Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы i / J 12
1.1. Современные представления о механизмах старения 12
1.2. Возрастные изменения тканей организма при старении 16
1.3. Возрастные изменения в системе крови у человека и животных 18
1.4. СРО липидов в организме человека и животных 20
1.4.1. Роль СРО липидов в организме в условиях нормы 20
1.4.2. СРО окисление липидов в условиях патологии 22
1.4.3. Роль СРО липидов в процессах старения 24
1.5.1. Основные направления геропрофилактической терапии 30
1.5.2. Биологические эффекты фитоадаптогенов 32
1.5.3. Влияние антиоксидантов на процессы СРО 36
1.6. Участие митохондрий в развитии возрастной патологии 38
Заключение и задачи исследования 46
Глава 2. Методические вопросы исследования 47
2.1. Характеристика лабораторных животных, использованных в исследованиях 47
2.2. Методы получения и преаналитическои подготовки материала для исследований 53
2.3. Гематологические и морфологические методы исследования 53
2.4 Оценка уровня СРО липидов в крови 54
2.5. Оценка антиокислительной активности крови 56
2.6 Исследование резистентности эритроцитов лабораторных животных з
2.7 Метод определения степени фрагментации митохондриальной (мт)ДНК 59
2.8. Методы статистической обработки результатов исследования 63
ГЛАВА 3. Исследование состояния сро липидов системы крови после экстремального воздействия у животных разного возраста ij 65
3.1. Исследование состояния процессов СРО липидов и АОЗ крови после иммобилизационного стресса у крыс в онтогенезе 65
3.2. Исследование влияния антиоксидантов на процессы СРО липидов крови в эксперименте на лабораторных животных 71
3.3. Динамика изменений лабораторных показателей крови в условиях стрессового воздействия у крыс разного возраста 84
3.4. Заключение 94
ГЛАВА 4. Исследование изменений в генетическом аппарате митохондрий в онтогенезе и при экстремальном воздействии у лабораторных животных 96
4.1. Исследование степени фрагментации митохондриальной ДНК у животных разных возрастных групп 96
4.2. Исследование степени фрагментации митохондриальной ДНК у животных разных возрастных групп после профилактического курса фитоадаптогенами и антиоксидантами 99
4.3. Заключение 108
Общее заключение 109
Выводы 120
Список литературы
- Возрастные изменения тканей организма при старении
- Гематологические и морфологические методы исследования
- Исследование влияния антиоксидантов на процессы СРО липидов крови в эксперименте на лабораторных животных
- Исследование степени фрагментации митохондриальной ДНК у животных разных возрастных групп после профилактического курса фитоадаптогенами и антиоксидантами
Возрастные изменения тканей организма при старении
Несмотря на то, что значение фитотерапии в последние годы возросло и в этой области ведется научный поиск, многие направления ее развития до сих пор не определены. Так, не в полной мере проведены исследования по изучению геропрофилактических механизмов действия растительных препаратов [181]. По мере проведения экспериментальных исследований возникают новые аспекты применения фармакологических агентов растительного происхождения, что может повести за собой изменение или расширение круга показаний к их использованию.
Одними из лекарственных растений, представляющих большой интерес для изучения, как источники антиоксидантов, являются родиола розовая (Rhodiola rosea L.) - многолетнее травянистое растение семейства толстянко-вых, и элеутерококк колючий (Eleutherococcus senticocus) - представитель семейства аралиевых. Данные лекарственные растения входят в группу фитоадаптогенов, чьи основные эффекты проявляются в оптимизации функций организма и обмена веществ при их нарушении, что ведет за собой повышение неспецифической реактивности и сопротивляемости организма [185].
В составе родиолы розовой присутствуют органические кислоты (щавелевая, лимонная, яблочная, галловая), углеводы, дубильные вещества, флаво-ноиды. Эфирное масло, выделенное из золотого корня, содержит р - фенилэти-ловый спирт, коричный альдегид и цитраль. В корнях и корневище родиолы ро 33 зовой обнаружены также цинноаминогликозиды, монотерпены, стерины, фе нольные соединения [30]. При исследовании минерального состава данного растения выявлено повышенное содержание титана, цинка, меди. В состав ро-диолы розовой входят анионы серы, хлора, брома, йода марганца [138]. Основными веществами, обуславливающими стимулирующие и адаптогенные свойства родиолы розовой, являются гликозид салидрозид и его агликон п-тирозол [138]. Также были выделены нейротропные гликозиды коричного спирта роза-вин и розарии, гликозид у-лактона алгинозид, родиолозид, родозин [30].
Родиола розовая обладает широким спектром биологического действия. Известно адаптогенное [138, 254] и противострессовое [38], а также стимулирующее действие ее препаратов [138]. Золотой корень повышает устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды - переутомлению, химическим и физическим факторы, радиоактивному облучению, биологическим токсинам [98, 138]. Известно свойство золотого корня повышать физическую [160, 176] и умственную работоспособность в эксперименте и клинике [185]. Золотой корень обладает общетонизирующим действием, нормализует функции центральной нервной и сердечно-сосудистой систем, водно-солевой обмен, снижает уровень холестерола в крови и улучшает утилизацию глюкозы в тканях [32]. Ее активные компоненты обладают свойством активизировать иммунные реакции при иммунодефиците и тем самым повышать устойчивость организма к инфекционному фактору [38]. Родиола розовая в составе различных сборов используется в профилактической онкологии [26, 146].
Основным препаратом родиолы розовой является экстракт родиолы жидкий. Его получают из измельченного сырья путем экстрагирования 40% спиртом в соотношении 1:1 методом реперколяции. Согласно требованиям ГФ (ФС 42-2163-84) экстракт родиолы жидкий имеет следующие числовые показатели: содержание спирта не менее 34%, салидрозида не менее 0,5% и не более 0,8%.
Элеутерококк колючий (Eleutherococcus senticocus) является представителем адаптогенов семейства аралиевых. В химическом составе его можно выде 34 т» лить активные гликозиды ароматической и неароматической природы - элеуте-розиды, а также эфирное масло, смолы, липиды, сахара, аскорбиновая кислота, Р - каротин, витамин Е [48]. Элеутерококк оказывает выраженное нормализующее действие при влиянии на организм стресс - факторов различной природы, стимулирует физическую и умственную работоспособность [48, 190]. Под действием элеутерококка резко улучшается восстановление организма животных после стрессового воздействия [48, 191]. Элеутерококк облегчает утилизацию глюкозы в тканях и снижает синтез холестерина в условиях холестериновой нагрузки [190]. Препараты элеутерококка стимулируют неспецифическую и специфическую иммунологическую резистентность организма [48, 160], повышает секрецию интерферона [31] и интерлейкинов, препятствует действию им-мунодепрессивных факторов различной природы [270].
Основным препаратом элеутерококка является экстракт элеутерококка жидкий, приготовленный согласно требованиям ГФ в соотношении 1:1 путем экстрагирования 40% спиртом методом реперколяции. В котором экстрактивных веществ не менее 29%, суммы элеутерозидов не менее 0,30%, спирта не менее 33%, сухой остаток не менее 6%.
В литературе, посвященной изучению свойств фитоадаптогенов, говорится о геропрофилактическом действии, но нет сведений о механизмах влияния на геронтогенез. Имеются лишь некоторые экспериментальные исследования, оценивающие действие этой группы препаратов на центральную нервную систему в возрастном аспекте [209]. Ряд авторов установили, что экстракт элеутерококка повышает адаптивный ответ у детей с пневмонией и ОРВИ, улучшает восстановительный период в терапии ревматизма у подростков [39, 78, 154].
Поскольку имеются данные о геропрофилактическом действии ряда адап-тогенов [160], в последнее время данные препараты рекомендуются для лечебно - профилактического применения в пожилом и старческом возрасте [12, 90]. Однако в литературе отсутствуют данные о сравнительной оценке применения растительных адаптогенов у пациентов различных возрастных групп.
Гематологические и морфологические методы исследования
Определение диеновой конъюгации (ДК) высших ненасыщенных жирных кислот проводили по методу рекомендованному Камышниковым В. С. (2000) в нашей модификации. Принцип метода состоял в спектрофотометрической регистрации характерного для ДК максимума поглощения при длине волны 233 нм: система сопряженных двойных связей в ненасыщенных жирных кислотах -диеновая конъюгация.
Ход работы: на холоде к 1 мл плазмы крови приливали 9 мл смеси изо-пропилового спирта и гептана (1:1). Полученную суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма (стекло-тефлон) на ледяной бане в течение 10 минут; после гомогенизации смесь центрифугировали 15 мин. при 4000 об/мин., затем к супернатанту приливали 1 мл дистиллированной воды и энергично встряхивали. После разделения фаз из верхней (гептановой) фазы отбирали 2,5 мл для спектрофотометрии в ультрафиолетовой части спектра при длинах волн 219 нм (общие липиды) [11] и 232 нм (диеновая конъюгация) на спектрофотометре СФ-46 против чистого гептана. Результаты исследования ДК выражали в ммоль/л. Для расчетов концентрации диеновых конъюгатов использовали закон Ламберта-Бера: exL где Е - экстинция, е - коэффициент молярной экстинции, в данном случае для
ДК равный 2,2 х 10 см"! х М "1, L - толщина оптического слоя в кювете в см, равная в наших опытах 1, С - молярная концентрация раствора, к - коэффициент разведения, рассчитываемый отдельно для каждого метода. Определение уровня СРО по накоплению МДА проводили на основе общепринятого метода [11, 71, 75] в нашей модификации, которая заключалась в предварительной инкубации исследуемого материала в стандартных условиях для активации СРО. Это позволило нам оценивать способность системы АОА регулировать процессы СРО.
Ход работы: к 2 мл плазмы крови добавляли 0,5 мл 0,05 М трис-НС1-буфера с рН 7,36 и инкубировали в термостате при температуре 37 С0 в течение 1,5 часов. Затем производили осаждение белка добавлением 0,2 мл 50% три-хлоруксусной кислоты на холоде (ледяная баня), после этого пробы центрифугировали 15 минут при 4000 об/мин. К образовавшемуся супернатанту приливали 1 мл 0,8% тиобарбитуровой кислоты и помещали на кипящую водяную баню на 15 минут, затем вновь центрифугировали. Полученный раствор фото-мстрировали при длинах волн 535 нм (максимум специфического поглощения образовавшегося триметинового комплекса) и 580 нм (неспецифическое поглощение). Расчет результатов производили по формуле: МДА = АЕ х 6,73 х КГ5 [моль/л крови].
Для отмеривания объемов жидкостей здесь и в других методиках использовали поршневой автоматический дозатор А-2 и Micropipette РМ 3 и РМ 4 (НПО «Биоприбор»). Для измерения небольших объемов жидкостей использовали автоматические дозаторы (Labsystems, Финляндия).
Некоторые из использованных нами вариантов методов оценки состояния ПОЛ дают информацию о соотношении СРО/АОА. Однако для углубленной оценки изучаемой системы имелась необходимость оценки активности некоторых АОФ (каталаза, пероксидаза), которые представляют собой относительно автономно работающие системы [61]. Для оценки АОА проводилось исследование активности антиокислительных ферментов пероксидазы и каталазы.
Активность пероксидазы (КФ 1.11.1.7) определяли по методу Попова Т. с соавт. (1971). Метод основан на регистрации снижения интенсивности окраски раствора при окислении перекисью водорода индигокармина в присутствии пе роксидазы.
Ход работы: К 1 мл 0,2 М ацетатного буфера с рН 4,9 приливали 1 мл 0,0005 М раствора индигокармина и 0,5 мл гемолизата цельной крови в разведении 1:1000. Смесь прогревали 5 минут на водяной бане при t = 30 С0 и приливали к ней 0,5 мл 0,03 М перекиси водорода. Реакцию останавливали через 2 минуты добавлением 3 мл 20% серной кислоты. Пробы спектрофотометрирова-ли при длине волны 610 нм против дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси водорода вносили 0,5 мл дистиллированной воды. Разность экстинкций контрольной и опытной проб была пропорциональна активности фермента, которую выражали в мккаталах на г гемоглобина (для крови), учитывая, что основное количество пероксидазы находится в эритроцитах (1 катал = обмену 1 моля субстрата в секунду/г белка). Формула для расчета активности фермента
Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли по методу, рекомендованному Арутюняном А. В. с соавт. (2000). Метод основан на титровании в кислой среде остатка неразложившейся под действием фермента перекиси водорода.
Учитывая способность эритроцита в определенных условиях, к числу которых относят активацию СРО и ослабление АОА, подвергаться гемолизу [115], изучали осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) по методике В.П. Войтенко с соавт. (1986). Исследования перекисной резистентности эритроцитов проводили по методу Покровского А. А. с соавт. [36, 75]. Метод осно 58 ван на учете степени гемолиза эритроцитов крови в присутствии перекиси во дорода. Ход работы: для определения перекисной резистентности эритроцитов (ПРЭ) 0,02 мл цельной крови смешивали с 0,4 мл физиологического раствора и 2 каплями 0,2 М лимоннокислого натрия, центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин. К осадку эритроцитов приливали 0,4 мл буферного физиологического раствора (физиологический раствор и 0,15 М фосфатный буфер с рН 7,4 в соотношении 1:1), инкубировали 15 минут при 37С и вновь центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин. К осадку эритроцитов приливали 0,25 мл физиологического раствора. Образовавшуюся суспензию эритроцитов помещали в 4 пробирки в объеме по 0,05 мл. В 3 пробирки приливали 0,05 мл 2,4 % раствора перекиси водорода в фосфатном буфере вышеуказанного состава, а в 4-ю пробирку - 0,05 мл того же буферного раствора. Инкубировали 15 минут при 37С и выдерживали при комнатной температуре 165 минут. Затем во все пробирки, кроме 3-й, приливали 0,3 мл буферно-физиологического раствора, а в 3-ю - для полного гемолиза - 0,3 мл дистиллированной воды. Все пробы центрифугировали при 3000 об./ мин. 5 минут и фотометрировали на СФ-46 при длине волны 536 нм. Перекисную резистентность эритроцитов (ПРЭ) оценивали в % как величину, обратную полному гемолизу эритроцитов.
Исследование влияния антиоксидантов на процессы СРО липидов крови в эксперименте на лабораторных животных
Количество синтезированных фрагментов мт ДНК составило: в первой группе - 1,99, во второй группе - 9,61, в третьей группе - 2,58, в четвертой группе - 3,17, в пятой группе - 4,75, в шестой группе - 6,33.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество синтезированных фрагментов мт ДНК в пятой группе (старые животные без стрессового воздействия) было больше в 2,3 раза, чем в первой группе (молодые животные без стрессового воздействия) (р 0,05); показатели второй группы (молодые животные со стрессовым воздействием) больше в 4,8 раза относительно первой группы (молодые животные без стрессового воздействия) (р 0,05). Показатели шестой группы (старые животные со стрессовым воздействием) были больше относительно пятой (старые животные без стрессового воздействия) в 1,3 раза (р 0,05).
Количество синтезированных фрагментов мт ДНК в третьей группе (зрелые животные без стрессового воздействия) было больше в 1,3 раза, чем в первой группе (молодые животные без стрессового воздействия) (р 0,05); показатели четвертой группы (зрелые животные со стрессовым воздействием) больше в 1,2 раза относительно третьей группы (зрелые животные без стрессового воздейст вия) (р 0,05).
Анализируя данные, полученные в эксперименте, можно сделать следующие выводы:
1. Различие показателей старых и молодых животных без стрессового воздействия (контрольные группы) говорит о большем количестве нарушений в геноме старых животных, что может являться следствием проявления активности апоптоза у старых животных [17,19].
2. Различие показателей кратности увеличения количества синтезированных фрагментов мт ДНК у животных после стрессового воздействия и их контрольными группами свидетельствует о том, что, вероятно прирост показателей у молодых животных после стрессового воздействия в большей степени обусловлен процессами некроза, так как степень реактивности к стрессу у них выше, чем у старых животных.
3. Больший процент повреждений мтДНК у молодых животных после иммобилизации относительно интактной группы может быть обусловлен выбросом стрессовых гормонов в ответ на экстремальное воздействие [157].
В качестве анализируемого биоматериала использовалась сыворотка крови. Контрольные группы формировались из животных тех же возрастных групп с стрессовым воздействием, но без лекарственной терапии. В эксперименте с каждым из препаратов были сформированы шесть групп животных: первая - молодые животные со стрессовым воздействием, вторая - молодые животные со стрессовым воздействием после 14 дневного курса терапии антиоксидантами, третья - зрелые животные со стрессовым воздействием, четвертая - зрелые животные со стрессовым воздействием после курса терапии фитоадаптогенами и антиоксидантами, пятая - старые животные со стрессовым воздействием, шестая - старые животные со стрессовым воздействием, после 14 дневного курса терапии фитоадаптогенами и антиоксидантами. В полученном материале анализировали количество синтезированных фрагментов мтДНК. Регистрацию вновь синтезированных фрагментов мтДНК в поли-меразной цепной реакции проводили с помощью включения радиоактивной метки (Н3-тимидин).
В качестве контрольных групп выступали животные соответствующих возрастных групп со стрессовым воздействием, но без фармакологического воздействия. В этих группах были следующие значения активности радиоактивной метки в ДНК: в группе молодых животных со стрессовым воздействием (первая группа) радиоактивность составила 7490,42± 590,17 Бк/Юнг (р 0,05); в группе зрелых животных со стрессовым воздействием (третья группа) включенная радиоактивность составила 2470,82± 115,81 Бк/Юнг (р 0,05); в группе старых животных со стрессовым воздействием (пятая группа) включенная радиоактивность составила 4934,06±435,57 Бк/Юнг (р 0,05). 100 Количество синтезированных фрагментов мт ДІЖ составило: в первой группе - 9,61; в третьей группе - 3,17; в пятой группе - 6,33.
После проведенной полимеразной цепной реакции с радиоактивной меткой в группе животных с воздействием экстракта родиолы розовой были получены следующие данные (таб. 4.2.1)
Среднее значение активности метки вновь синтезированных фрагментов ДНК в группе молодых животных со стрессовым воздействием и 14 дневной терапией экстрактом родиолы розовой (вторая группа) радиоактивность составила 6375,82±782,36 Бк/Юнг. В группе зрелых животных со стрессовым воздействием, получавших препарат родиолы розовой (четвертая группа) включенная радиоактивность составила 2018,74±238,14 Бк/Юнг. В группе старых животных со стрессовым воздействием на фоне предшествующей двухнедельной терапии родиолой розовой (шестая группа) включенная радиоактивность составила 3834,84±469,12 Бк/Юнг.
Количество синтезированных фрагментов мт ДНК составило: во второй группе - 8,18, в четвертой группе - 2,59, в шестой группе - 4,92.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество вновь синтезированных фрагментов мт ДНК во второй группе (молодые животные после стрессового воздействия, получавшие экстракт родиолы розовой) было меньше в 1,17 раза, чем в первой группе (молодые животные после стрессового воздействия без фармакотерапии) (р 0,05); показатели четвертой группы (зрелые животные со стрессовым воздействием и терапией родиолой розовой) меньше в 1,22 раза относительно третьей группы (зрелые животные после стрессового воздействия, но без фармакотерапии) (р 0,05). Показатели шестой группы (старые животные со стрессовым воздействием, получавшие экстракт родиолы розовой) были меньше относительно пятой (старые животные только с стрессовым воздействием) в 1,28 раза (р 0,05).
Исследование степени фрагментации митохондриальной ДНК у животных разных возрастных групп после профилактического курса фитоадаптогенами и антиоксидантами
Изменение интенсивности СРО липидов на фоне антиоксидантной терапии была выражена в большей степени у животных старших возрастных групп (значительное уменьшение эндогенной интоксикации, снижение интенсивности СРО липидов крови и повышение АОА), по отношению к молодым (Рис. 8). Этот факт говорит о геропрофилактическом действии антиоксидантных препаратов. При этом максимальное снижение интенсивности СРО наблюдалось в группах животных, получавших препараты витамина Е и родиолы розовой, что можно связать с мембраностабилизирующим и антигипоксическим действием этих препаратов [138, 194, 217].
Состояние СРО липидов крови молодых, зрелых и старых крыс после 14-дневного курса экстракта родиолы розовой на фоне иммобилизации Выявленные различия в степени активации СРО при экстремальном воздействии в исследуемых группах позволяют предполагать различные эффекты антиоксидантной терапии в различных возрастных группах и указывают на необходимость дифференцированного подхода в её назначении.
В изученной нами литературе не обнаружилось единой точки зрения на взаимоотношение процессов СРО и активности повреждений митохондри-ального генетического аппарата. В главе 4 рассматривались изменения в ми-тохондриальном геноме. Был проведен анализ изменений фрагментации мито-хондриальной ДНК у животных разных возрастных групп (молодых, зрелых и старых крыс). Выявлены различия изменений степени фрагментации митохон-дриальной ДНК у интактных животных в соответствии с возрастом: так максимальные повреждения митохондриального генома (судили по степени фрагментации мтДНК) наблюдались у старых животных, когда как минимальные показатели фрагментации мтДНК наблюдались у молодых крыс, что объясняется большей активностью системы репарации генома (Рис. 9). Большая степень фрагментации мтДНК является косвенным признаком большей активности процессов апоптоза у старых животных [17, 19].
Фрагментация мтДНК у крыс разного возраста Иммобилизационный стресс в эксперименте являлся провоцирующим фактором запуска механизмов повреждения генома митохондрий. Но результаты регистрации фрагментации мтДНК в трех возрастных группах были разно-направлены с результатами в тех же группах, но без стрессового влияния (Рис. 10). Так, степень фрагментации мтДНК у молодых животных была достоверно выше по сравнению с контролем, чем у старых животных. Вероятно, подобная картина объясняется особенностью реактивности молодых животных на экстремальный раздражитель, в отношении старых и зрелых, в связи с недостаточной сформированностью реакции адаптации нейроэндокринной системы. Поэтому увеличение степени нарушений в митохондриальном геноме можно связать с некротическим действием избытка стрессовых гормонов, выделяющих 117
Меньшая степень повреждений у старых животных после иммобилизации в сравнении с интактными животными того же возраста объясняется возрастной инволюцией нейроэндокринной системы. Характер степени повреждений у старых животных позволяет предположить, что они обусловлены активизацией процессов апоптоза в большей степени, нежели некротическим влиянием стрессовых гормонов [17, 117].
Хроническое воздействие антиоксидантных препаратов на животных с экспериментальным иммобилизационным стрессом характеризовалось существенными изменениями степени фрагментации мтДНК в сыворотке крови (Рис. 11). Достоверное снижение степени повреждений в геноме митохондрий позволяет говорить о геропрофилактическом действии антиоксидантных препаратов и фитоадаптогенов. Реакция антиоксидантной системы на иммобилизационный стресс выражалась снижением активности каталазы и пероксидазы крови. Выявленные патогенетические механизмы получили подтверждение при проведении коррекции антиоксидантными препаратами. В примененном нами режиме дозирования препараты способствовали снижению концентрации МДА плазмы, увеличению активности каталазы крови. Указанные метаболические механизмы действия антиоксидантов сочетались в протекторном действии по отношению к митохондриальному геному, выражавшемуся в снижении степени фрагментации мтДНК.
Снижение повреждений в мтДНК под действием антиоксидантных препаратов наблюдалось в большей степени в группе старых животных, при этом максимальное снижение фрагментации мтДНК наблюдалось в группах животных, получавших препараты витамина Е и родиолы розовой.
Исследование влияния экстремального воздействия в динамике на организм разного возраста позволили выявить меньшую устойчивость молодых крыс к надпороговому раздражителю: интенсивность процессов СРО и фрагментации мтДНК в крови была выше в группе молодых крыс относительно интактных в сравнении с крысами других возрастных групп. Этот факт может быть связан с большей степенью реактивности нейроэндокринной системы на внешнее воздействие, и несформированностью их компенсаторно-приспособительных процессов. Различие эффектов от препаратов в степени фрагментации мтДНК у лабораторных животных разных возрастных групп можно связать с различной выраженностью реакции СРО липидов у них в организме, это в свою очередь может быть обусловлено более узким диапазоном защитно-приспособительных механизмов (в частности, резерва антиоксидант-ной активности) у животных старого возраста [117, 149, 205].
