,57 нмоль/мг ткани), что свидетельствует о том, что фитоэкдистерон увеличивал общую емкость антиоксидантной системы.
ОГТ средней тяжести приводила как к повышению базального уровня МДА в мозге на 28,1% (р 0,05), так и к повышению содержания МДА через 5 минут инкубации на 39,6% (р 0,05) по сравнению с показателем у интактных животных. При дальнейшей инкубации концентрация МДА продолжала возрастать, превышая к 20-ой минуте исходный уровень на 160,3% (р 0,05), но в промежуточные сроки эксперимента достоверно от показателей интактных крыс не отличалась. Максимальный прирост содержания МДА (на 10,99 нмоль/мг белка) происходил уже на 5-ой минуте инкубации.
Профилактическое применение фитоэкдистерона, перед подъемом крыс на высоту 8000 м, достоверно не уменьшило исходный уровень МДА в мозге по сравнению с показателями контроля гипоксии, однако 5-минутная инкубация приводила к его снижению на 16,6% (р 0,05). Дальнейшая инкубация проб при свободном доступе кислорода вызывала увеличение содержания МДА к 20-ой минуте опыта на 191,5% (р 0,05) по сравнению с базальным уровнем. Следует отметить, что пика прироста концентрации МДА не наблюдалось: уровень конечного продукта перекисного окисления липидов возрастал равномерно в течение 15 минут инкубации, каждые 5 минут в среднем на 8,15 нмоль/мг белка.
В отличие от фитоэкдистерона, милдронат, назначаемый профилактически перед воздействием ОГТ, на всем протяжении инкубации достоверно не снижал содержание МДА по сравнению с уровнем контроля гипоксии. Концентрация МДА к 20-ой минуте опыта увеличилась на 154,3% (р 0,05) по сравнению с исходным значением. Ярко выраженного пика прироста концентрации МДА в течение эксперимента также не наблюдалось, она равномерно повышалась в течение 15 минут инкубации, с небольшим максимумом на 15-ой минуте опыта (прирост МДА составил 9,05 нмоль/мг белка).
Таким образом, фитоэкдистерон, назначаемый профилактически перед ОГТ, увеличивает общую емкость антиоксидантной системы мозга и по данному эффекту превосходит препарат сравнения милдронат.
Базальное содержание МДА в миокарде интактных крыс составило 2,50±0,15 нмоль/мг белка (табл. 13, 14). К 20 минуте инкубации уровень МДА увеличился на 368,8% (р 0,05). Максимальный прирост концентрации МДА (на 3,49± 0,24 нмоль/мг белка) происходил на 15-ой минуте опыта.
Введение фитоэкдистерона в течение 7 дней интактным крысам на протяжении всего срока эксперимента достоверно не влияло на уровень МДА по сравнению с показателями интактных крыс. К 20-ой минуте инкубации содержание МДА увеличилось на 319,6% (р 0,05). Пик накопления МДА был зафиксирован на 15-ой минуте и составил 3,25±0,31нмоль/мг.
Моделирование ОГГ приводило в миокарде к повышению как базального содержания МДА на 35,2% (р 0,05), так и его концентрации в течение 5 и 10 минут инкубации на 33,2% (р 0,05) и 33,6% (р 0,05) соответственно, в сравнении с данными у интактных животных. К 20-ой минуте опыта уровень МДА увеличился на 217,2% (р 0,05) по сравнению с базальным уровнем. Максимальный прирост концентрации МДА происходил на 10-15-ой минутах опыта.
Профилактическое применение фитоэкдистерона перед моделированием ОГГ достоверно не влияло на базальный уровень МДА в миокарде, однако приводило к снижению содержания МДА в сравнении с контролем гипоксии на 19,0% (р 0,05) и на 26,3% (р 0,05) на 10-ой и 15-ой минутах инкубации соответственно. За весь период инкубации уровень МДА увеличился на 290,5% (р 0,05). Максимальный прирост содержания МДА (на 3,53+0,21 нмоль/мг белка) происходил на 20-ой минуте опыта.
В отличие от фитоэкдистерона, профилактическое применение милдроната перед воздействием ОГГ снижало уровень МДА в миокарде на 34,6% (р 0,05), 26,9% (р 0,05), 42,5% (р 0,05) и на 39,0% (р 0,05) по сравнению с показателями крыс контрольной серии через 0, 5, 10 и 15 минут инкубации соответственно.
К 20-ой минуте инкубации содержание конечного продукта ПОЛ увеличилось на 364,3% (р 0,05) по отношению к его начальному уровню. Максимальный прирост концентрации МДА отмечался на 20-ой минуте опыта.
Таким образом, фитоэкдистерон, назначаемый профилактически перед воздействием ОГГ, увеличивает емкость антиоксидантной системы миокарда, однако значительно слабее, чем милдронат.
Исходный уровень МДА в печени интактных крыс составил 2,83±0,18 нмоль/мг белка (табл. 15, 16). Инкубирование проб в течение 20 минут при свободном доступе кислорода приводило к повышению концентрации МДА на 341,0% (р 0,05). Максимальный прирост концентрации МДА отмечался на 15-20-ой минутах, в среднем - на 3,03 нмоль/мг белка.
Введение фитоэкдистерона интактным крысам в течение 7 дней приводило к достоверному снижению только базального уровня конечного продукта ПОЛ на 28,6% (р 0,05). При дальнейшем инкубировании гомогената печени крыс, получавших фитоэкдистерон, не обнаружено достоверного понижения содержания МДА по сравнению с данными у интактных крыс. К 20-ой минуте опыта уровень МДА увеличился на 467,8% (р 0,05) по отношению к начальному значению. Наибольшее накопление МДА происходило на 20-ой минуте инкубации.
После моделирования ОГТ подъемом животных на высоту 8000 м, в печени происходило повышение содержания МДА на 36,7% (р 0,05), 34,9% (р 0,05) и 27,3% (р 0,05) через 0, 5 и 10 минут инкубации соответственно, по сравнению с показателями контроля. В конце эксперимента, через 20 минут инкубации, уровень МДА увеличился на 201,0% (р 0,05) по сравнению с исходным уровнем. Максимальный прирост МДА происходил на 5-ой (на 2,4±0,17 нмоль/мг белка) и 15-ой (на 2,06±0,13 нмоль/мг белка) минутах опыта.
Профилактическое введение фитоэкдистерона курсом 7 дней перед воздействием ОГГ приводило к снижению содержания МДА на 20,4% (р 0,05) и на 17,1% (р 0,05) через 0 и 5 минут инкубации по сравнению со значениями данного показателя у крыс серии контроля гипоксии. К 20-ой минуте опыта уровень МДА увеличился на 269,2% (р 0,05) по сравнению с базальным уровнем. Наибольший прирост концентрации МДА происходил на 5-ой и 10-ой минутах эксперимента.
В отличие от фитоэкдистерона, превентивное введение милдроната в течение 7 дней перед гипоксическим воздействием не уменьшало содержания МДА в печени крыс в течение всего периода инкубации. К концу опыта уровень МДА увеличился на 251,8% (р 0,05) по сравнению с исходным уровнем. Максимальный прирост концентрации МДА происходил на 5-ой минуте инкубации.
Таким образом, применяемый профилактически перед воздействием ОГТ фитоэкдистерон превосходит препарат сравнения милдронат по способности увеличивать емкость антиоксидантной системы в печени.
