Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Понятие метаболического синдрома 13
1.2. Артериальная гипертензия как составляющая метаболического синдрома 15
1.3. Особенности реологических свойств крови у больных метаболическим синдромом 23
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1. Клинический материал 31
2.2. Лабораторные методы исследования 33
2.2.1. Реактивы и оборудование 33
2.2.2. Биохимические методы 34
2.2.3. Молекулярно-генетические методы 37
2.3. Методы статистической обработки данных 44
Глава 3. Результаты анализа объективного статуса и анамнестических данных 46
Глава 4. Лабораторные факторы риска атеросклероза у больных метаболическим синдромом 49
4.1. Исследование липидного профиля. 49
4.2 Исследование ультрачувствительного с-реактивного белка у больных метаболическим синдромом. 52
4.3. Изучение концентрации инсулина у пациентов с метаболическим синдромом 54
4.4. Определение уровня гомоцистенина в плазме крови у больных метаболическим синдромом 56
4.5. Анализ фибринообразования и фибринолиза у пациентов с метаболическим синдромом 58
Глава 5. Разработка методов определения однонуклеотидных полиморфизмов в исследуемых генах 62
5.1. Метод идентификации гена -фибриногена (fga) по полиморфному сайту thr312ala 62
5.2. Метод идентификации аллелей гена рецептора 1-го типа к ангиотензиногену ii (agtr1) по полиморфному сайту а1166с 66
Глава 6. Характеристика генетической структуры выборок больных метаболическим синдромом и практически здоровых людей 69
Глава 7. Анализ зависимости лабораторных показателей атеросклероза от генотипа ace (i/d), agtr1 (a1166c) и fga (t312a) 72
Глава 8. Обсуждение 77
Выводы 86
Практические рекомендации 87
Список литературы 88
- Артериальная гипертензия как составляющая метаболического синдрома
- Биохимические методы
- Исследование ультрачувствительного с-реактивного белка у больных метаболическим синдромом.
- Метод идентификации аллелей гена рецептора 1-го типа к ангиотензиногену ii (agtr1) по полиморфному сайту а1166с
Введение к работе
Актуальность темы. В последние десятилетия массовыми видами патологии стали гипертоническая болезнь, атеросклероз, сахарный диабет 2-го типа и ожирение, вошедшие в группу так называемых «болезней цивилизации». Существенно, что этот комплекс заболеваний обнаруживает взаимосвязь и часто возникает у одного и того же больного. В связи с этим было предположено существование единой этиологии, обуславливающей все вышеуказанные виды патологии. Этот комплекс взаимоотягощающих друг друга заболеваний был объединен под названием метаболический синдром (МС) (Адашева Т.В., Демичева О.Ю., 2003; Чазова И.Е., Мычка В.Б., 2003; Rett K., 2006).
Анализ литературных данных показывает, что, несмотря на очевидные успехи в изучении МС, до сих пор существуют значительные разногласия во взглядах на возможные причины и механизмы формирования этого феномена. Изначально понятие МС объединяло комплекс заболеваний с единой этиологией, связанных с инсулинорезистентностью – и объяснялось двумя гипотезами. По одной из них первопричиной возникновения невосприимчивости к инсулину могли быть индивидуальные особенности углеводного обмена, по другой - топографические и метаболические особенности висцеральной жировой ткани (Алмазов В.А. и соавт., 1999; Аметов А.С. и соавт., 2001) В последнее время МС рассматривают, как мультифакторное заболевание с множественной этиологией. Считается, что в развитии МС могут принимать участие такие факторы, как воспаление, нарушение деятельности эндокринной и кровеносной систем и др. (Белоконь Н.А., Кубергер М.Б., 1987; Барскова В.Г., Насонова В.А., 2003; Бутрова С.А., Дзгоева Ф.Х., 2004). Кроме того, предполагается, что большинство компонентов синдрома генетически детерминированы, хотя генов, ответственных за возникновение данного симптомокомплекса, пока не выявлено (Бутрова С.А., 2001).
Нарушения системы гемостаза часто встречаются при МС, что делает диагностику патологий подобного рода чрезвычайно актуальной. Одним из ключевых событий гемостаза является фибринообразование – конечный этап всего каскада свертывания крови. Не менее важным является и процесс лизиса фибрина (фибринолиз) под действием плазмина, который обеспечивает восстановление проходимости сосуда и локализацию процессов свертывания. Свойства фибринового сгустка, его молекулярная архитектура является одним из важнейших факторов, определяющих эффективность фибринолиза. Однако в литературе практически не встречается данных о концентрации плазминогена в крови и его функциональной активности. Трудности диагностики нарушений гемостаза обусловлены многочисленностью и многообразием его компонентов, а также их сложными взаимосвязями. На сегодняшний день не существует общепринятых методов, позволяющих оценить свойства фибринового сгустка и его доступность лизису плазмином. Так же неоднозначна роль генетических полиморфизмов в гене фибриногена А-цепи (FGA), ассоциированных с особенностями молекулярной организации сгустка (Горбунова В.Н., Баранов В.С., 1997; Бувальцев В.И., 2001; Глотов О.С. и сооавт., 2003).
Наряду с повышением коагулирующего потенциала крови при МС наблюдается увеличение артериального давления. Установлено, что ключевую роль в регуляции функции сердечно-сосудистой системы и почек занимает ренин-ангиотензин-альдестероновая система (РААС). Активация РААС приводит к повышению артериального давления за счет возрастания объема циркулирующей крови и увеличения активности других вазоконстрикторных факторов. В функционировании РААС важнейшая роль принадлежит ангиотензин-превращающему ферменту (АПФ). Он в значительной степени контролирует функциональное состояние сосудов, воздействуя на их тонус через генерацию ангиотензина II (AT II) и разрушая активные компоненты калликреин-кининовой системы, обладающей сосудорасширяющим действием. Известно, что ген, кодирующий АПФ, он же АСЕ, имеет структурный инсерционно-делеционный полиморфизм, который ассоциирован с более высоким уровнем циркулирующего АПФ и более высокой активностью фермента (Гундаров И.А., Матвеева С.В, 2000). Несмотря на то, что в ряде работ накоплено множество данных об ассоциации этого полиморфизма с инфарктом миокарда, гипертонией, гипертрофией левого желудочка, гипертрофической кардиомиопатией, заболеваниями почек и другими роль его остается не однозначной (Marre M., et al 1994; O'Donnell C.J., et al 1998).
Другим не менее важным компонентом РААС является АТ II, образующийся из ангиотензиногена последовательно под действием ферментов ренина и АПФ. АТ II воздействует на специфические рецепторы в сосудах и надпочечниках, приводя к повышению артериального давления. Большинство известных эффектов АТ II реализуются через рецепторы 1-го типа. Ген AGTR1, кодирующий рецепторы этого типа, также характеризуется наличием структурного полиморфизма, который сказывается на функциональной активности рецептора и осуществлении эффектов АТ II в клетке (Климов А.Н., Денисенко А.Д., 1988; Зилва Дж. Ф., Пэппелл П.Р., 1998; Ивлева А.Я., 1998; Задионченко В.С. и соавт., 2004).
Степень разработанности темы
В последнее время всё больше внимания исследователи уделяют изучению молекулярно-генетических факторов развития МС, поиску генов предрасположенности и анализу ассоциации их полиморфизмов с различными компонентами синдрома. Выявленные этнические особенности предрасположенности к развитию МС подтверждают роль генетических факторов. Имеются данные об ассоциации МС с полиморфизмом некоторых генов, продукты которых контролируют различные аспекты гемостаза и артериального давления, но вклад их в возникновение МС требует дальнейшего изучения (Бувальцев В.И., 2001; Глотов О.С. и сооавт., 2003; Задионченко В.С. и соавт., 2004). Вероятно, механизмы возникновения МС разнородны, и в основе генетической составляющей синдрома лежит сочетанный характер полиморфизма целого ряда генов (McCarthy J., 2003; Buszettsi R., 2005). Более того, мутации генов в сочетании с резистентностью к инсулину неодинаково проявляют себя в различных популяциях в зависимости от пола, возраста, этнической принадлежности их носителей. Кроме того, в рутинной практике клинических лабораторий используют методы идентификации указанных генов, которые достаточно трудоемки и дорогостоящи, что существенно сдерживает их клиническое применение. Использование молекулярно-генетических, клинико-биохимических подходов позволит оценить функциональную значимость полиморфных вариантов генов и полученных ассоциаций между генотипами и проявлениями МС.
Цель исследования.
Разработать методы определения аллельных вариантов полиморфных генов AGTR1 (А1166С), FGA (Thr312Ala) на основе аллельспецифической ПЦР, и изучить ассоциации полиморфизма указанных генов, а также гена ACE (I/D) с лабораторными факторами риска атеросклероза у пациентов с метаболическим синдромом для установления их диагностической и прогностической ценности.
Задачи исследования.
-
Разработать методику выявления полиморфизма А/С в промотерной области гена AGTR1 в положении 1166 п. н. от точки начала транскрипции.
-
Разработать методику выявления полиморфизма гена FGA, приводящего на уровне полипептида к замене в 312 положении треонина на аланин (Thr312Ala).
-
Изучить лабораторные факторы риска атеросклероза и некоторые компоненты плазменного звена гемостаза у пациентов с метаболическим синдромом.
-
Проанализировать возможную связь лабораторных риск-факторов атеросклероза с аллельными вариантами полиморфных генов ACE (I/D), AGTR1 (A1166C) и FGA (T312A) у пациентов с МС и в контроле.
Научная новизна исследования. Разработанные методики определения полиморфизма AGTR1 (A1166C) и FGA (Thr312Ala) обеспечивают надежное, быстрое и точное получение результатов генотипирования пациентов.
Показана зависимость факторов риска тромбозов (концентрации фибриногена и активности системы фибринолиза) от генотипа FGA (Thr312Ala). Выявлено существенное повышение концентрации инсулина на фоне гипергликемии у больных метаболическим синдромом с генотипом II гена ACE по сравнению с генотипом DD.
Обнаружена зависимость индекса массы тела и концентрации ХС ЛПВП от генотипа AGTR1 (A1166C), что говорит о влиянии генетического полиморфизма данного гена на риск возникновения МС.
Впервые среди пациентов с МС показано превалирование особого типа дислипидемии - повышение уровня холестерина низкой плотности в сочетании с гипо--холестеринемией. Для этих же пациентов характерно повышение концентрации высокочувствительного С-реактивного белка и инсулина в плазме крови.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Полученные результаты расширяют научные представления о функциональной значимости полиморфизма генов AGTR1 (A1166C) и FGA (Thr312Ala). Выявление аллельных вариантов полиморфных маркёров генов-кандидатов, обусловливающих повышенный генетический риск развития метаболического синдрома, создаёт базу для разработки диагностических методов прогнозирования течения заболевания. Результаты медико-генетического исследования позволяют разработать мероприятия по профилактике метаболического синдрома, являющегося состоянием высокого риска сердечно-сосудистых осложнений.
Разработанные в ходе работы новые методы ПЦР-диагностики двух ключевых полиморфизмов генов фибриногена и рецептора ангиотезиногена II, могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий. Определение генетических вариантов может рассматриваться в качестве дополнительного диагностического критерия вероятности возникновения МС и его осложнений.
Турбидиметрический анализ фибринообразования и фибринолиза может применяться в клинической практике для диагностики нарушений заключительных стадий свертывания крови и фибринолиза, особенно для динамического наблюдения пациентов с нестабильным состоянием системы гемостаза. Простота и быстрота выполнения анализа позволяет использовать его для экспресс-диагностики.
Методология и методы исследования. Для реализации цели исследования и обоснования основных положений были использованы анализ литературы, лабораторные, молекулярно-генетические методы и методы статистической обработки данных.
Основные положения, выносимые на защиту.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность полученных результатов обеспечена теоретическим анализом проблемы, репрезентативным объёмом выборок обследованных пациентов, достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием современных методов исследования и адекватным статистическим анализом данных.
Результаты диссертационного исследования были представлены в виде докладов на XI Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, Москва 2007 г, II и III Ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов ФГБУ «Федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург 2010-2011 гг. По результатам исследований получен патент Российской Федерации №2331671 «Способ определения аллелей гена -фибриногена (FGA) по полиморфному сайту Thr312Ala» и подана заявка на Изобретение «Способ определения аллелей гена рецептора 1 типа к ангиотензиногену II (AGTR1) по полиморфному сайту А1166С» № 2011153122 с приоритетом от 23.12.2011г.
Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного исследования используются в практической работе ФГБУ «Федеральный медицинский исследовательский центр имени В.А.Алмазова», а также в Межрайонной Централизованной клинико-диагностической лаборатории (СПб ГБУЗ "Николаевская больница").
Личный вклад соискателя. Диссертант самостоятельно разработал новые методики диагностики аллельных вариантов интересующих генов и выполнил все молекулярно-генетические исследования, участвовал в проведении биохимических исследований. Автором обоснованы цель, задачи, научная новизна и практическая значимость исследования, сформулированы основные положения, выносимые на защиту и выводы, проведена статистическая обработка.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, в их числе 6 - в научных изданиях, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики обследованных больных и методов исследования, 4 глав собственных наблюдений и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 21 таблицами и 18 рисунками. Указатель литературы содержит 147 наименования (35 отечественных и 112 зарубежных авторов).
Артериальная гипертензия как составляющая метаболического синдрома
Риск тромботических осложнений сердечно-сосудистой системы зависит в первую очередь от реологических свойств крови. Считается, что для пациентов с МС характерна наклонность к предтромботическому состоянию, обусловленному повышением содержания факторов коагуляции, торможением системы фибринолиза, уменьшением антитромботического потенциала сосудистой стенки и усилением коагулирующей активности свертывающей системы крови [2, 12, 22]. Среди биохимических изменений каскада коагуляции с наибольшим постоянством выявляется увеличение содержания фибриногена [137]. Данный факт не может быть объяснен только ослаблением фибринолиза. Большое значение имеет усиление синтеза фибриногена, что может быть связано с различными факторами, например, наличием воспаления в атеросклеротически измененных артериях, а также повышенным содержанием ИЛ-6 [108]. Каковы бы ни были механизмы повышения уровня фибриногена, он является одним из независимых факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и атерогенеза [2, 54].
Фибриноген – основной компонент системы свертывания крови. Он представляет собой растворимый гликопротеин плазмы, синтезируемый в печени. Молекула фибриногена состоит из шести полипептидных цепей: две А-цепи, две В-цепи и две -цепи (А2В22). Все три гена, кодирующие А -, В- и -цепи сцеплены, и уровень их экспрессии регулируется координировано [71]. В процессе свёртывания крови с помощью тромбина, который является сериновой протеазой и гидролизует четыре пептидные связи Arg-Gly, из молекулы фибриногена удаляются А- и В-цепи. В результате образуется нерастворимый мономер фибрина, имеющий структуру ()2. Эти мономеры спонтанно ассоциируют в регулярные зигзагообразные структуры, формируя фибриновый сгусток и впоследствии тромб. Стабилизации фибринового сгустка способствует поперечная сшивка молекул фибрина, осуществляемая трансглутаминазой (фактор XIIIa).
Ген А-цепи локализуется в IV хромосоме. В 5 экзоне данного гена известен структурный полиморфизм A1021G, проявляющийся на уровне полипептида как замена треонина в 312 положении на аланин (Thr312Ala). Следствием этой замены является, во-первых, повышенная латеральная агрегация фибрилл (С-доменами -цепей), из-за чего образуются более толстые фибриновые нити, а во-вторых, образуется больше поперечных сшивок между -цепями при помощи фактора XIII (по глутамину в положении 328), из-за чего тромбы формируются более толстыми и менее эластичными [130]. На клиническом уровне полиморфизм Thr312Ala связан с повышенной частотой закупорки сосудов сгустками крови при аллели 312Ala, и это явление определяет предпосылки для предсказания риска развития ишемической болезни сердца [45, 130].
При метаболическом синдроме кроме повышения коагулирующего потенциала крови наблюдается ослабление работы системы фибринолиза. Ключевой фермент фибринолиза плазмин, расщепляющий фибрин до мелких фрагментов, образуется из неактивного предшественника плазминогена под действием активаторов плазминогена тканевого и урокиназного типов. В процессе своей работы плазминоген сорбируется на образовавшемся фибриновом сгустке, поэтому величина его сорбции также может влиять на эффективность фибринолиза. В крови больных МС наблюдается увеличение содержания уровня ингибиторов фибринолиза - фактора VII и ингибитора активатора плазминогена 1 (ПАИ-1). Высокий уровень ПАИ-1, секретируемого преимущественно абдоминальной жировой тканью, рассматривается, как один из важнейших факторов развития метаболического синдрома. Высокий уровень ПАИ-1, как свидетельствуют исследования последних лет, является независимым предиктором инфаркта у мужчин с ишемической болезнью сердца [9]. Однако, в литературе практически не встречается данных о концентрации плазминогена крови и его функциональной активности. Очевидно, что нарушения гомеостаза, включающие атерогенные сдвиги липидного обмена и развивающиеся параллельно изменения свертывающих свойств крови в сторону гиперкоагуляции, неизбежно влияют на реологические свойства крови. Это негативно отражается на состоянии венозного и капиллярного кровотока, приводит к повышенной частоте тромбозов и увеличивает риск инфаркта миокарда, инсульта.
Важным прогностическим фактором риска возникновения сердечно-сосудистых осложнений у больных МС является дислипидемия. Наиболее характерными и общими признаками дислипидемии у больных МС являются следующие: [3, 24, 31, 104, 114] 1) повышение уровня триглицеридов; 2) повышение уровня ХС-ЛПНП; 3) снижение уровня холестерина “антиатерогенной” фракции – ХС-ЛПВП.
Наличие дислипидемии у больных с МС в 2-4 раза увеличивает риск сердечно-сосудистых осложнений и летальности [91, 92]. Инсулинорезистентность приводит к усилению липолиза и высвобождению большого количества свободных жирных кислот из жировой ткани, что в сочетании с повышенным содержанием глюкозы в крови дает дополнительное количество субстрата для синтеза триглицеридов в печени. Таким образом у пациентов с МС синтезируется большое количество ХС-ЛПОНП, богатых триглицеридами. Также нарушен катаболизм ТГ в результате снижения активности внепеченочной липопротеинлипазы. У больных МС отмечается уменьшение отношения активности липопротеиновой липазы к активности печёночной липазы за счёт сниженной активности липопротеиновой липазы, что способствует повышению катаболизма ХС-ЛПВП [4, 13]. Эти изменения в кинетике метаболизма ХС-ЛПВП при МС сочетаются с повышением транспорта триглицеридов из ХС-ЛОНП, что опосредованно приводит к снижению содержания антиатерогенных ХС-ЛПВП. Среди качественных изменений липопротеинов выделяют следующие: 1) наличие малых плотных фракций ХС-ЛПНП (обладающие наибольшей атерогенностью) [83, 139]; 2) неферментативное гликозилирование апопротеинов, входящих в состав основных классов липопротеинов. Этот процесс прямо зависит от повышенного уровня глюкозы в крови и приводит к образованию модифицированных (гликозилированных) липопротеинов. Модифицированные ХС-ЛПНП быстрее и легче захватываются макрофагами с образованием пенистых клеток в атероме. В результате модифицирования ХС-ЛПВП (гликозилирование апобелков, перекисное окисление, увеличение содержания в них триглицеридов и числа малых плотных ХС-ЛПВП) укорачивается время их жизни, снижается концентрация, в результате нарушается обратный транспорт холестерина; [15, 24, 28]. Гипертриглицеридемия, увеличение процентного содержания малых плотных ХС-ЛПНП, снижение концентрации ХС-ЛПВП составляют липидную триаду, которая способствует развитию атеросклероза независимо от повышения уровня общего холестерина и общей фракции холестерина ХС-ЛПНП [3]. В повседневной лабораторной практике до настоящего времени концентрацию липопротеинов в плазме или сыворотке оценивают по содержанию холестерина в составе ЛП, при этом значения холестерина ХС-ЛПОНП и ХС-ЛПНП определяют расчётным путём по формуле Фридвальда. В основе этой формулы лежат два допущения: 1) большая часть триглицеридов плазмы находится в ХС-ЛПОНП; 2) весовое отношение триглицериды: холестерин в ХС-ЛПОНП равно 5:1. Формула не даёт точных результатов при III типе дислипидемии (по Фредриксону) или выраженной гипертриглицеридемии. Гораздо корректней прямые селективные методы определения холестерина в различных липидных фракциях. При сравнении результатов определения концентрации ХС-ЛПНП непрямым и прямым методами отмечено, что абсолютные величины концентрации ХС-ЛПНП оказались на 8-10% выше при прямом определении, чем при использовании формулы Фридвальда [30].
Биохимические методы
Под воздействием каталитической активности пероксидазы образуется соединение красного цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорционально концентрации вещества. Границы линейности измерения для холестерина 0,08-20,7 ммоль/л, для триглицеридов - 0,05-11,4 ммоль/л.
Концентрацию холестерина липопротеинов высокой определяли прямым, энзиматическим методом. Для определения использовали реагент, содержащий полиэтиленгликольмодифицированные ферменты холестерол-эстеразу и холестерол–оксидазу, который изменяет реактивность ферментов и делает недоступными для их действия все другие фракции липопротеидов. В сочетании с 2-х-валентными ионами Mg указанный реагент проявляет селективную активность в отношении холестерина преимущественно ХС-ЛПВП. В результате реакции под воздействием пероксидазы образуется окрашенное соединение (pyrple-blue pigment), интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации холестерина ХС-ЛПВП. Пределы линейности измерения для данного набора реактивов 0,08 – 3,12 ммоль/л. Концентрацию холестерина в ХС-ЛПНП определяли также прямым энзиматическим методом. В реактивы, содержащие ферменты холестерол - эстеразу и холестерол – оксидазу, включены детергент, обусловливающий селективную мицеллярную растворимость и ионы 2-х-валентного Мg, блокирующие в данном случае энзиматическое определение холестерола в ХС-ЛПОНП и ХМ. Диапазон линейности для данного набора реактивов 0,077 – 14,2 ммоль/л. Коэффициент атерогенности рассчитывали по формуле акад. РАМН А.Н. Климова. Коэффициент атерогенности = (общий ХС – ХС–ЛПВП)/ХС–ЛПВП
Количественное определение глюкозы проводили глюкозооксидазным методом. При окислении D-глюкозы кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет 4-аминоантипирин в присутствии фенольных соединений в окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемом образце.
Концентрацию фибриногена определяли двумя методами: стандартизованным гравиметрическим методом по Рутберг и хронометрическим методом по Клаусу [5]. Принцип гравиметрического метода заключается в инициировании процесса свертывания крови в присутствии ионов кальция и тканевого тромбопластина (экстракта из головного мозга животных). После образования сгустка, необходимо быстро его обезвожить (путем отжима на фильтровальной бумаге), после чего измеряется масса образовавшегося фибрина, по которой рассчитывается концентрация фибриногена в плазме. Метод определения по Клауссу основывается на определении скорости образования сгустка фибриногена при добавлении избытка кальциевого человеческого тромбина к разведенной плазме. Время свертывания разведенной плазмы обратно пропорционально концентрации фибриногена плазмы. Сорбцию плазминогена на фибрине в процессе тромбообразования определяли оригинальным разработанным нами методом, используя индивидуальную цитратную плазму в качестве источника, как фибриногена, так и плазминогена (см. главу 4.5).
Для оценки качества выделения ДНК использовали метод электрофореза в 0,8% агарозном геле. Окрашенные бромидом этидия образцы визуализировали в ультрафиолетовом свете (рис. 1). Во всех представленных образцах ДНК не имеет загрязнений и не подверглась деградации, что свидетельствует о достаточно высоком качестве выделения.
Идентификацию аллельных вариантов гена ACE (ID-полиморфизм) проводили при помощи метода, основанного на базе ПЦР-технологии (полимеразной цепной реакции). В виду особенностей изучаемого полиморфизма использовали две комбинации праймеров. Первая пара праймеров - прямой (FW) и обратный внешний (RV out) - захватывает не только область, где встречается вставка/выпадение фрагмента 287 п.н, но и константные участки справа и слева от него (рис. 2) Вторая пара праймеров- прямой (FW) и обратный внутренний (RV in) – включает часть полиморфного участка (только при наличии вставки) и небольшую константную зону левее (down-stream) от Alu-транспозона (рис. 2). Для каждой пробы проводили реакцию в двух отдельных пробирках. Так, первая реакционная смесь содержала прямой (FW) 5’-AGG-AGA-GAG-ACT-CAA-GCA-CGC-C-3’ и обратный внешний (RV out) 5’-CCC-TCC-CAT-GCC-CAT-AAC-AG-3’праймеры, а вторая – включала прямой (FW) и обратный внутренний (RV in) 5’-GCA-GGA-GAA-TGG-CGT-GAA-CC-3’ праймеры (рис. 2).
Исследование ультрачувствительного с-реактивного белка у больных метаболическим синдромом.
Сорбцию плазминогена на фибрине в процессе тромбообразования определяли оригинальным методом, разработанным нами в 2001-2007 гг. используя индивидуальную цитратную плазму в качестве источника как фибриногена, так и плазминогена. Количество сорбируемого в цитратной плазме плазминогена на фибриногене оценивали следующим образом. Разбавляли плазму в 4 раза физиологическим раствором. Далее к 100 мкл четырехкратно разведенной цитратной плазмы добавляли 100 мкл рабочего раствора тромбина (0,5 Ед/мл), что инициировало тромбообразование. Формирование сгустка и сорбция на нем плазминогена происходило в течение 30 мин, после чего фибриновый сгусток из пробы удалялся. Количество оставшегося в сыворотке плазминогена определяли по активности комплекса “стрептокиназа-плазминоген”. Для этого к 20 мкл получившейся сыворотки добавляли 200 мкл стрептокиназы (1000 Ед/мл) и инкубировали смесь 10 мин при 370С. После этого в пробу добавляли 900 мкл вероналового буфера и 100 мкл трипептидного хромогенного субстрата: формил-ала-фен-лиз-паранитроанилид. На расщепление субстрата (при 370С) отводилось 4 мин, после которых ферментативную реакцию останавливали 15%-ой уксусной кислотой (1 мл). Активность комплекса «стрептокиназа-плазминоген» измеряли на фотоэлектроколориметре МКМФ-02М со светофильтром 340 нм. В качестве показателя величины сорбции плазминогена на фибрине брали разность активностей комплексов “стрептокиназа-плазминоген” в исходном образце плазмы и в сыворотке, оставшейся после извлечения фибринового сгустка, отнесенную на мл плазмы (U/ml плазмы) или на мг фибриногена (U/mg фг). Предложенный способ позволяет оценивать процесс сорбции плазминогена индивидуально у данного больного. Количество плазминогена в плазме определяли через активность комплекса “стрептокиназа-плазминоген» с помощью вышеописанного способа, но без инициации тромбообразования.
В ходе работы впервые были получены данные об активности плазминогена и сорбции этого белка на фибрине у больных МС. В группе пациентов как активность плазминогена, так и сорбция плазминогена на фибрине оказались достоверно выше по сравнению с группой контроля, соответственно в среднем 1,5 и 2 раза. Анализ корреляций между индексом массы тела, показателями системы фибринолиза, концентрацией фибриногена и некоторыми другими величинами выявил несколько статистически значимых связей в группах больных МС и контроля (табл. 20).
Во-первых, было показано, что величина сорбции плазминогена на фибрине в пересчете на мл плазмы обнаруживает положительную корреляцию с величиной сорбции плазминогена на фибрине в пересчете на мг фибриногена (R=0,84 для группы больных МС, R=0,77 для группы контроля). Во-вторых, сорбция в пересчете на мг фибриногена обратно пропорциональна концентрации фибриногена (R= - 0,36 для группы больных МС, R= - 0,55 для группы контроля). В-третьих, в группе больных МС активность плазминогена прямо пропорциональна величине сорбции плазминогена на фибрине как в пересчете на мл плазмы (R= 0,87), так и в пересчете на мг фибриногена (R= 0,80). В группе контроля активность плазминогена обнаруживала положительную корреляцию только с величиной сорбции плазминогена на фибрине в пересчете на мл плазмы (R= 0,42), а при пересчете сорбции на мг фибриногена эта зависимость пропадала (R= 0,27). В-четвертых, в группе больных МС обнаружена положительная корреляция ИМТ с величиной сорбции плазминогена на фибрине в пересчете как на мл плазмы (R= 0,26), так и на мг фибриногена (R= 0,33). У больных МС показана прямая зависимость между артериальным давлением и сорбцией плазминогена на фибрине (R= 0,27 и R= 0,29 для систолического; R= 0,26 и R= 0,29 для диастолического), для диастолического давления была выявлена прямая зависимость от концентрации плазминогена в крови (R=0,23), а для концентрации фибриногена – обратно пропорциональная зависимость от концентрации глюкозы в крови (R= - 0,29).
Метод идентификации аллелей гена рецептора 1-го типа к ангиотензиногену ii (agtr1) по полиморфному сайту а1166с
Метаболический синдром – это комплекс изменений в организме, в совокупности приводящих к глубокому нарушению обмена веществ, которое проявляется в виде нарушений липидного, углеводного обменов, а также нарушений в различных системах органов и тканей [33].
Обследованные пациенты с МС обладали множественными проявлениями нарушения обмена веществ. Так, по сравнению с условно здоровыми людьми они характеризовались повышением, как самой массы тела, так и ее индекса (ИМТ). Суточное мониторирование артериального давления у всех пациентов показало наличие артериальной гипертензии, проявлявшейся в повышении и систолического, и диастолического давления. На фоне нормального уровня общего холестерина и ХС-ЛПНП у больных МС был отмечен высокий уровень триглицеридов, что классифицируется, как четвертый тип нарушения липидного обмена по Фредриксону - изолированная гипертриглицеридемия. Коэффициент атерогенности достигал верхних значений нормы и так же был повышен в сравнении с группой контроля. Кроме того, отмечали повышенное содержание С-реактивного белка, что зачастую ассоциируется с воспалительными процессами в сосудистой стенке и с осложненным течением атеросклероза [35].
Нарушения углеводного обмена - наличие инсулинорезистентности - проявлялись в виде повышенного содержания в крови глюкозы натощак и инсулина. Известно, что больные МС склонны к тромботическим осложнениям [2]. Существует несколько факторов, предрасполагающих к внутрисосудистому тромбообразованию. К ним относятся: усиление коагулирующей активности свертывающей системы крови; торможение системы фибринолиза; увеличение количества тромбоцитов в крови; повышение вязкости крови вследствие повышенного содержания в крови эритроцитов; замедление венозного кровотока благодаря малой физической активности; изменения сосудов, вызванные повышением кровяного давления; а так же локальное уплотнение внутренней поверхности кровеносных сосудов вследствие воспалительных процессов или атероматоза и др. [38].
Одну из ведущих ролей в повышении коагулирующих свойств крови играет дисфункция эндотелия. Эндотелий регулирует не только периферический кровоток, но также и синтез / ингибирование факторов пролиферации, фибринолиза и агрегации тромбоцитов, выработку про- и противовоспалительных факторов. Показано, что дисфункция эндотелия является ранней фазой повреждения сосудистой стенки, атеросклероза, АГ [10]. Дисфункция эндотелия – это изменения спектра выделяемых им биологически активных веществ, среди которых важнейшим является оксид азота - NO. Этот метаболит, в частности, обладает антитромботическими свойствами, ингибируя адгeзию тромбоцитов [56], их активацию и агрегацию [38], активируя тканевой активатор плазминогена [129]. При хронических сердечно-сосудистых заболеваниях, как правило, наблюдается снижение синтеза NO, в связи с чем, повышается предрасположенность к тромбообразованию. Риск тромботических осложнений возрастает также при повышенной концентрации фибриногена в крови. Показано, что уровень фибриногена в плазме является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку при высоких концентрациях фибриногена образуются более плотные и менее проницаемые фибриновые сгустки [94].
Обследованные пациенты с МС характеризовались повышенным уровнем фибриногена в крови в сравнении с группой контроля, но при этом и более высокой активностью системы фибринолиза. Это может приводить к развитию вялотекущего ДВС-синдрома, явиться причиной тромботических осложнений у больных МС. Таким образом, результаты исследования показали, что повышение концентрации фибриногена было ассоциировано с активацией системы фибринолиза. Вероятно, что у обследованных больных тромботические осложнения возникают, скорее всего, не вследствие изменения коагулирующих свойств крови, а по другим причинам, возможно, из-за воспаления сосудистой стенки, о чем свидетельствует высоки уровень CRP.
На рисунке 16 представлены выявленные нами зависимости между концентрацией фибриногена, активностью плазминогена и величиной сорбции плазминогена на фибрине (табл. 20). Поскольку активность плазминогена определялась фактически как содержание функционального плазминогена в единице объема плазмы (1 мл), то на рисунке для большей наглядности этот показатель показан как концентрация плазминогена.
Видно, что, во-первых, чем больше концентрация фибриногена, тем меньше плазминогена адсорбируется на единицу его массы (1 мг) (см. А и Б). Во-вторых, чем больше содержание плазминогена, тем больше его адсорбируется на фибриногене в мл плазмы (при данной концентрации фибриногена) (А и В, Б и Г). В-третьих, по-видимому, что чем больше сорбция плазминогена на фибрине на единицу массы фибриногена, тем больше сорбция плазминогена на фибрине в мл плазмы (А и В, Б и Г). Важно отметить, что величина сорбции плазминогена (в мл плазмы) не зависит от концентрации фибриногена (А и Б, В и Г). Кроме того, чем больше содержание плазминогена, тем больше его адсорбируется на мг фибриногена (А и В, Б и Г). Последняя из упомянутых корреляция выявлена только в группе больных МС. Скорее всего, это связано со следующими причинами. У всех пациентов с МС примерно на одинаковом уровне повышены концентрация фибриногена и активность плазминогена (рис. 13 и 14). Корреляции между этими двумя биохимическими показателями, как в основной группе, так и в группе контроля выявлено не было. Поэтому при повышении активности плазминогена (увеличении содержания функционального плазминогена) будет увеличиваться величина его сорбции на единицу фибриногена. В группе контроля несколько иная ситуация. На рисунках 13 и 14 видно, что есть группа людей, у которых резко снижена концентрация фибриногена, и у них же снижена активность плазминогена (в противном случае они, по-видимому, страдали бы повышенной кровоточивостью) – это обладатели генотипа AA FGA. В связи с этим при низкой активности плазминогена (низком содержании работоспособного плазминогена) сорбция этого белка на фибрине (на единицу фибриногена) будет такая же, как и при высокой активности плазминогена, поскольку при этом будет и больше концентрация фибриногена (как если бы существовали только варианты Б и В на рис. 16) – опять-таки только у обладателей генотипа AA FGA. Вероятно, именно наличие такой группы людей не позволяет выявить корреляцию активности плазминогена и его сорбции на фибрине (U/mg фг) в общей группе контроля. Действительно, если проводить корреляционный анализ этих показателей только среди обладателей генотипов ТТ и ТА FGA в группе контроля, то выявляется тенденция к их прямой связи (R=0,334 при р 0,05).
