Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Антитела к системе hla и их клиническое значение (обзор литературы) 11
Глава 2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Общая характеристика обследованных больных 29
2.2. Клинико – лабораторные исследования 33
2.2.1. Метод комплементзависимой цитотоксичности в ыявлении антител к HLA 34
2.2.2. Метод определения антител к HLA, с помощью качественного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) 37
2.2.3. Скрининг антител к HLA I , II классов и MICA на платформе Luminex (x-MAP-технология) 38
2.2.4. Метод выявления донор-специфических антител к HLA донора (ДСА) с помощью прямой перекрёстной пробы - реакции кросс-матч, выполненной на платформе Luminex у реципиентов до и после трансплантации почки 41
2.2.5. Метод выявления донор-специфических антител к HLA донора с помощью реакции кросс-матч, используя метод комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) у реципиентов до трансплантации почки 43
2.2.6. Метод идентификации антител к HLA донора (виртуальный кросс-матч) на платформе Luminex 43
2.3. Статистическая обработка результатов 44
Глава 3. Сравнительный анализ эффективности методов при выявлении антител к системе HLA .
3.1. Сравнительный анализ методов комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) и мультиплексного анализа на платформе Luminex в выявлении предсуществующих антител к HLA 46
3.2. Сравнительный анализ методов иммуноферментного анализа (ИФА) и мультиплексного анализа на платформе Luminex в выявлении предсуществующих антител к 50 HLA .
3.3. Сравнительный анализ методов КЗЦ и мультиплексного анализа на платформе Luminex для проведения перекрестной пробы (кросс-матч реакции) 54
Глава 4. Влияние антител к hla на течение посттрансплантационного периода у реципиентов после трансплантации почки 57
4.1. Выявляемость предсуществующих антител к HLA у реципиентов из «листа ожидания» 57
4.2. Влияние антител к HLA на течение посттрансплантационного периода 61
4.3. Мониторинг антител к HLA в посттрансплантационном периоде 66
Глава 5. Образование de novo антител к системе hla и их значение в реакции отторжения при трансплантации почки 72
5.1. Способы выявления антител к HLA в
посттрансплантационном периоде 72
5.1.1 Скрининг антител к HLA в посттрансплантационном периоде
5.1.2 Идентификация выявленных антител 74
5.1.3 Разработка метода для выявления донор-специфических антител к HLA с использованием лимфоцитов селезёнки донора 76
5.2. Влияние выявленных de novo образованных антител к HLA на развитие ранней дисфункции трансплантата в посттрансплантационном периоде 81
Заключение 85
Выводы 97
Практические рекомендации 98
Список литературы
- Метод комплементзависимой цитотоксичности в ыявлении антител к HLA
- Метод выявления донор-специфических антител к HLA донора с помощью реакции кросс-матч, используя метод комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) у реципиентов до трансплантации почки
- Сравнительный анализ методов иммуноферментного анализа (ИФА) и мультиплексного анализа на платформе Luminex в выявлении предсуществующих антител к 50 HLA
- Скрининг антител к HLA в посттрансплантационном периоде
Метод комплементзависимой цитотоксичности в ыявлении антител к HLA
Предсуществующие антитела (анти-HLA-антитела) - это иммуноглобулины класса G, образование которых связано с предсуществующей сенсибилизацией несовместимыми HLA-антигенами в результате гемотрансфузий, прошлых трансплантаций, беременностей [1, 6, 11, 26, 29, 39, 52, 68]. Иммуноглобулины класса М встречаются весьма редко. У некоторых реципиентов присутствуют разнообразные аутоантитела, как следствие их основного заболевания. Выявляемые антитела обычно описываются термином «предсуществующие антитела» с тем, чтобы подчеркнуть, что эти антитела присутствуют у реципиента ещё до пересадки. По данным отечественных авторов более половины пациентов, ожидающих повторной пересадки почки, одновременно сенсибилизированы против антигенов HLA класса I и класса II [1, 7, 9, 13, 82, 117]. Выявление неспецифической цитотоксичности (т. е. цитотоксичности не к лимфоцитам донора, а к набору лимфоцитов от разных лиц) не является прямым противопоказанием к пересадке. Даже высокий уровень анти-HLA антител не является абсолютным противопоказанием к пересадке почки, хотя результаты таких трансплантаций хуже, чем у несенсибилизированных пациентов: выживаемость трансплантатов ниже, частота отторжений выше. Кроме того, само по себе долгое ожидание трансплантации ухудшает ее результат [4, 6, 21, 24, 27, 41, 45, 70, 91].
Высокий процент положительных проб (более 25%) свидетельствует о массивной сенсибилизации потенциального реципиента. В данном случае следуют общеизвестному правилу: реципиенту с широким спектром предсуществующих антител необходимо подыскать такого донора, к лимфоцитам которого у данного реципиента не выявлялись бы специфические предсуществующие антитела[10, 11, 13, 31, 32, 35, 47, 62]. В научной литературе уделяется большое внимание пациентам, сенсибилизированным к HLA. У пациентов с повышенным титром антител к главному комплексу гистосовместимости наблюдается отсроченная функция трансплантата и замедленное восстановление азотовыделительной функции [7, 44, 46, 48, 72, 76, 77, 84, 93, 94, 95, 97, 122]. Отмечается, что такие пациенты требуют более тщательного подбора донорских органов, а также применения активных методов десенсибилизации на этапах подготовки к операции и в раннем послеоперационном периоде [7, 43, 51, 57, 59, 67, 68, 86]. По данным авторов, у 30% реципиентов из « Листа ожидания» определяются HLA-антитела [1, 9, 12, 31, 69, 72, 82, 117]. В последние годы в зарубежной литературе стали появляться сообщения о роли антител к MICA в развитии нарушений функции почечного аллотрансплантата. Гены MIC [7, 22, 25, 46, 48, 54, 67, 110, 111, 114] (MHC class I-related chain A and B) были открыты в 1994 году. Они располагаются в области HLA-B генов I класса на 6 хромосоме. На настоящий момент открыто 7 локусов. Наиболее исследованы MICA и MICB гены, кодирующие гликопротеиды. Известно более 60 аллельных вариантов MICA и 25 – MICB. Белки, кодируемые генами MICA и MICB обеспечивают костимуляцию естественных киллеров и Т-лимфоцитов. Эндотелиальные клетки, экспрессирующие на своей поверхности MICA, могут стать мишенью для развития как гуморального, так и клеточного иммунного ответа при отторжении трансплантата. Экспрессия MICA и MICB обнаружена в биоптатах трансплантированной почки в случае острого или хронического отторжения [7, 40, 54, 68, 73]. Зарубежные авторы предполагают, что в связи с высокой полиморфностью MICA и MICB и их экспрессией на эндотелиальных клетках, они могут быть мишенью для антител, индуцирующих отторжение. Пациенты с HLA и MICA антителами требуют более тщательного подбора донорских органов. Также с целью улучшения результатов трансплантации почки целесообразно проведение десенсибилизирующей терапии с применением плазмафереза [7, 19, 65, 86]. В большинстве центров трансплантологии практикуется уменьшение титра антител к HLA при помощи плазмафереза и иммуносорбции. Эффективность указанных методик подтверждалась результатами ретроспективных и проспективных исследований [19, 29, 51, 60, 61, 65, 69, 70]. Есть мнения о целесообразности внутривенного применения иммуноглобулинов [29, 51, 61, 65, 69], способных подавлять выработку антител к HLA.
Пациенты, сенсибилизированные до пересадки почки, имели достоверно более низкую выживаемость трансплантатов. Особенно ярко этот феномен проявляется у пациентов, которые перенесли повторную трансплантацию [6, 12, 20, 22, 43, 45, 50, 55, 67, 74, 90, 98]. Если у реципиента есть предсуществующие антитела к HLA, способные специфически связываться с антигенами донора, после восстановления кровотока в трансплантате очень быстро, в течение минут или несколько часов развивается сверхострое отторжение трансплантата, неизбежно ведущее к утрате пересаженного органа [10, 16, 17, 31, 38, 39, 56, 66, 73, 85, 98. 99].
Таким образом, селекция пары донор-реципиент, кроме подбора по HLA-антигенам, предусматривает определение степени специфической и неспецифической пресенсибилизации реципиента к антигенам системы HLA донора. Поскольку в каждом из указанных случаев доза антигена и способ иммунизации различны, вырабатывающиеся антитела отличаются по титру, биохимической аффинности к соответствующему антигену, в ряде случаев - по изотипу, а также по специфичности и продолжительности персистенции в организме [10, 12, 30, 49, 52, 55, 112, 119].
Метод выявления донор-специфических антител к HLA донора с помощью реакции кросс-матч, используя метод комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) у реципиентов до трансплантации почки
Таким образом, при обследовании 20 пациентов выявлены предсуществующие антитела к HLA серологическим методом у 6 реципиентов, мультиплексным у 10. У 4 реципиентов средняя интенсивность флуоресценции (MFI), которую определяли с помощью x-MAP-технологии, колебалась от 1100 у.е. до 14250 у.е., что соответствовало средней и высокой степени сенсибилизации к HLA, при этом серологический метод не выявил антител к HLA у этих пациентов. У 6 реципиентов предсуществующие антитела к HLA выявлялись, как серологическим методом, так и мультиплексным. Но только у 1 пациента значение MFI=4 367 и коэффициент серопозитивности (50%) одновременно свидетельствовали о высокой степени сенсибилизации к HLA. У остальных 5 реципиентов средняя и высокая степень сенсибилизации, выявленная мультиплексным методом (MFI от 1 913 до 16 672) не подтверждались серологическим методом, коэффициентом серопозитивности у них составлял от 5% до 20%, что соответствует низкой степени сенсибилизации. Таким образом, более информативным и чувствительным является мультиплексный анализ, по сравнению с КЗЦ. Серологическим методом антитела к HLA можно выявить только к I классу, а мультиплексным анализом, как к I, так и II классу HLA. Также в мультиплексном анализе рассчитывается средняя интенсивность флуоресценции (MFI), что можно использовать в дальнейшем мониторинге антител к HLA в разные сроки посттрансплантационного периода.
Сравнительный анализ методов иммуноферментного анализа (ИФА) и мультиплексного анализа на платформе Luminex в выявлении предсуществующих антител к HLА
Как видно из таблицы с помощью ИФА из 135 обследованных антитела к главному комплексу гистосовместимости выявлены у 29 (24,4%) реципиентов. При этом антитела к I классу HLA встречаются у 13 (9,6%) человек, к II классу - у 9 (6,6%), к I и II классам антител - у 7 (5,2%) пациентов.
Таким образом, с помощью ИФА были выявлены антитела к HLA, которые можно дифференцировать по классам. Однако нельзя судить о количестве антител к HLA, т.е. метод даёт возможность провести качественный анализ на наличие или отсутствие антител к HLA I и II классов. Методом мультиплексного анализа, на платформе Luminex было обследовано 325 реципиентов (таблица 10).
Результаты исследования оценивали по средней интенсивности флуоресценции (MFI), которую выражали в условных единицах (у.е.). Средняя интенсивность флуоресценции до 500 у.е. расценивалась, как отрицательный результат и такие показатели были у 220 пациентов. Как видно из таблицы 10 у 105 (32,3%) пациентов выявлены антитела к главному комплексу гистосовместимости. Из них у 40 (38,1%) к I классу, у 32 (30,4%) к II классу HLA, у 5 (4,7%) к MICA, у 16 (15,2%) к I и II классам, у 4 (3,8%) к I классу и MICA, у 8 (7,6%) к I, II и MICA.
В тоже время выявленные антитела к HLA имели разную среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) от 500 у.е. до 17 000 у.е. Это наглядно показано на рисунке 7.
Как показано на рис. 7 средняя интенсивность флуоресценции (MFI) в пределах от 500 у.е. до 1000 у.е. (низкая степень сенсибилизации) наблюдалась у 28 (8,6%) человек, MFI в пределах от 1000 у.е до 3000 у.е. (средняя степень сенсибилизации) была выявлена у 25 (7,7%) пациентов и MFI с значениями от 3000 у.е. и выше (высокая степень сенсибилизации) диагносцировалась у 52 (16%) реципиентов, у 220 (67,7%) реципиентов значения MFI были менее 500,0 у.е. и эти пациенты расценивались, как не сенсибилизированные к HLA.
Таким образом, несомненным достоинством этого метода является точность и чувствительность выявления антител к известным кросс-реактивным группам антигенов I и II классов системы HLA и к MICА. Так же метод позволяет косвенно оценить степень сенсибилизации к HLA по величинам MFI.
Антитела к главному комплексу гистосовместимости выявлены с помощью ИФА у 24,4% реципиентов, а с помощью мультиплексного анализа у 32,6 реципиентов. Разница выявления антител к HLA двумя этими методами составляет 8,2%. Возможно это те пациенты, у которых антитела к HLA имеют интенсивность флуоресценции (MFI) от 500.0 до 1000.0, что соответствует низкой степени сенсибилизации к HLA и входит в так называемую «серую зону».
Для анализа эффективности выявления предсуществующих антител к HLA, сравнивали результаты, полученные методами иммуноферментным по мультиплексным на платформе Luminex. Для этого параллельно обследовано 20 реципиентов (таблица 11). Из 20 пациентов с помощью ИФА антитела к HLA выявлены только у 7 человек, а мультиплексным анализом у тех же пациентов уже у 9. У 2 пациентов, у которых не были выявлены антитела HLA с помощью ИФА, мультиплексный анализ показал у одного пациента низкую степень сенсибилизации к HLA (MFI=856 у.е.), а у другого среднюю степень (MFI=1244 у.е.).
Таким образом, мультиплексный анализ оказался более чувствительным и точным методом по сравнению с ИФА. В отличие от ИФА, который является качественным анализом, в мультиплексном методе рассчитывается средняя интенсивность флуоресценции (MFI), что можно использовать в дальнейшем мониторинге антител к HLA в разные сроки посттрансплантационного периода.
Сравнительный анализ методов иммуноферментного анализа (ИФА) и мультиплексного анализа на платформе Luminex в выявлении предсуществующих антител к 50 HLA
Значительное влияние на качество лимфоцитов оказывает длительность нахождения клеток в условиях гипоксии. Обследованы образцы лимфоцитов селезенки от 5 доноров, хранившиеся в условиях гипоксии при +4оС до 72 часов. Методом проточной цитометрии определяли общее количество лимфоцитов и долю клеток включавших витальный краситель 7AAD. Каждый образец обследовали через 12, 24, 36, 48 и 72 часа хранения. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли с помощью витального ДНК-специфичного красителя 7AAD на проточном цитометре. Выявлено, что содержание жизнеспособных клеток через 12 и 24 часа хранения составило от 93 до 97%, через 36 часов варьировало от 89 до 94%, через 48 часов – от 85 до 92% и через 72 часа – от 76 до 82%. Таким образом, для получения качественного диагностикума на основе лимфоцитов селезенки человека, продолжительность этапов должна быть максимально короткой. Время от момента прекращения перфузии тканей донора до криоконсервирования клеток не должно превышать 48 часов.
II этап - криоконсервирование клеток Приготовление раствора криопротектора. В каждую пробирку для криоконсервирования вносили 180 мкл 99% DMSO, 250 мкл раствора Хенкса, 920 мкл фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Пробирки помещали в холодильник при +4оС.
Расчет необходимого числа пробирок для хранения. Рассчитывали количество образцов для криоконсервирования по формуле: Х=n 4+2 где Х – количество образцов для криоконсервирования, n – количество реципиентов, кому ранее были выполнены операции трансплантации органа/органов от данного донора.
Внесение лимфоцитов в среду для хранения. В охлажденные пробирки для криоконсервирования с подготовленным и охлажденным раствором криопротектора пипеткой вносили по 1,5 млн лимфоцитов в 450 мкл раствора Хенкса. Пробирки для криоконсервирования плотно закрывали крышками и перемешивали содержимое с помощью вихревого смешивателя типа Vortex. Затем пробирки помещали в холодовой штатив и в течение 5-7 минут переносили в программный замораживатель.
Помещение на хранение. Пробирки с клеточным материалом, подготовленные для криоконсервирования помещали в камеру программного замораживателя, предварительно охлажденную до +4оС. Криоконсервирование проводили по следующей программе:
Размораживание лимфоцитов донора. Для определения донор-специфических антител в посттрансплантационном периоде из хранилища доставали одну пробирку с лимфоцитами селезенки донора и помещали в водяную баню при температуре 37оС до полного исчезновения кристалликов льда. Затем пробирки с взвесью лимфоцитов центрифугировали 1000-1500 rpm в течение 5 минут, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали в 0,5 мл раствора Хенкса. После чего возможно тестирование сыворотки реципиента на наличие донор-специфических антител, которое может проводить тремя способами: серологическим (КЗЦ), цитометрическим методом или мультиплексным анализом на платформе Luminex.
III этап - контроль качества диагностикума
Из 38 образцов лимфоцитов селезёнки доноров органов (диагностикум) обследовано 7 после криохранения. Именно у 7 пациентов с помощью скрининга были выявлены АТ к HLA. Выявлено, что содержание Т-лимфоцитов (CD3+клетки) варьировало от 25,7% до 31,4%, концентрация В-лимфоцитов (CD19+клетки) – от 41,7% до 52,8%. Содержание жизнеспособных клеток, не включающих 7AAD, составляло 87,9-91,7%. Таким образом, предложенная методика получения и хранения лимфоцитов доноров органов позволила получить диагностикум удовлетворительного качества для определения донор-специфических антител к HLA в посттрансплантационном периоде.
В нашей лаборатории проводили анализ на выявление донор-специфических антител с помощью мультиплексного анализа на платформе Luminex. Проведение анализа с помощью серологического метода (КЗЦ) менее предпочтительно, т.к. этим методом можно выявить антитела только к HLA I-го класса. Результат показал, что из 7 реципиентов, у которых при скрининге выявлены антитела к HLA, у 5 пациентов обнаружены ДСА. Из них у 4-х реципиентов развился острый криз отторжения, подтверждённый морфологически.
Таким образом, все 7 пациентов, у которых выявлены ДСА разными методами, относятся к группе риска. Они требуют более тщательного наблюдения, возможно, проведения иммунокорекции, а также назначения процедур плазмафереза, т.к. выявленные донор-специфические антитела к HLA могут привести к дисфункции трансплантата, а также спровоцировать реакцию криза отторжения в разные сроки посттрансплантационного периода.
Скрининг антител к HLA в посттрансплантационном периоде
Несмотря на все достижения современной трансплантологии, проблема отторжения трансплантата до конца так и не решена. Чужеродная ткань, попадая в организм реципиента, обследуется клетками иммунной системы, и её поверхностные маркеры (антигены) проверяются на соответствие антигенами собственных клеток организма. Ключевую роль в развитии процесса отторжения аллогенного трансплантата играют генетические различия, обусловливающие биологическую несовместимость тканей донора и реципиента. Антигены, обеспечивающие внутривидовые различия особей, обозначаются как антигены тканевой совместимости (гистосовместимости). Эволюция закрепила единичный участок тесно сцепленных генов гистосовместимости, продукты которых на поверхности клеток обеспечивают сильный барьер при аллотрансплантации. Термины «major histocompatibility antigens» (главные антигены гистосовместимости) и «major histocompatibility gene complex» (MHC) (главный генный комплекс гистосовместимости) относятся соответственно к продуктам генов и генам этого хромосомного участка. У человека MHC назван HLA (human leukocyte antigen — человеческий антиген лейкоцитов) и с международного согласия HLA служит для обозначения человеческого комплекса гистосовместимости. Молекулы, кодируемые MHC-областью разделены на три класса: I, II и III [2, 3, 5, 13].
Молекулы I класса присутствуют на поверхности всех ядросодержащих клеток и тромбоцитов. Выделяют 6 генов, которые кодируют молекулы 1 класса HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F и HLA-G. Среди них HLA-A, HLA-B и HLA-C относят к так называемым "классическим", кодирующим традиционные трансплантационные антигены. Основное свойство молекул I класса -связывание пептидов (антигенов) и представление их в иммуногенной форме для Т-клеток [13, 14, 18, 52].
Молекулы II класса кодируются тремя или более генными локусами (DR, DP и DQ). Антигены II класса имеют ограниченное распространение в тканях и находятся преимущественно на B-клетках, макрофагах, обрабатывающих антиген, и активированных T-клетках; они участвуют в распознавании антигена T-клетками (хелперами; CD4). Между генами I и II классов находятся гены, кодирующие молекулы III класса (которые включают факторы комплемента 2, 4a и 4b) и цитокины TNFa и TNFb [2, 3, 13, 18].
При отторжении трансплантата играют роль и гуморальные, и клеточные механизмы. Клеточные механизмы отторжения вызывают T-лимфоциты, которые становятся сенсибилизированными к пересаженным антигенам. Эти лимфоциты вызывают повреждение клеток путем прямой цитотоксичности и путем секреции лимфокинов. Повреждение Т-клетками характеризуется некрозом паренхиматозных клеток, лимфоцитарной инфильтацией и фиброзом. Гуморальные механизмы опосредованы антителами, которые могут присутствовать в сыворотке реципиента перед трансплантацией или развиваться после пересадки чужеродной ткани. Гуморальные факторы повреждают пересаженную ткань путем реакций, которые эквивалентны реакциям гиперчувствительности II и III типов. Взаимодействие антител с антигеном на поверхности пересаженных клеток приводит к некрозу клеток, а накопление иммунных комплексов в кровеносных сосудах активирует комплемент, что приводит к развитию острого некротизирующего васкулита или хронического фиброза интимы с сужением сосудов. Антитела к антигенам HLA появляются после контакта клеток иммунной системы с этими антигенами. Пациенты, сенсибилизированные к HLA, т.е. имеющие предсуществующие антитела вследствие гемотрансфузий, трансплантаций, беременности, представляют одну из важнейших проблем трансплантологии [1,11, 13, 50
Традиционно проводят предоперационное определение предсуществующих антител против клеток предполагаемого донора посредством реакции комплемент зависимой цитотоксичности (cross-match реакция) [11, 13]. Реакцию проводят in vitro между лимфоцитами донора и сывороткой крови реципиента. Реакцию комплемент зависимой цитотоксичности также использовали для выявления сенсибилизации к HLA реципиентов при постановке в лист ожидания на трансплантацию органа [11].
Несмотря на признание важности гуморального иммунитета в процессе отторжения, долгое время роли антител во всем трансплантационном процессе уделялось недостаточное внимание. С внедрением в клиническую практику новых методов выявления сенсибилизации к HLA, основанных на твердой фазе, появились данные о роли антител к HLA в развитии реакции отторжения трансплантата. Отметим, что выявление антител донор-неспецифических (т.е. направленных не на лимфоциты конкретного донора), не является прямым противопоказанием к пересадке органа, но этот негативный фактор обязательно учитывается. Для этого требуется тщательное наблюдение за реципиентом после трансплантации.
Для выявления сенсибилизации у пациентов к HLA мы использовали три метода: традиционный серологический метод, основанный на комплемент зависимой цитотоксичности, и два метода основанные на твердой фазе: иммуноферментный анализ и мультиплексный анализ на платформе Luminex.
Для оценки эффективности определения предсуществующих антител к HLA, сравнивали результаты серологического метода с мультиплексным анализом на платформе Luminex. При обследовании 20 пациентов предсуществующие антитела к HLA обнаружены серологическим методом у 6 реципиентов, мультиплексным – у 10. У 4 реципиентов средняя интенсивность флуоресценции (MFI), которую определяли с помощью x-MAP-технологии, варьировала от 1 100 у.е. до 14 250 у.е., что соответствовало средней и высокой степени сенсибилизации, при этом серологическим методом антитела к HLA не выявлены. У 6 реципиентов предсуществующие антитела к HLA определялись, как серологическим методом, так и мультиплексным. Но только у 1 пациента значение MFI (4 367 у.е.) и коэффициент серопозитивности (50%) одновременно свидетельствовали о высокой степени сенсибилизации.
![Диагностика острой реакции отторжения почечного трансплантата на фоне отсутствия начальной функции [Электронный ресурс]](/i/i/4309/209762.png "Диагностика острой реакции отторжения почечного трансплантата на фоне отсутствия начальной функции [Электронный ресурс] Арзуманов Сергей Викторович")
