Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Резистентность американского веслоноса к действию природных и биотехнологических факторов и иммунологическая функция осетрообразных 8
1. Резистентность веслоноса в условиях естественного ареала и при искусственном воспроизводстве 9
2. Организация иммунной системы осетрооб-разных и ее изменчивость
Глава 2. Материал и методы исследований 27
Глава 3. Совершенствование методов оценки иммунологической реактивности веслоноса 34
1. Топография лимфоидных органов и их индексы 36
2. Модификация диффузно-гелевого метода определения лизоцима
3. Распределение гетерогемагглютининов и лизоцима у мальков и сеголетков 44
Глава 4. Изменение рыбоводных и иммунологических показателей при промышленном выращивании веслоноса 53
1. Характеристика рыбоводных и иммунологических показателей у производителей и потомства на ранних стадиях развития 54
2. Влияние возраста и сезонности на уровень гуморальных иммунологических факторов 62
Глава 5. Влияние некоторых технологических факторов на выживаемость и иммунологический статус веслоноса 90
1. Критические значения рН для разных возрастных групп и изменение реактивности в условиях повышения рН 91
2. Оценка действия антипаразитарного средства фиолетового К на состояние веслоноса на первом году жизни 101
Заключение 116
Выводы и практические рекомендации 122
Литература 124
- Организация иммунной системы осетрооб-разных и ее изменчивость
- Модификация диффузно-гелевого метода определения лизоцима
- Влияние возраста и сезонности на уровень гуморальных иммунологических факторов
- Оценка действия антипаразитарного средства фиолетового К на состояние веслоноса на первом году жизни
Введение к работе
Актуальность исследования. Разведение ценных пород рыб,* к которым относятся осетровые, представляет большой интерес для рыбного хозяйства страны. Современная аквакультура связана с воздействием на организм разнообразных факторов интенсификации: химических компонентов водной среды, механических стресс факторов и др. Изучение реагирования организма рыб на указанные факторы, возникающих отклонений деятельности физиологических систем и оценка их рыбоводного значения являются актуальными задачами при культивировании нового объекта, представителя осетрообразных -веслоноса. Организация воспроизводства веслоноса как объекта ак-вакультуры требует разработки систем контроля его важнейших физиологических функций и способов их направленного регулирования.
Одной из важнейших сторон деятельности организма является резистентность к воздействию токсических агентов, физических параметров среды обитания и т.д. Достаточный уровень резистентности организма к воздействию факторов среды обитания, способных нарушить жизненноважные функции, является обязательным условием воспроизводства вида. Эта устойчивость обусловлена, в основном, активностью иммунологических систем, мало изученных у веслоноса. В связи с этим методы иммунологического исследования веслоноса требуют дальнейшего совершенствования.
Цель и задачи работы. Цель настоящего исследования - оценка
резистентности и иммунологической реактивности промышленного ста
да американского веслоноса при воздействии природных и технологи
ческих факторов. Для решения указанной цели ставились следую
щие задачи:
анализ и обобщение сведений по резистентности веслоноса к факторам среды обитания и иммунологической реактивности осетрообразных;
совершенствование методов оценки иммунологического статуса веслоноса и их применение в условиях производства;
рыбоводная и иммунологическая характеристика состояния стада веслоноса и условиях промышленного хозяйства;
изучение изменчивости гуморальных факторов иммунитета в зависимости от возраста рыб и сезона обследования;
оценка влияния на выживаемость и иммунологическую реактивность веслоноса некоторых химических воздействий, связанных с искусственным воспроизводством.
Фактическим материал. IJ диссертации обоОщ'.'Н и іі|ю.шлліі:ііі|)о-ван материал наблюдений и опытов, проводимых автором совместно с сотрудниками лаборатории осстроводстоа и акклиматизации Всероссийского научно-исследовательского института пресноводного рыбного хозяйства (ВНИИПРХ) за период 1988-1994 гг. Работа проведена в рамках КЦП "Амур", в той ее части, которая посвящена новым объектам разведения, в частности, разработке технологии разведения веслоноса. При анализе и обобщении полученных данных использованы отечественные и зарубежные литературные источники.
Научная новизна. Впервые проведены иммунологические исследования в условиях искусственного воспроизводства. Получены новые данные по сравнительной оценке устойчивости различных возрастных групп веслоноса при промышленном разведении к двум видам химического воздействия, различающихся по природе и технологической принадлежности. Установлены пороговые летальные и сублетальные уровни воздействия концентрации водородных ионов в водной среде и лечебно-профилактического средства фиолетового К. Показано различное реагирование веслоноса в течение онтогенеза на испытанные воздействия. Найдены два гуморальных фактора иммунитета: естественные антитела (гемагглютинины) и лизоцим. Выявлено несколько уровней изменчивости иммунологической реактивности. Полученные данные по структуре иммунологической реактивности являются новым методологическим подходом при характеристике состояния систем резистентности веслоноса.
Практическая значимость. Полученные данные дополняют разработанную технологию промышленного разведения веслоноса и могут быть включены в соответствующие инструктивно-методические документы. Данные о сублетальном и летальном действии водной среды с высоким значением рН и лечебно-профилактического средства фиолетового К могут быть использованы при оценке ухудшения состояния веслоноса и его гибели. Разработана экономичная и более простая модификация диффузно-гелевого метода определения лизоцима.
Апробация. Результаты исследований, составляющих основу диссертации, обсуждались на заседаниях Ученого совета ВНИИПРХ, YIII научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992), 2 Международном симпозиуме по осетровым (Кострома, 1993), совещании "Развитие аквакультуры на внутренних водоемах" (Москва, 1995), Международном симпозиуме "Ресурсосберегающие технологии в аквакультуре" (Краснодар, 1996), Первом конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997), 1 российско-американском симпозиуме по аквакультуре и болезням рыб (Рыбное, 1998).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста.. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 173 наименования, в том числе 63 иностранных. В тексте 28 рисунков и 51 таблица.
Организация иммунной системы осетрооб-разных и ее изменчивость
Основные сведения об иммунной системе осетровых были получены исследованиями, проведенными под руководством В.И.Лукьяненко (1989). Они охватили широкий круг вопросов, преимущественно неспецифического ответа и выявили закономерности изменчивости иммунологической реактивности в ходе онтогенеза различных видов осетровых России. По сравнению с осетровыми изучение веслоноса, несмотря на знание механизма специфического ответа, крайне незначительно. Поэтому, учитывая систематическую близость Acipenseridae и Polyodontidae, можно предположить, что их иммунологическая реактивность имеет много общих черт. Исходя из этого предположения в настоящей главе прежде всего рассматриваются сведения об иммунологической функции осетровых, а затем приводятся имеющиеся данные по веслоносу.
Иммунологическая реактивность осетровых Основой специфического ответа на антигены у осетровых является лимфоидная ткань, сосредоточенная в переднем (головном) отделе почки, а также в перикардиальном органе (вентральная сторона сердца), селезенке, черепных хрящах. Лимфоидные элементы имеются в слизистой оболочке кишечника, печени, спиральной складке (Лукьяненко, 1971). В лимфоидной ткани хрящевых ганоидов (осетра, стерляди) встречается иммунокомпетентные клетки значительно чаще, чем у костистых рыб и в большем количестве.
В крови осетровых преобладают лимфоциты среди лейкоцитов: у русского осетра 62-82%, у севрюги 69-81%, у белуги 77-84% (по данным Г.А.Корниенко и Е.И.Свиридова, цит. по В.И.Лукьяненко, 1971). Помимо клеток в иммунологических реакциях участвуют различные молекулярные агенты, представленные, основными биохимическими классами: белками, углеводами и липидами. Отмечена высокая лабильность качественного и количественного состава белковых компонентов, отражающих изменение функционального состояния организма. При этом следует учитывать влияние различных факторов на организ-менном и надорганизменном уровне. У рыб рода Acipenser (осетр, севрюга, стерлядь) содержание гамма-глобулинов было примерно одинаковым, но выше по сравнению с белугой. Отмечены различия межпопу ляционные, но некоторые популяции оказались сходными. Значительную индивидуальную изменчивость нашли у всех видов, различия между особями были в 2-2,5 раза.
Большое значение для характеристики состояния иммунной системы имеют естественные (нормальные) антитела, присутствующие в организме в течение онтогенеза и способные реагировать с различными антигенами, включая внутривидовые. Сравнительный анализ ан-тиэритроцитарных антител у осетровых показал, что у осетра и севрюги отсутствуют антитела к другому виду, но ряд особей содержат антитела к эритроцитам стерляди. Возможно, что эти результаты связаны с большим отличием стерляди от двух других исследованных видов. Изучение естественных антител, не только антиэритроцитар-ных, но и антивирусных, антибактериальных и т.д., позволит судить об уровне подготовки иммунной системы к ответу на воздействие соответствующего агента и может быть использовано для оценки изменения общего состояния иммунной системы при природных и рыбоводных воздействиях.
Изучение значения характера антигена для развития иммунного ответа показало, что эритроциты человека 0(1) группы при 6-кратной иммунизации осетров вызывают отчетливое образование антител, в основном, в диапазоне 1:80-1:160 (Лукьяненко, 1971). Дальнейшие исследования выявили существование ареактивных особей, составивших 21% при температуре 24-27С. Немногочисленна группа рыб с максимальным титром антител.
Попытка усилить иммунную реакцию за счет развития памяти (анамнестической реакции) была предпринята при реиммунизации русского осетра эритроцитами человека. Несмотря на оптимальную температуру содержания рыб различий на первичный и вторичный ответ не выявили.
Развитие иммунного ответа и резистентность у позвоночных во многом связаны с феноменом фагоцитоза. По данным Е.И.Свиридова (цит. по Лукьяненко. 1971), при многократной иммунизации стерляди сальмонеллезной вакциной при пониженной температуре 9С фагоцитоз определяли in vivo. После вакцинации фагоцитарная реакция усилилась количественно и качественно.
В монографии В.И.Лукьяненко (1989) подробно изложены материалы по влиянию экологических факторов на неспецифические гуморальные факторы у осетровых. Максимальную активность комплемента наблюдали у северокаспийского осетра в июле-августе, а затем она к осени снижалась, отражая цикличность сезонных колебаний уровня фактора, его зависимость от метаболических систем организма рыб. У севрюги, волжской стерляди также наблюдали повышение титра комплемента от весны к лету. Иные результаты были получены при изучении белуги - более высокие уровни комплемента наблюдали поздней весной (май). Возможно, это было связано с другим регулирующим воздействием -посленерестовыми физиологическими процессами. Дальнейшие исследования показали, что в пред- и посленересто-вый период у осетровых происходила значительная перестройка обменных процессов.
Действие сезонных факторов охватывает, видимо, все организмы биотопа с определенными климато-географическими условиями. Сравнение северокаспийской и южнокаспийской популяции осетров показало, что в южном районе сезонные различия были меньше. Полученные данные показали значительное сходство в уровне и динамике комплемента у систематически близких видов. В отношении индивидуальной изменчивости результаты исследований оказались очень показательными: как осенью, так и весной диапазон индивидуальной изменчивости достигал 15-кратной величины и степень варьирования весной была больше.
У покатных осетровых рыб по сравнению с ходовыми отмечено резкое снижение активности комплемента, которое более четко проявилось у осетра. Среди покатных осетров уменьшалось число рыб с высоким уровнем комплемента и повышалось число рыб с низким. У севрюги различия между покатными и ходовыми особями были менее выраженными. У всех видов изменение уровня комплемента у самок было более существенным, чем у самцов, однако, в преднерестовый период у осетра эти различия отсутствовали, что свидетельствует о более глубокой перестройке организма самок после нереста.
Модификация диффузно-гелевого метода определения лизоцима
С целью совершенствования методов определения лизоцима были проведены исследования по комбинированному использования диффузного метода и метода серийных разведений в жидкой среде. Использование диффузного метода для рыб представляет интерес как для определения в окрашенных и мутнеющих средах, так и при необходимости испытывать неразведенный или малоразведенный материал.
Предлагаемая модификация использует положительные стороны диффузного метода (использование небольшого количества материала любого вида, визуальный учет) и метода разведения (простота). Его принцип заключается в локальном воздействии каждого разведения на гелевый столбик с индикаторным микрококком в лунке серологического планшета.
При отработке метода использована техника подготовки гелевой среды с микрококком, параметры инкубации реакционной среды и методы учета, применяемые при определении лизоцима у рыб известным диффузным методом (Вихман, 1975; Вихман, Генералова, 1991). Все технические приемы по разведению титруемого материала в планшетах и внесение ингредиентов проведены в соответствии с принятой методикой (Вихман и др., 1993).
Основным материалом для исследования служила сыворотка крови годовиков и двухлетков веслоноса. Первые эксперименты были посвящены разбору минимальных концентраций микрококка в агаровой и агарозной средах, пригодных для визуального учета в диапазоне 1,0-3,0 мг/мл. В первом опыте было изучено влияние на результат реакции вида геля и его концентрации, а также длительности эксплуатации при 37С (табл. 3).
Концентрация сухого порошка микрококка составила 1,5 мг/мл. В качестве источника лизоцима использовали сыворотку карпа. Можно видеть, что для определения данного фермента пригодны оба геля, агар и агароза в концентрациях, соответственно, 1,25-1,5% и 1,5%. Опыты проводили при экспозиции 3 и 6 ч. Второй вариант оказался наиболее эффективным.
В следующем опыте была проверена пригодность полученных в предыдущем опыте данных для титрования материала (сыворотки) вес-лоноса (табл. 4). Концентрация микрококка составила 1,5 мг/мл. В этом опыте подтвердили приемлемость использования агара и агарозы в концентрации 1,5%. Уменьшение концентрации агара (менее 1,5%) нежелательно, т.к. плотность среды и ее диффузионные свойства снижаются. Значительно улучшился учет реакции после 1-2-кратной отмывки геля по окончании экспозиции забуференным изотоническим раствором хлористого натрия, т.к. удалялись частицы из слоя материала над гелем и снижалась его окраска, если титруемый материал был окрашен. В этом опыте экспозиция была увеличена до 17 ч при 37С, что привело к увеличению чувствительности реакции.
В связи с неодинаковым качеством используемой массы индикаторного микроорганизма - М.lisodeicticus, необходимо было сравнить несколько партий препарата. Сухой препарат, применяемый нами, был изготовлен на предприятии "Биохимреактив" (г.Олайна, Латвия) . Данные такого опыта с сыворотками веслоноса представлены в табл. 5.
Опыт показал, что партии микрококка могут существенно различаться, а реакция лучше проявляется при экспозизии свыше 20 ч. В ходе отработки модификации гелевого метода было установле но, что для устранения микробного загрязнения поверхности геля может быть применено облучение УФ светом по принятому в микробиологии приему. Другой путь - внесение в жидкий агар водного раствора антисептика, например, 0,01% генцианвиолета. Окраска микрококка при этом улучшает учет реакции, повышая контрастность отрицательного результата. Следует также отметить, что при использовании любого нового ингредиента реакции необходимо провести предварительное сравнительное его испытание и определить эффективность и возможность использования.
Предложенная модификация диффузно-гелевого метода оформлена в виде методики (Генералова, Ситнова, 1993). Определение иммунологических факторов в организме связано с выполнением ряда условий, включая извлечение исследуемого образования, выделение активной фракции и установление уровня фактора. Полученные данные позволяют сравнить активность различных органов и использовать затем для оценки иммунологического статуса наиболее информативные показатели.
Для изучения распределения факторов резистентности в органах и тканях сеголетков веслоноса (генерация 1988 г.) определяли содержание гетерогемагглютининов в почке, селезенке, жабрах и сыворотке крови. В почке и селезенке отметили низкий уровень гемагг-лютининов. Учет реакции проводили двумя различными методами: по обратному титру и более чувствительному способу - по сумме крестов. Определение АЭЧ с помощью используемого в практической работе метода обратного титра показало наибольшее абсолютное и относительное количество фактора в жабрах (табл. 6,7).
Этот орган содержал и наибольшее количество АЭК, но агглютинины к эритроцитам кролика были обнаружены также и в сыворотке крови. Применение учета по сумме крестов позволило повысить чувствительность определения факторов и дополнило приведенные выше результаты. Установлено, что АЭЧ содержатся в небольшом количестве и в сыворотке, а АЭК у одной особи обнаружены в почке и селезенке.
Влияние возраста и сезонности на уровень гуморальных иммунологических факторов
В течение онтогенеза и перехода из одной возрастной рыбоводной группы в другую развиваются органо-тканевые образования, связанные с продуцированием иммунофизиологических факторов молекулярной и клеточной природы. Существенное изменение уровня реактивности показано у рыб, развивающихся в естественных условиях и при культивировании. Эти исследования были проведены, в основном, на лососевых, карповых и осетровых видах рыб.
Было установлено, что у мальков уже сформированы основные структуры иммунологических систем, развит тимус, гемопотическая ткань почки и селезенки. Появляется возможность определить содержание молекул и клеток в крови, содержание и качественная характеристика которых отражает интегральную активность органов и тканей. Применение индивидуальных меток позволило проследить изменчивость иммунологических факторов у отдельных рыб. Возможность прижизненного определения состояния рыб по активности крови позволила проводить сравнение различных возрастных и однотипных групп в различные годы выращивания. В литературе подобные данные по веслоносу не были найдены.
В первых опытах были исследованы две группы сеголетков в августе, октябре 1988 г. Определение двух видов гетерогемагглютини-нов показало, что в сыворотке сеголетков содержатся оба вида факторов, причем количество АЭК было выше у сеголетков с большей массой . В следующем сезоне было проведено сравнение уровня иммунологических факторов в сыворотке крови у сеголетков, содержащихся в различных места Краснодарского края: на уч. "Царина Поляна" и на Краснодарском СВК. Средняя масса и длина рыб с "Цариной Поляны" (63,5 г и 31 см) отличалась от сеголетков с СВК (328 г и 51 см). Уровень АЭК и лизоцима был невысоким (Of 16,0 усл.ед./мл). При сравнении обоих групп по АЭК у сеголетков с "Цариной Поляны" фактор был в 2 раза ниже, а лизоцим в 3, 7 раза выше, чем у сеголетков с СВК (рис. 8). У рыб большей массы, как и в предыдущем опыте, чаще встречались сеголетки с более высоким уровнем АЭК. Вместе с тем, содержание лизоцима в этой группе было ниже.
Также было проведено сравнение рыбоводных и иммунологических факторов у двухлетков с уч. "Царина Поляна" и Краснодарского СВК. Разница в массе рыбы и ее длине была незначительной: у двухлетков с уч. "Царина Поляна" эти параметры составляли 1,1 (0,9Н,4) кг и 75,3 (71,Of82,0) см, у двухлетков с СВК - 1,8 (l,4f2,3) кг и 80.6 (70,Of87,5) см. Содержание факторов также мало отличалось. Уровень АЭК у двухлетков с СВК был несколько выше - 10,9 (4 32) и 7,6 (4fl6) усл. ед./мл, а лизоцима, наоборот, немного ниже 3,9 (Of8) и 4,2 (Of16) усл.ед./мл, чем у двухлетков с уч."Царина Поляна". Ранее мы отмечали такую же тенденцию при сравнении сеголетков, выращенных на уч. "Царина Поляна" и СВК, но различие в со держании факторов было большим.
Оценка иммунологической реактивности сеголетков было продолжено на уч. "Горячий Ключ" осенью 1991 г. В 4 бассейна было посажено 120 экз. (5.10.91) при благоприятных условиях среды. Средняя масса составила 184 г, длина 45 см. Через 2 дня (7.10.91) у рыб обнаружили признаки заболевания: деформацию жаберных крышек, некроз брюшных плавников и припухлость в области их основания. При вскрытии кишечник оказался пустым, много желчи в пилорических придатках и кишечнике. Начался отход рыб (7%). Затем все сеголетки были пересажены в нерестовый пруд, в котором в последующие дни наблюдали большой отход рыбы и к 13.10.91 отход составил 67%. В это время были взяты пробы крови и определены АЭК и лизоцим. Больные рыбы с признаками неясного заболевания содержали большое количество лизоцима (рис. 9), что было связано, видимо, с реагированием на экстремальную ситуацию.
Более точное представление о характере и стабильности изменчивости реактивности могло дать изучение индивидуальных отклонений в уровне фактора, т.е. определение иммунограмм. С этой целью осенью 1991 г. у двухлетков брали дважды пробы крови с интервалом в 7 дней. Индивидуальное исследование изменения гуморальных факторов позволило отнести каждую особь к одному из трех функциональных типов: +реакция (стимуляция реактивности), -реакция (снижение реактивности), 0-реакция (отсутствие изменений) (рис. 10,11). состоянием было почти равным, а рыб с отрицательной реакцией - всего 7,5%. По содержанию лизоцима, наоборот, количество рыб с отрицательной динамикой было наибольшим, а нейтральное состояние вообще не зафиксировано. Выявление связи характера реагирования с массой и длиной рыб показало, что различные в функциональном отношении группы мало отличаются по массе и длине. Следует отметить большие колебания между рыбами по массе. Так, при определении АЭК +реакцию наблюдали у рыб с массой от 0, 59 до 1,64 кг, а 0-реакцию - от 0,66 до 1,82 кг (табл. 23).
В следующем опыте была прослежена динамика содержания иммунологических факторов путем троекратного взятия крови из хвостовой вены. Исследования позволили характеризовать динамику трех иммунофизиологических признаков в течение небольшого интервала времени (рис. 12). Общий характер реагирования на передержку был более однообразным при определении АЭЧ и у большинства рыб после повышения уровня фактора его содержание возвращалось к исходному. У рыб отмечали также повышение лизоцимной активности, которая не имела тенденци к снижению. В отношении АЭК ответ был очень разнообразным и включал как повышение, так и понижение его активности. Не было отмечено совпадения типа изменчивости по разным факторам у одной и той же особи, а также влияния на характер изменчивости массы рыб (табл. 24).
Оценка действия антипаразитарного средства фиолетового К на состояние веслоноса на первом году жизни
Препарат фиолетового К широко применяется в рыбоводной практике, т.к. обладает выраженным противопаразитарным действием. Он с успехом использоуется при разведении осетровых и веслоноса, особенно на ранних этапах онтогенеза (Ларцева, 1987; Мельченков, 1991). Вместе с тем, нет данных о влиянии фиолетового К на физиологические функции веслоноса. Представляет интерес также испытание более высоких (по сравнению с принятыми) концентраций, пытаясь повысить эффективность препарата, а также прогнозировать ситуацию при его передозировке. Поэтому на разных этапах выращивания рыб были испытаны две концентрации фиолетового К: близкая к используемой на практике (10 мг/л) и более высокая (30 мг/л).
Первые наблюдения за развивающейся икрой были проведены в лабораторных условиях в чашках Петри со ст.8 бластомеров и до вы-лупления при температуре 23С. Опыты проведены в 3-х повторнос-тях. Массовый выклев эмбрионов на 5-6 сут. наблюдали при обработ- ке красителем в концентрации 10 мг/л, хотя по выживаемости этот вариант занимает промежуточное положение (табл. 41,42). Уровень лизоцима в икре до постановки опыта был равен 37 усл.ед./мл. После проведения эксперимента содержание фактора понизилось при концентрациях 10 и 30 мг/л. В контроле этот показатель увеличился в несколько раз. Прослеживалась корреляция между средними показателями выживаемости и уровнем активности лизоцима. Опыты по воздействию фиолетового К на разных этапах развития трех групп полусибсов были продолжены в бассейнах. При обработке икры действие на уровень факторов обеих концентраций красителя по направленности и степени влияния, в основном, совпадало у всех групп потомства (табл. 43,44). У 7-суточных личинок наблюдали отчетливое повышение содержания лизоцима в обоих вариантах опыта по сравнению с более ранними стадиями. Одна из групп полусибсов значительно превосходила другие по выживаемости после обработке красителем, хотя по уровню факторов она мало отличалась от других групп (рис. 27).
Такой же опыт был поставлен еще раз, но только без контроля (не подвергнутая действию препарата икра), чтобы избежать гибели эмбрионов. Поэтому полученные результаты позволили сопоставить влияние двух концентраций фиолетового К. Результаты изменения иммунологических факторов представлены в табл. 45,46.
Изменение иммунологических факторов характеризовалось на ст. 31 снижением агглютининов и лизоцима по сравнению с неоплодот-воренной икрой. В дальнейшем у 7-дневных личинок обнаружено падение гемагглютининов к эритроцитам человека, повышение содержания лизоцима. Соответственно изменилось соотношение уровня агглютининов после оплодотворения в сторону преобладания агглютининов к эритроцитам кролика. Сопоставление количества факторов у всех групп эмбрионов выявило отличие в их иммунологическом статусе, за исключением содержания АЭК у 7-дневных личинок, у которых при воздействии 30 мг/л красителя уровень фактора не изменился.
Установлено, что самая низкая выживаемость была у личинок от двух самок: с самой высокой (12,4 кг) и самой низкой (10,0 кг) массой тела. Наиболее высокая выживаемость в пределах 27,4т82,3 % была у потомства от самок массой 10, 74-11,4 кг. В целом, выживаемость особей, обработанных красителем в концентрации 30 мг/л, была выше, за исключением потомства от самки N 2.
Таким образом, воздействие фиолетового К на самых ранних стадиях развития веслоноса не вызвало существенных изменений в содержании изученных гуморальных факторов, но привело к повышению выживаемости личинок. Наблюдаемые изменения реактивности были связаны с фазовыми колебаниями содержания иммунологических факторов в процессе онтогенеза. Повышенная концентрация 30 мг/л не оказывала токсического эффекта и обеспечивала более высокую выживаемость личинок. В последующих экспериментах изучали влияние красителя при выдерживании в нем особей более старших возрастов. Первые опыты касались обработки красителем 4-дневных личинок. При концентрации красителя 0,2 мг/л выживаемость составила 16%, а при 0,4 мг/л наблюдали полную гибель личинок через сутки. Изменение содержания факторов при воздействии красителя в дозе 0,2 мг/л представлено в табл. 48. По динамике уровня факторов отметили тенденцию к увеличению содержания АЭК и лизоцима по сравнению с 4-дневными личинками, однако статистический анализ не выявил различий между опытной и контрольной группой, так как уровень достоверности колебался в пределах 0,06т1,0 (при критическом значении 0,05). Данный опыт показал выраженное влияние красителя на выживаемость 4-дневных личинок, невозможное применение концентрации 0,4 мг/л и высокую смертность при 0,2 мг/л. Летальное действие фиолетового К не сопровождалось существенным изменением иммунологических факторов. Последующие опыты были направлены на изучение реагирования иммунологических систем при воздействии фиолетового К на сеголетков. Было проведено два опыта в 1988 и 1989 гг. Результаты первого опыта представлены в табл. 49. Учет результатов определения гемагглютининов провели по методу обратного титра. Для выявления достоверных различий между отдельными группами рыб был проведен статистический анализ материалов с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса. Было установлено, что между всеми исследованными группами отсутствует различие в содержании обоих видов гемагглютининов (Критерий Крускала-Уоллиса составил 0f3,3), хотя, судя по средним величинам, уровень АЭК в опытной группе был ниже, чем в контрольной группе YI (соответственно 0,75 и 1,19 усл.ед./мл). Опытные и контрольные группы были сопоставлены также между собой путем объединения групп с одинаковым воздействием красителя. И в этом случае не отмечено различия между опытом и контролем и между группами с разной концентрацией внесенного красителя (критерий Крускала-Уоллиса ОтЗ,6). У всех исследованных групп отмечали существенное различие между содержанием АЭК и АЭЧ (критерий Крускала-Уоллиса 10,4т29,3). Попытка более точного учета уровня гемагглютини-нов была предпринята с помощью другого метода - суммы крестов. Так количество положительных результатов при определении АЭЧ методом суммы крестов определили у 4 особей, а методом обратного титра - 36. Соответствующие данные при определении АЭК составили 83 и 96. Несмотря на эти различия активность групп статистически не различалась, за исключением групп I и II, между которыми выявлено достоверное различие по содержанию АЭК, учтенных методом крестов (критерий Крускала-Уоллиса равен 4,22 при критическом значении 3,84). В целом примененные концентрации красителя не оказали существенного влияния на уровень естественных гемагглюти-нинов. Во втором опыте была продолжена оценка влияния фиолетового К на сеголетков веслоноса по той же схеме. В сыворотке крови определяли количество АЭК в реакции методом обратного титра и лизоцим (табл. 50,51).
