Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Буркин Максим Алексеевич

Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений
<
Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Буркин Максим Алексеевич. Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений: диссертация ... доктора биологических наук: 14.03.09 / Буркин Максим Алексеевич;[Место защиты: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН].- Москва, 2014.- 299 с.

Введение к работе

1. Актуальность проблемы

Огромное число низкомолекулярных физиологически активных соединений являются важными эндогенными субстанциями организма, используются в качестве лекарственных средств или же, напротив, токсичны и неблагоприятно влияют на здоровье человека, домашних и диких животных, растения и экосферу в целом и, в связи с этим являются предметом пристального внимания и изучения. Особое место среди этих соединений занимают антибиотики, которые служат терапевтическим средством в медицине и ветеринарии, используются для профилактики инфекционных заболеваний и стимуляции роста животных и растений, а также могут присутствовать в качестве контаминантов в продукции животноводства, воде, загрязнять почву, проникать в растения и использоваться как консерванты. Создавая определенный фон в окружающей среде, эти соединения оказывают влияние на экологию, способствуют селекции резистентных микроорганизмов, являются фактором, изменяющим иммунологическую реактивность населения, вызывают аллергические реакции. Рост антибиотикорезистентности среди патогенной микрофлоры вызывает серьезную обеспокоенность у клиницистов и требует создания новых активных препаратов, оптимизации и контроля за применением существующих лекарственных средств (Страчунский Л. и др. 2002; Волосовец А. и др., 2007; Heuer Н. et. al, 2011; Wright G. 2012; WHO, 2012).

Анализ, использующий антитела в качестве специфического детектора таких соединений, остается наиболее чувствительным, сравнительно недорогим и широко используется в медицинской диагностике, для проведения лекарственного и экологического мониторинга, контроля качества продуктов питания и ветеринарно-санитарного контроля, в научных исследованиях и смежных областях. Высокая чувствительность и возможность выявления определенного антибиотика среди других соединений с антибактериальной активностью выгодно отличают

иммунохимические методы анализа от рутинно используемых для этих целей микробиологических тестов. Однако, специфичность определения низкомолекулярных соединений с помощью иммунохимических методов анализа тесно связана с проблемой перекрестной активности структурных аналогов, которая влияет на правильность измерения основного аналита, затрудняет идентификацию и является причиной ложнопозитивных результатов. В тоже время этот «недостаток» активно используется при создании экономически оправданных скрининговых тестов с групповым распознаванием структурно родственных молекул (Loomans Е. et al., 2003; Pastor-Navarro N. et al, 2007; Wang Z. et al, 2007; Cao L. et al, 2009; Guo Y. et al., 2010; Jiang W. et al., 2013). Конструирование иммуноанализа со строго селективным определением единственного соединения или обладающего наиболее выраженной групповой специфичностью в отношении нескольких аналитов возможно при условии использования эпитоп-специфических антител. Однако, получение антител, способных выявлять различия между сходными соединениями или распознавать их общие черты, связано с рядом трудностей. Гибридомная технология, фаговый дисплей и аффинная хроматография позволяют реализовать такую задачу. Принцип селекции эпитоп-специфических антител основан на выделении искомого варианта из репертуара В-клеток, библиотек V-генов или сывороточных антител определенной специфичности. Однако, трудоемкая процедура многоэтапного скрининга сопровождается потерями потенциальных редких продуцентов или утратой активности антител в ходе их выделения.

В настоящем исследовании предложен новый подход селекции эпитоп-специфических антител из иммунных сывороток животных - за счет создания условий для избирательного взаимодействия антител определенной эпитопной направленности. Избирательность такого взаимодействия обеспечивалась уникальностью структуры антигена, несущего детерминанты гаптена, общие для группы соединений или индивидуальные. Созданию

таких антигенов и изучению их влияния на специфичность иммуноанализа антибактериальных соединений посвящено настоящее исследование.

Цель исследования - экспериментальное обоснование возможности управления эпитопной специфичностью иммуноанализа низкомолекулярных соединений посредством структурной модификации конъюгированных антигенов и использование этого подхода для группового и избирательного определения антибактериальных препаратов.

Задачи исследования:

  1. Создать панель реагентов для иммунохимической детекции антибиотиков различных фармакологических групп: синтезировать конъюгированные антигены на основе антибиотиков, получить специфичные к ним иммунные сыворотки и моноклональные антитела.

  2. Разработать на основе приготовленных иммунореагентов варианты иммуноанализа для группового/селективного определения антибиотиков и изучить их аналитические характеристики.

  3. Оценить вклад структуры иммуногена в спектр специфичности антител и влияние структурного дизайна иммобилизованного антигена на параметры специфичности анализа.

  4. Провести сравнительный анализ характеристик иммуноферментных тестов на основе моноклональных и поликлональных антител.

  5. Исследовать влияние матрикса вероятных объектов экспертизы на иммунохимическую реакцию, разработать процедуру пробоподготовки исследуемых объектов и адаптировать разработанные тесты для их анализа.

  6. Оценить содержание антибиотиков в вакцинных препаратах, биологических жидкостях организма при фармакокинетических исследованиях, а также в продуктах питания животного происхождения.

Научная новизна

Впервые предложен и экспериментально обоснован подход, позволяющий управлять эпитопной специфичностью иммуноанализа антибактериальных соединений на основе поликлональных антител посредством презентации ключевых эпитопов на конъюгированных антигенах.

Экспериментально доказано, что принцип предложенного подхода основан на избирательном связывании сывороточных антител с определенной эпитопной направленностью. Наличие в иммунной сыворотке антител различной специфичности подтверждено при разделении антисыворотки к рибостамицину на аффинных сорбентах с гетерологичными гаптенами апрамицином и неомицином. Установлено, что фракции антител, несвязанных с сорбентом, отличны от исходной антисыворотки по профилю перекрестной активности со структурными аналогами.

Показано, что дизайн иммобилизованного антигена влияет на характер специфичности иммуноанализа, позволяет настраивать его как на селективность в отношении основного аналита, так и на групповое распознавание ряда соединений. Выявлено, что на профиль перекрестно-реагирующих соединений оказывает влияние главным образом тип гаптена, входящего в структуру конъюгата, тогда как метод синтеза и сайт конъюгирования имеют второстепенное значение, а наличие и длина спейсера не являются значимыми факторами.

Впервые показано, что эквивалентная перекрестная активность структурных аналогов тилозина и тилмикозина позволяет проводить их совместное количественное определение.

Впервые синтезированы конъюгированные антигены гликопептидных антибиотиков эремомицина и ристомицина, макролида кларитромицина, соединений группы фторхинолонов гемифлоксацина и спарфлоксацина, к ним получены антитела и созданы иммуноферментные системы анализа этих соединений.

Предложены оригинальные способы синтеза конъюгированных антигенов на основе фторхинолонов (формальдегидная конденсация), тетрациклинов (взаимодействие с периодат-окисленным гликопротеином по амидной группировке), аминогликозидов (периодатное окисление рибостамицина, глутаральдегидная полимеризация неомицина) и амфениколов (конъюгирование глюкуронида левомицетина методом активированных эфиров). Продемонстрирована эффективность их использования.

Показано, что иммунореагенты на основе конъюгированных антигенов с множественной ориентацией гаптена, обеспечивают селективность анализа. Подтверждением являются разработанные иммуноанализы аминогликозидов гентамицина, канамицина, неомицина, апрамицина и стрептомицина.

Разработаны тесты группового иммуноферментного определения тетрациклинов (тетра-, хлортетра-, окси- и доксициклина с перекрестной активностью в диапазоне 100-25%), аминогликозидов (нео-, кана- и гентамицина, 100-9%), фторхинолонов (энро-, ципро-, геми-, пе-, нор, о-, ломе-, лево- и спарфлоксацина, 108-9%), макролидов (кларитро-, рокситро- и эритромицина, 150-100%, тилозина, тилмикозина, (100%), тилозина, спиромицина, 100-50%) линкозамидов (клиндамицина и линкомицина, 111-100%) и гликопептидов (ристо-, ванко-, эремомицина и тейкопланина, 100-37%) с показателями групповых характеристик, не уступающими и даже превосходящими описанные в литературе для аналогичных систем анализа.

Впервые созданный иммуноферментный анализ эремомицина позволил изучить фармакокинетические параметры этого нового гликопептидного антибиотика после его инфузионного введения здоровым добровольцам и установить корреляцию с данными высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Практическая значимость

Разработанный подход для регулирования специфичности иммуноанализа дает возможность более эффективно использовать потенциал иммунореагентов, позволяя на основе одного препарата антител создавать как селективные, так и групповые тесты.

Разработанные оригинальные схемы синтеза конъюгированных антигенов могут служить основанием для дальнейших работ по конструированию конъюгатов соответствующих гаптенов.

Разработаны методы иммуноферментного анализа антибиотиков 7 фармакологических групп - с групповым распознаванием фторхинолонов, тетрациклинов, линкозамидов, аминогликозидов, 14-членных макролидов, макролидов с 16-членным лактонным кольцом, гликопептидов подгрупп ванкомицина и ристомицина, а также селективным распознаванием гемифлоксацина, левомицетина, канамицина, гентамицина, неомицина, апрамицина, стрептомицина, тилозина, эремомицина, тейкопланина и ристомицина с чувствительностью на нанограмовом уровне.

Применение разработанных систем анализа позволило выявить в ряде образцов вирусных вакцинных препаратов против кори, краснухи и паротита гентамицин, неомицин и канамицин. Контроль сырья (птичьих эмбрионов, сред, сывороток), используемого для наработки вакцинного вируса, выявил в яйцах кур и перепелов присутствие антибиотиков 5 групп - левомицетина, тетрациклина, бацитрацина, фторхинолонов и неомицина.

Разработанный иммуноферментный анализ эремомицина может быть использован в лабораторных и клинических условиях для исследования фармакокинетики антибиотиков в биологических жидкостях организма.

Предложены схемы пробоподготовки и новые пути преодоления матрикс-эффекта продуктов животного происхождения, основанные на использовании имитаторов матрикса.

Моделирование температурного воздействия на аминогликозиды, левомицетин, линкомицин, тилозин при стерилизации и термической

обработке продуктов питания показало стабильность иммунохимической активности антибиотиков.

При скрининговом исследовании продуктов питания с помощью созданных иммунотестов получены данные о распространенности и степени контаминации продукции антибиотиками. Полученные сведения могут являться ориентиром при рассмотрении вопроса о нормировании нерегламентированных в РФ антибиотиков в продуктах питания и послужить стимулом для дальнейших направленных исследований этого вопроса.

Разработанные системы анализа пригодны для контроля содержания антибиотиков в вакцинных препаратах, для проведения лекарственного мониторинга, осуществления контроля за безопасностью продуктов питания, экологического мониторинга и в других областях, где необходимо чувствительное и специфичное определение антибиотиков, относящихся к группам фторхинолонов, тетрациклинов, амфениколов, линкозамидов, аминогликозидов, макролидов и гликопептидов.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Презентация ключевых эпитопов на иммобилизованных антигенах позволяет управлять эпитопной специфичностью анализа на основе поликлональных антител и конструировать тесты для селективного и группового выявления низкомолекулярных соединений.

  2. Получены иммунореагенты и разработаны методы иммуноферментного определения антибиотиков, представителей 7 фармакологических групп: фторхинолонов, тетрациклинов, линкозамидов, фениколов, аминогликозидов, макролидов и гликопептидов.

  3. Разработанные системы иммуноферментного анализа пригодны для измерения концентрации анализируемых соединений в иммунобиологических препаратах, биожидкостях организма человека и продуктах питания животного происхождения.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены на объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), Пятом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), XII Международном конгрессе MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии. (Москва, 2010), Международной конференции «Пчеловодство - 21 век. Пчеловодство, апитерапия и качество жизни» (Москва, 2010), XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Питание и здоровье» (Москва, 2010), Шестом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (Москва, 2011), XIV Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), III Съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии токсикологии и фармации» (Санкт-Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), Xlth International Conference on AgriFood Antibodies (ICAFA) (Vienna, Austria, 2012).

Апробация диссертации состоялась 31 октября 2013 года на заседании Ученого совета НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова.

Публикации результатов исследований.

По теме диссертационной работы опубликовано 28 печатных работ, в том числе 11 статей в российских журналах и 6 статей в зарубежных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 299 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 285 источников, из которых 42 - отечественных и 243 - зарубежных. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 60 рисунками.

Похожие диссертации на Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений