Введение к работе
Актуальность проблемы.
На протяжении многих десятилетий главной задачей нейроиммунофизиологии являлось изучение возможных связей между нервной и иммунной системами. Применение прецизионных методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа в сочетании с иммуногистохимическими методами исследования дало возможность оценить вовлеченность различных структур мозга, а также степень участия различных биологически активных веществ, вырабатываемых нервными клетками, в механизмах реализации нейроиммунных взаимодействий.
В настоящее время широко изучается влияние стресса на функции нервной и иммунной систем. Стресс-индуцированные изменения в работе этих систем исследуются на экспериментальных моделях и в клинической практике у пациентов после длительных психоэмоциональных переживаний. Имеется большое количество работ, отражающих возможность позитивного и негативного эффектов действия стресса на защитные функции организма (Rybakina E.G. et al., 1996; Shanin S.N. et al., 2005; Sheridan J.F. et al., 1991; Brenner G.J. and Moynihan J.A., 1997; Glaser, R. Et al., 1990), причем характер их влияния зависит от интенсивности и длительности стрессорного воздействия, а также от исходного функционального состояния (Меерсон и др., 1984; Фролов., Б.А., 1987; Rybakina E.G. et al., 1997). Применение подобных моделей экспериментального стрессорного воздействия позволяет изучить и возможную роль различных нейромедиаторов и нейропептидов в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия.
Есть основания полагать, что открытые в 1998 году нейромедиаторы орексин А и орексин В могут принимать участие в реализации реакции мозга на стрессорные воздействия. Установлено, что основное количество орексин-содержащих нейронов расположено в области латерального гипоталамического поля (LHA) (De Lecea L. et al., 1998). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (PVN), дорзомедиальном (DMH) ядрах и заднем поле гипоталамуса (РН) ( Реугоп С, 1998).
С помощью иммунногистохимического метода выявления c-Fos белка и орексина А в клетках мозга установлена избирательность реакции орексин-содержащих нейронов при различных стресс-индуцирующих воздействиях. Показано, что данные воздействия приводят к активации доли орексинтсодержащих нейронов
гипоталамуса, которая варьируется в зависимости от силы и длительности применяемого воздействия (Moriguchi Т., 1999; Kurose Т. et al., 2002; Estabrooke I.V. et al., 2001; Zhu L. et al., 2002). При охлаждении и ограничении подвижности молодых крыс показано увеличение количества c-Fos-позитивных орексин-содержащих клеток гипоталамуса на 15 и 24 % соответственно (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004), тогда как применение болевого разражения активирует более 90% орексин-позитивных нейронов гипоталамуса (Zhu L. et al., 2002). Однако изменения интенсивности синтеза м-РНК препроорексина не столь однозначны: при ограничении подвижности, охлаждении, гипогликемии и ограничении питания количество м-РНК препроорексина возрастает, тогда как при реакциях страха -напротив снижается (Ida Т., et al. 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kurose T. et al., 2002; Zhu L. et al., 2002). По-видимому, избирательность реагирования орексин-содержащих нейронов на стрессорные воздействия разного рода, может быть связана с функциональными различиями популяции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса.
Внутрижелудочковое введение орексина ведет к стимуляции секреции адренокортикотропного гормона (АКТГ) (Ida Т. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kuru M., et al. 2004; Samson W.K., 2002), активации ГГАС (Kuru M. et al., 2004), повышению уровня кортикостерона в плазме крови (Kuru М. et al., 2004; Kurose Т., et al., 2002; Jaszberenyi M., et al., 2000; Jaszberenyi M, et al., 2001; Hagan J.J., et al., 1999; Al-Barazanji K.A., et al., 2001; Russell S.H., et al., 2001; Mullett M.A., et al., 2000), a также увеличению количества c-Fos-позитивных нейронов в мелкоклеточной части PVN, на мембранах которых были обнаружены рецепторы к орексинам (Trivedi P. et al., 1998).
Появившиеся в последнее время данные свидетельствуют о том, что орексин-содержащие нейроны помимо участия в ответе на стрессорные воздействия, вовлечены в процесс терморегуляции и теплопродукции (Monda М, 2001; Monda М, 2003; Monda М, 2003; Monda М, 2004; Jaszberenyi М, 2002; Digby J. Е., 2006; Szekely М, 2002). Однако, данные работ, в которых показана причастность орексин-содержащих нейронов к процессу терморегуляции, неоднозначны. Известно, что дорзомедиальное (DMH) и паравентрикулярное (PVH) ядра, а также латеральное и заднее (РН) гипоталамические поля, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, имеют причастность к процессу теплопродукции (Imai-Matsumura К. et al 1984; Amir, 1990; Zaretskaia, 2002; Cao 2004, Tanaka, et al 2001). При разных условиях
внутрижелудочковое введение орексина А может вызывать как повышение температуры животного, так и понижение (Monda М, 2001; Monda М, 2003; Monda М, 2003; Monda М, 2004; Jaszberenyi М, 2002; Digby J. Е., 2006; Szekely М, 2002). У мышей, ноккаутных по гену препроорексина отсутствуют циркадные изменения температуры тела (Mochizuki Т., 2005). Наряду с данными, свидетельствующими о действии орексина на процесс терморегуляции, известны и данные о контролирующем действии коры на терморегуляционный эффект орексина: подавление активности коры во фронтальной области блокирует повышение температуры тела, вызванное внутрижелудочковым введением орексина A (Monda М., 2004). Кроме того внутрижелудочковое введение орексина А снижает лихорадку, вызванную введением LPS (Jaszberenyi М., 2002).
Известно, что ограничение подвижности, охлаждение животных и комбинированный стресс (ограничение подвижности в сочетании с охлаждением) запускают ярко выраженную стрессорную реакцию, инициируя значительные изменения содержания в плазме крови катехоламинов и глюкокортикоидов (Sheridan et al., 1991; Pacak К., 2001). Таким образом, применение адекватной экспериментальной модели стресс-индуцирующего воздействия позволит расширить представления о степени участия орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в развитии комплекса реакций, протекающих в мозге в процессе формирования ответа на стрессорное воздействие. Решение данного вопроса представляется актуальным для фундаментальной науки и направлено на раскрытие механизмов реализации реакции нейронов гипоталамуса, синтезирующих орексин, на изменения, происходящие в центральной нервной системе на фоне стрессорного воздействия.
Целью данной работы явилось изучение реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса на экспериментальное ограничение подвижности и охлаждение животного.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать динамику экспрессии гена препроорексина по синтезу м-РНК препроорексина в клетках гипоталамуса крыс во время и после ограничения подвижности, а также во время и после комбинированного воздействия - ограничения подвижности и охлаждения.
Определить иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах перифорникальной области
латерального гипоталамуса, при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении.
Установить паттерн реакций структур и зон гипоталамуса, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, характерный для проявления ответа мозга на данные виды стрессорных воздействий.
Проанализировать возможные механизмы развития морфо-функциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении на основе результатов сочетанного исследования изменений экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе и иммуногистохимических особенностей орексин-содержащих нейронов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса возрастает в 5.5 раз через 1 час после окончания ограничения подвижности крыс и нормализуется через 1 час после охлаждения на фоне ограничения подвижности.
Изменения иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, после примененных стрессорных воздействий, происходят только в определенных структурах и зонах гипоталамуса крыс, представленных на срезах мозга 29-го уровня.
Ограничение подвижности приводит к снижению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHAd на срезах мозга 28-го уровня; в LHAm на срезах мозга 29-го уровня; и к повышению иммунореактивности этих нейронов в DMHa, LHAs на срезах мозга 29-го уровня, а также в РН на срезах мозга 31 уровня (согласно атласу мозга Swanson L.W).
Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения приводит к повышению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в LHAjd, LHAd, локализованных на срезах мозга 28-го уровня и понижению иммунореактивности таких нейронов в РН на срезах мозга 31 уровня.
Картирование орексин-позитивных нейронов в различных структурах гипоталамуса и определение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и его сочетании с охлаждением, позволило выявить функциональную дискретность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах гипоталамуса.
Снижение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в отдельных структурах и зонах гипоталамуса, при одновременном
повышенном уровне экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и вовлеченности данных структур в реализацию реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.
Научно-практическое значение. Работа является приоритетным
экспериментальным исследованием и этапом в развитии нового научного направления по изучению участия нейромедиатора орексина в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия. При помощи сочетанного применения методов оценки экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса и иммуногистохимического выявления орексина в нейронах перифорникальной гипоталамической области впервые проведен детальный анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение. Определен паттерн вовлечения этих нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса крыс, в процесс реализации реакции мозга на ограничение подвижности и охлаждение. Выявлена дискретность функциональных изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, представленных в структурах гипоталамуса крыс, при ответе на данные стрессорные воздействия. Определены структуры и зоны гипоталамуса крыс, в которых наблюдается нарушение баланса синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах при ограничении подвижности и охлаждении. Результаты работы расширяют и дополняют сложившиеся в настоящее время представления о системе орексин-эргичеких нейронов и могут быть использованы в научной практике, связанной с исследованием клеточных и молекулярных механизмов формирования ответа организма на стрессорное воздействие, а также могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии.
Апробация работы. Материалы исследования изложены в 6 публикациях, в том числе представлены на Российских и Международных конференциях:
Второй Санкт-Петербургский Международный экологический форум «Окружающая среда и здоровье человека» 1 - 4 июля 2008 года, Санкт-Петербург, Россия
4-й Объединенный Иммунологический Форум 30 июня - 3 июля, Санкт-Петербург, Россия
Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы» 15-17 сентября 2008 годаб Москва, Россия.
4. Межвузовская конференция молодых ученых «Герценовские чтения» 13-16 апреля 2008 года.
Структура її объем работы: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, выводов и списка цитируемой литературы из 258 источников, из них 249 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 5 таблицами.
