Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. репродуктивно - респираторный синдром свиней 8
2.1. История открытия РРСС 8
2.1.1. РРСС в мире
2.1.2. РРСС в Российской Федерации и странах СНГ
2.2. Характеристика возбудителя РРСС 12
2.2.1 Штаммы вируса РРСС 13
2.2.2 Выделение и культивирование вируса РРСС 18
2.3. Патогенез заболевания и сохраняемость вируса в объектах внешней среды 20
2.4. Клинические признаки, патологоанатомические изменения
2.5. Методы диагностики РРСС 26
2.6. Иммунитет и специфическая профилактика 29
2.7. Экономический ущерб от РРСС 35
2.8. Заключение по обзору литературы 35
3. Собственные исследования 37
3.1. Материалы и методы исследований 37
3.1.1. Вирусы 37
3.1.2. Клеточные культуры 38
3.1.3. Подопытные животные 38
3.1.4. Питательные среды 38
3.1.5. Титрование вируса РРСС в клеточных культурах 39
3.1.6. Получение клеток АМС 39
3.1.7. Культивирование вируса РРСС в клеточных культурах 40
3.1.8. Реакция нейтрализации 41
3.1.9. ИФА 42
3.1.10. Статистическая обработка результатов исследований 45
3.2. Результаты собственных исследований 46
3.2.1. Анализ эпизоотической ситуации по РРСС в РФ
3.2.2. Выделение возбудителя РРСС из проб патологического материала 48
3.2.3. Культуральные свойства штамма «ОБ» вируса РРСС 51
3.2.4. Изучение иммунобиологических свойств штаммов «ОБ» и «NADC-8» вирусаРРСС 57
3.2.5. Получение диагностических препаратов на штамм «ОБ» РРСС.
3.2.5.1. Получение антигена вируса «ОБ» РРСС
3.2.5.2. Получение диагностических сывороток к вирусу «ОБ» РРСС. 62
3.2.6. Изучение антигенной активности экспериментальных образцов инактивированной эмульгированной вакцины против РРСС . 64
3.2.7. Изучение эффективности инактивированной вакцины против РРСС в производственном опыте
4. Обсуждение 71
5. Выводы 78
6. Практические предложения 79
7. Список литературы 80
8. Приложения
- Выделение и культивирование вируса РРСС
- Иммунитет и специфическая профилактика
- Выделение возбудителя РРСС из проб патологического материала
- Изучение антигенной активности экспериментальных образцов инактивированной эмульгированной вакцины против РРСС
Введение к работе
Актуальность темы. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - контагиозное заболевание свиней, характеризующееся нарушением функции воспроизводства у свиноматок, абортами, рождением мёртвых или слабых поросят с высокой смертностью. Массовые вспышки РРСС наносят большой экономический ущерб свиноводству (56, 67,94,131,159,164,217).
Впервые РРСС был зарегистрирован в конце 80-х гг. в хозяйствах США и Канады; в настоящее время он регистрируется практически во всех странах, включая Россию и страны СНГ (81,151). В Европе наибольшее распространение заболевание получило в середине 90-х гг.(69,71-75,205). В России и в некоторых других странах СНГ РРСС регистрируется с 1993 года (12,38).
Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Arterivirus семейства Arteriviridae. Впервые вирус РРСС был выделен в 1991 г. - штамм «Lelystad»; в последующем в США был выделен штамм вируса РРСС, получивший название VR-2332. Эти два штамма представляют два разных типа вируса РРСС: европейского и американского, которые значительно различаются между собой (28,105,167,168).
Вирус РРСС обладает иммуносупрессивными свойствами, что создает условия для возникновения вторичных вирусных или бактериальных инфекций (6, 30,37,39,56,84, 94,116).
Большие затруднения для исследователей и практических работников представляет наличие большого количества (более 400) штаммов РРСС, различающихся между собой по нуклеотидной последовательности, в серологических реакциях, а также по биологическим свойствам (154, 169).
В настоящее время в ряде стран основным средством борьбы с РРСС является специфическая профилактика, для которой применяются живые и инактивированные вакцины (2,5,6,41,132,152,165,185,187).
Следовательно, разработка отечественной инактивированной эмульгированной вакцины против РРСС на основе эпизоотического штамма, выделенного на территории РФ, применение которой позволит значительно улучшить эпизоотическую ситуацию по этому заболеванию в стране, является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью данных исследований являлось изучение биологических свойств штаммов вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и их использование в составе вакцинных и диагностических препаратов.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
изучить эпизоотическую ситуацию по РРСС в свиноводческих хозяйствах РФ;
выделить эпизоотический штамм вируса РРСС, циркулирующий в свиноводческих хозяйствах РФ;
изучить культуральные, антигенные, иммуногенные свойства различных штаммов вируса РРСС на культуре клеток, лабораторных животных и свиньях;
изготовить образцы диагностических препаратов для выявления антител к вирусу РРСС на основе выделенного штамма;
изучить иммуногенные свойства инактивированной эмульгированной вакцины против РРСС на основе выделенного штамма в лабораторных условиях и оценить ее эффективность в производственном опыте.
Научная новизна работы. Выделен штамм «ОБ» вируса РРСС, циркулирующий на территории РФ. Изучены иммунобиологические свойства выделенного штамма «ОБ» вируса РРСС в сравнении с американским штаммом «NADC-8» и эталонным европейским штаммом «Lelytstad». Определены оптимальные условия
культивирования, изучены имунногенная и антигенная активность штамма «ОБ» вируса РРСС.
На основе штамма «ОБ» вируса РРСС изготовлены экспериментальные серии инактивированной вакцины против РРСС, антигенность и иммуногенность которой испытана на лабораторных животных и свиньях.
Установлена эффективность биопрепарата в качестве средства специфической профилактики РРСС в неблагополучных свиноводческих хозяйствах РФ.
Практическая значимость исследований. Результаты исследований использованы при оформлении нормативной документации на производство и контроль инактивированной вакцины против РРСС, а также поливалентной вакцины, включающей антигены вируса болезни Ауески, возбудителей лептоспироза и парвовируса свиней.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на
Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях», г. Воронеж, 2002 г. и Международной научной конференции, посвященной 45-летию ВНИИЗЖ «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», г. Владимир, 2003г., а также заседаниях ученого совета при ФГУ ВГНКИ.
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликованы 3 научные работы.
Основные положения, выносимые на защиту.
- анализ эпизоотической ситуации по РРСС в свиноводческих хозяйствах РФ;
- выделение и изучение иммунобиологических свойств штамма «ОБ» вируса РРСС;
- получение новых диагностических препаратов для оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах и эффективности инактивированных вакцин на основе штамма «ОБ» вируса РРСС.
— изготовление и изучение иммуногенных свойств моновалентной вакцины против РРСС на основе штамма «ОБ» вируса РРСС;
Структура и объем диссертации.- Диссертация изложена на 102 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения. Список литературы включает 220 источников, в том числе 61 отечественных и 157 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 3 рисунками и 14 таблицами.
Исследования по диссертационной работе выполнены в ФГУ ВГНКИ и в НПО НАРВАК, г. Москва в 1999-2004 гг..
Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Т.И.Алиперу, профессору, д.в.н. Б.Г.Орлянкину, профессору, д.б.н. В.А.Сергееву, д.б.н. А.Д.Забережному, д.б.н. О.А.Верховскому, к.б.н. Т.В.Гребенниковой, к.б.н. М.И.Мусиенко за помощь при выполнении и написании диссертационной работы.
Выделение и культивирование вируса РРСС
Выделение вируса РРСС из патматериала больных и павших животных является довольно затруднительным (29-31). Обычно, плоды, и плаценты имеют микроскопические поражения, т.к. только несколько плодов инфицируются во время родов, и вирус разрушается в матке из-за фетального автолиза. Более того, инфицированные свиноматки могут абортировать при отсутствии инфекции в матке. Попытки идентифицировать РРСС антиген в фетальных тканях при помощи иммуногистохимии и ИФА, часто безуспешны.
Для выделения вируса РРСС необходимо отбирать средостенные, подчелюстные лимфоузлы, кровь, легкие, селезенку приблизительно от 3-5-абортированных плодов, либо от мертворожденных поросят. Для исследования пригоден также патматериал от поросят-отъемышей с респираторным синдромом. При этом автор отмечает, что напрямую выделить возбудитель РРСС из патматериала, ему не удалось. Для выделения вируса различные авторы рекомендуют предварительный пассаж путем интраназального заражения поросят Зсх недельного возраста 20%-н ой суспензией из легких и лимфоузлов, полученных от больных животных, подозреваемых в заражении РРСС. На 8-й день поросят забивали и из легких получали культуру АМС В отечественной и зарубежной литературе опубликовано немало сообщений различных авторов о попытках адаптации вируса РРСС к различным первичным и перевиваемым клеточным культурам. Наиболее чувствительными к вирусу РРСС являются первичная культура альвеолярных макрофагов свиней и клоновые варианты перевиваемой линии клеток МА-104: CL-2621 иМагс-145 (7,17,85,87,145,153).
Попытки культивировать вирус РРСС в первичных клеточных культурах из легкого, эпителия трахеи, почек, семенников, сердца, костного мозга и щитовидной железы свиньи, различных органов плодов крупного рогатого скота, фибробластов, эндотелия и печени кур и в куриных эмбрионах, а также в перевиваемых клеточных линиях свиной почки (РК-15, РК-2, SK-6), почки зеленой мартышки (Vero, CV-1), почки сирийского хомячка. (ВНК-21 \ почки собаки (MDCK) и почки кошки (CRFK) также не увенчались успехом (67,153,201,212).
Специфический цитопатический эффект в культуре АМС сопровождается округлением клеток, склеиванием и их быстрым лизисом к 1 -5дню. При культивировании вируса в клоновых вариантах клеток МА-104 и CL-2621 цитопатический эффект развивается медленнее на 48-120 час. после заражения. При этом ЦПД, вызываемое вирусом РРСС, носит такой же характер (82,145).
Из перевиваемой линии клеток наиболее пригодной оказалась культура клеток Маге-145, в которой вирус РРСС накапливался в высоких титрах (145). Североамериканские изоляты РРСС растут на обоих типах клеток. А большинство, если не все европейские изоляты размножаются лучше на АМС. Вакцинные вирусы размножаются в 100 -1000 раз меньше на АМС, чем на производных клеточной линии обезьяньей почки. Хотя данных недостаточно, но возможно, что клетки CL-2621 или Маге-145 используются вместо АМС, потому что выделение вакцинных вирусов лучше, чем полевых изолятов РРСС.
Для увеличения выхода вируса РРСС в культуре клеток Маге-145 А.П.Пономарев и сотр. (1997) предложили использовать роллерно-трубчатый метод. Культивирование при этом проводили в течение 96 часов (48).
В литературе появлялись сообщения о культивировании вируса РРСС в культурах клеток FL (43), ST (семенников свиньи) (179). Однако эти сообщения весьма ограниченны и требуют дальнейшего подтверждения.
Распространение болезни происходит, в основном, при прямом контакте инфицированных и неинфицированных свиней, обусловленных хозяйственной деятельностью свинофермы, т.е. источником возникновения заболевания всегда являлись свиньи, завезенные из неблагополучного по РРСС хозяйства (2,6,27,33,84,122,185). Патогенез РРСС основывается на инфицировании клеток вирусом и реплицировании в клетках моноцитарной/макрофагальной линии. Воздействие вируса на слизистую поверхность проявляется в виде виремии в течение 12 часов после инфицирования и антигенной идентификации в макрофагах, носовой слизи, легких и миндалинах. Свиноматки инфицируются посредством воздействия на слизистую носа или маточный эндометрий. Возбудитель также передается, по-видимому, через укусы насекомых.
Макрофаги внутри слизистой поверхности являются местом первичной репликации вируса, с распространением на региональную лимфоидную ткань и последовательно системно распространяется на макрофаги в многочисленные ткани и/или на моноциты.
Микроскопические поражения объясняются последовательному инфицированию макрофагов многочисленных тканей. Тип и степень поражения зависит от штамма вируса, возраста свиньи, инфицирования другими бактериальными или вирусными агентами, генетически составом хозяина и наличие факторов стресса в окружающей среде. Интерстициальная пневмония, миокардит, лимфаденопатия и артриты характеризуют микроскопические поражения в результате РРСС инфекции.
Иммунитет и специфическая профилактика
У животных, переболевших РРСС, формируется стойкий постинфекционный иммунитет, который зависит от штамма вируса, возраста животного, условий содержания и ряда многих других факторов (30,37,40, 56,81,146). По результатам некоторых исследований, были получены данные о том, что вакцинация против РРСС давала результат, и у животных вырабатывался иммунитет. При этом в сыворотках крови переболевших РРСС свиней образуются вирусспецифические антитела, и животные становятся устойчивыми к повторному заражению вирусом (30,56,94,199,218).
По данным Yoon и соавт (1995) при изучении гуморального иммунитета у поросят было установлено, что специфические антитела против вируса РРСС выявляются в серологических реакциях: ИФА на 9-13 дни, РИФ 9-11 день, иммунопероксидазным методом 5-9 день и в РН на 9-28 дни после экспериментального заражения. Максимальных титров они достигали через 4-5, 5-6, 4-9 и 10-11 недель после заражения, а исчезали на 158, 324, 137 и 356 сутки. Подобные результаты получили Houben S. at all (1995) (132, 215).
Установлено, что поросята, родившиеся от иммунных к РРСС свиноматок, вследствие колострального иммунитета, защищены от заражения вирусом до 20-30 дневного возраста (37,40,199).
Как уже упоминалось ранее, вирус РРСС обладает иммуносупрессивными свойствами, т.к. мишенями являются альвеолярные макрофаги, которые индуцируют образование антител. Установлено, что у инфицированных свиней снижается количество макрофагов, лимфоцитов и моноцитов, что создает предпосылки для возникновения вторичных вирусных или бактериальных инфекций (37,39,56,84,116).
Кроме того, вирус РРСС может изменять иммунный ответ животного, в частности у инфицированных поросят выработка антител на чужеродные антигены была выше по сравнению с контрольными, т.е. вирус РРСС стимулировал антиген специфический ответ у поросят (94,162).
Вируснейтрализующие антитела обнаруживаются на 10—18 недели в максимальном титре. Антитела персистируют в течение всей жизни откормочных свиней. Длительность антительного ответа у свиноматок и хряков не очень хорошо описана, так как большинство экспериментов были относительно короткие по продолжительности. Свиноматки, которые были серопозитивными, секретировали антитела и в молозиво. Неинфицированные поросята, рожденные от серопозитивных свиноматок, были серонегативными при рождении и приобретали антитела пассивно с молозивом. Предполагается, что антитела играют роль в защите от повторного инфицирования. Антитела на большинство протеинов вириона, включая нуклеокапсид ORF7, обол очечный гликопротеин ORF5, и интегральный мембранный протеин, закодированный в ORF6, также как и белковый продукт ORF 2, 3, 4 обнаруживаются с легкостью. Антитела к оболочечному гликопротеину нейтрализуют вирусную инфекционность, и иммунизация рекомбинантными белками с ORF 3,5 дает частичную защиту от инфекции. Антитела к нуклеокапсиду не нейтрализующие, так как протеин расположен не на поверхности вириона. Интересно, что антитела к ORF4, нейтрализуют инфекционность LV. Немного известно о клеточном иммунном ответе на вирус РРСС. Лимфоцитопения появляется временно на 3-9 день после инфицирования, как отличительный признак РРСС инфекции. Однако к 14 дню после инфицирования общее количество лимфоцитов в периферической крови становится нормальным. Роль клеточного иммунитета в устойчивости против вируса РРСС неизвестна, должно быть частично из-за трудности развития антигенно-специфической клеточной пролиферации главного комплекса гистосовместимости и цитотоксической реакции свиней. На сегодняшний день знания иммунологии РРСС недостаточно изучены. Гораздо больше вопросов, чем ответов относительно признаков протективного иммунного ответа. Они включают в себя влияние антител на развитие вирусной инфекции в макрофагах, существование и последствие РРСС-опосредованной иммуносупрессии и иммунологического ответа у поросят, рожденных с виремией. Ответы на эти вопросы будут важными для продолжение попыток контроля и профилактики РРСС. В настоящее время во многих странах мира для профилактики РРСС широко применяют живые и инактивированные вакцины (6,80,124,141,178,187,191,195). Однако, чтобы достигнуть наибольшего успеха, при разработке программы вакцинации необходимо учитывать ряд факторов. 1. Вакцинный вирус может в течение недели персистировать, и его персистенция сходна с таковой вирулентного вируса. 2. Вакцинный вирус может передаваться от вакцинированных животных невакцинированным. 3. Вакцинный вирус может проникать через плаценту и вызывать внутриутробную инфекцию. 4. Вакцинный вирус может персистировать у хряков и передаваться со спермой. 5. Вакцинно-индуцированный иммунитет развивается медленно. 6. Требуемое время для развития защитного иммунитета зависит от определенного штамма, т.к. иммунитет может развиваться быстрее и сохраняться более длительное время против гомологичных и антигенно-сходных штаммов, чем против гетерологичных штаммов РРСС. 7. Некоторые вакцинированные свиньи могут не вырабатывать антитела: против РРСС после вакцинации. 8. Вакцинация свиноматок, которая оценивается по сероконверсии, не может обуславливать отсутствие трансплацентарной передачи вируса. Многочисленные исследования показывают, что, несмотря на существенные антигенные различия между штаммами американской и европейской генетических групп, вакцина из американских штаммов предохраняла иммунизированных животных от заболевания после заражения как американским, так и европейским штаммами вируса РРСС (80,120). Однако Van Woensel и соавт. показали, что американский вакцинный штамм не обеспечивал полной защиты от заражения европейскими изолятами вируса РРСС (209,210). Широко известна живая вирусвакцина против РРСС фирмы "Ingelvac RespPRRS MLV" (США), эффективность которой установлена в полевых условиях; препарат применяют на североамериканском континенте в США и Канаде, странах Юго-Восточной Азии и Европы (Дания, Германия) (120,124,141,165,190).
Выделение возбудителя РРСС из проб патологического материала
С 1993 года РРСС официально зарегистрирован в России, и к настоящему времени наличие РРСС подтверждено во многих свиноводческих хозяйствах нашей страны. В 1999-2003 гг. были обследованы 16 свиноводческих хозяйств Новосибирской, Томской, Белгородской, Пермской, Нижегородской, Московской, Тверской, Омской областей и Алтайского края. В качестве критерия при анализе эпизоотической ситуации служило выявление специфического антигена и антител к вирусу РРСС, проводимое с помощью вирусологических, серологических методов, а также ПЦР. Кроме того, нами принималось во внимание наличие клинических признаков и патологоанатомических изменений в стадах животных. Результаты проведенной работы суммированы в таблице 1.
На основании таблицы можно сделать вывод, что заболевание распространено на обширной территории Российской Федерации: Центральном, Северо-западном, Приволжском, Уральском и Сибирском федеральных округах. При проведении клинических обследований в 8 хозяйствах были обнаружены характерные клинические признаки у поросят и наличие абортов на последних сроках супоросности у свиноматок. При і» патологоанатомическом вскрытии павших и вынужденно убитых поросят старше двухнедельного возраста практически у всех животных отмечали участки ателектаза, пневмонии и эмфиземы, значительное увеличение средостенных лимфоузлов, в почках — множественные точечные кровоизлияния. При постановке ПЦР в полученном патматериале в 11 хозяйствах был обнаружен геном вируса РРСС. С помощью иммуноферментного анализа в сыворотках крови свиней в 12 обследованных хозяйств были, выявлены специфические антитела к этому возбудителю, уровень которых был различным. В 5 случаях вирус РРСС был выделен из патматериала на АМС и идентифицирован методом ПЦР. В лабораторию средств специфической профилактики вирусных болезней НПО НАРВАК в 1999 году был доставлен патологический материал: средостенные лимфоузлы, селезенка, легкие, кровь, печень и другие органы из свинокомплекса «Омский бекон» Омской области, где была зарегистрирована вспышка заболевания среди новорожденных поросят. Заболевшие животные имели повышенную на 1,0-1,5С температуру тела, отказывались сосать молозиво. У поросят наблюдали поражения глаз. Наиболее типичным признаком являлась пневмония, которая выявлялась при вскрытии. Большинство поросят (до 60%) погибали в первые дни жизни. При патологоанатомическом исследовании изменения в одинаковой степени наблюдали в краниальных, средних и каудальных долях легкого. Альвеолярные перегородки были заметно утолщены, в просвете альвеол наблюдали скопление транссудата и клеточный детрит. В бронхах патологических изменений не наблюдали, хотя дыхательные пути были забиты слизью и отслоившимися клетками эпителия. У некоторых поросят і" наблюдали аномалии конечностей (недоразвитие копытцев, косолапость), недоразвитие затылочного отдела коры больших полушарий мозга, иногда отсутствие мозжечка, недоразвитие почек. Из доставленного патологического материала была приготовлена 20%-ная суспензия на среде Игла. Пассажи патологического материала на клеточных культурах Маге-145 и АМС результатов не дали положительных результатов: в течение 96 часов проявления ЦПД вируса не наблюдалось, в ПЦР не был выявлен геном вируса РРСС. Поэтому, с целью выделения вируса, нами был проведен предварительный пассаж на поросятах двухнедельного возраста, которых интраназально заражали суспензией из легких и лимфоузлов. На 7-й день после заражения поросят убили и провели сбор максимального количества макрофагов. Данным материалом была заражены культура АМС, полученная от здоровых поросят. Флаконы поместили в термостат при 37С и ежедневно просматривали под микроскопом, отмечая появление ЦПД. Специфический цитопатический эффект в культуре АМС появился на первые сутки культивирования и сопровождался округлением клеток, склеиванием и их лизисом к 5 дню. Полученный вирусный материал дважды замораживали и оттаивали, осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. и использовали в дальнейшей работе. Кроме того, параллельно проводили заражение культуры клеток Магс-145 и титрование выделенного изолята в этой культуре. Вирус размножался в клетках Маге-145, вызывая ЦПД уже на 2-е сутки культивирования. Характер ЦПД, вызываемый эпизоотическим штаммом, несколько отличался от действия вируса на АМС: клетки образовывали скопления шарообразных клеток, поднимающихся над монослоем. Затем многие клетки становились пикнотическими и частично отслаивались от стекла, однако, монослой полностью не разрушался. Методом ПЦР установлено, что геномная РНК эпизоотического изолята соответствует геному вируса РРСС европейского типа. Для подтверждения инфекционности выделенного агента проводили заражение подсвинков и морских свинок. Животным вводили вирусный агент внутримышечно в дозе 2-3 lgTIJZko.
Изучение антигенной активности экспериментальных образцов инактивированной эмульгированной вакцины против РРСС
Для получения гипериммунных сывороток к штамму «ОБ» РРСС использовались морские свинки массой 450-500 г., кролики массой 1,5-2,0 кг, а также подсвинки массой 10-15 кг, которым вводили соответственно по 5 10; 40-50 и 150-250 мкг антигена РРСС. В качестве стимулятора иммуногенеза для получения антисывороток использовался неполный адъювант Фрейнда (Дифко, США), органический адъювант сапонин (водный раствор) и масляный адъювант. Два первых препарата давно применяются в ветеринарии и широко известны. Перед введением антиген смешивали с адъювантами: антиген РРСС + 0,25мг/мл-5 мг/мл сапонина; 50% антигена РРСС + 50% неполного адъюванта Фрейнда; 30% антигена РРСС + 70% масляный адъювант. Для получения равномерной суспензии смесь антигена с масляным адъювантом тщательно смешивали с помощью электрического эмульгатора в течение 10 мин до образования равномерной эмульсии белого цвета. Животных иммунизировали внутримышечно, как правило, двукратно. Морским свинкам смесь антигена с адъювантом вводили в объеме 1,0 мл в заднюю конечность, кроликам - 2,0 мл в 2-3 точки задних конечностей, подсвинкам - 4 мл в область шеи. Введение вирусного антигена с адъювантом повторяли через 21 сутки. Через 2 недели после последней иммунизации у животных брали пробы крови, а полученную сыворотку » исследовали в ИФА на специфическую активность. При необходимости проводили 3-ю иммунизацию. При наличии в сыворотке крови специфических антител в высоком титре животных тотально обескровливали. Результаты этих опытов представлены в таблице 10. Из таблицы видно, во всех случаях наблюдали более выраженную иммуностимулирующую активность масляных адъювантов по сравнению с сапонином. Кроме того, следует отметить, что масляные адъюванты обладали низкой реактогенностью. Полученные вышеописанным способом серии диагностических сывороток от иммунизированных подсвинков использовали для комплектования диагностических наборов с целью выявления антител к вирусу РРСС методом ИФА.
Для изучения иммуногенной активности вакцины против РРСС на основе штамма «ОБ» были изготовлены экспериментальные образцы эмульгированной вакцины. Антигенную активность 4-х серий эмульгированной инактивированнои вакцины изучали на подсвинках и кроликах, которых иммунизировали опытными образцами вакцины против РРСС на основе штамма «ОБ» с последующим исследованием сывороток крови на наличие специфических антител. Для этих целей использовали реакцию нейтрализации с вирулентным штаммом «NADC-8» вируса РРСС (100ТЦЦ50/мл)иИФА. Испытуемый образец вакцины в объеме 1 мл вводили внутримышечно в область бедра пяти кроликам с живой массой 2-2,5 кг. Кровь от подопытных животных отбирали до введения вакцины и через 28 суток после иммунизации. Результаты исследования сывороток крови, отобранных от вакцинированных кроликов, приведены в таблице 11. Из данных приведенных в таблице, видно, что у всех серонегативных кроликов после иммунизации различными образцами вакцины через 28 суток в сыворотках крови выявлены вируснеитрализующие антитела, значение которых колебалось в пределах от 4,9 до 6,4 log 2. Иммуногенную активность вакцины определяли на подсвинках методом контрольного заражения. Для этого одним из образцов вакцины иммунизировали 3 подсвинков массой 20-25 кг, которым испытуемую вакцину вводили внутримышечно в объеме 2 мл. У всех подсвинков отбирали пробы крови до введения препарата и через 21 сутки после вакцинации, перед контрольным заражением сыворотки исследовали в ИФА. На 21-е сутки все вакцинированные и контрольные подсвинки были заражены внутрипульмонально вирулентным штаммом «NADC-8» вируса РРСС в дозе 6,0 ТЦД5о/МЛ. Все вакцинированные животные имели примерно одинаковый уровень антител в крови против вируса РРСС, при этом Ксв у них превышал 70%. В сыворотках крови контрольных (неиммунизированных) животных, а также у подсвинков до вакцинации, специфические антитела к вирусу РРСС не обнаружены. После заражения за животными вели постоянное клиническое наблюдение с ежедневным термометрированием и клиническими наблюдениями. Результаты этих опытов представлены в таблице 12. проявлений. - Результаты контрольного заражения показали, что все вакцинированные подсвинки оказались устойчивыми к штамму «NADC-8» вируса РРСС. Только у одного поросенка отмечали незначительное повышение температуры тела в первые сутки после внутрипульмонального введения вируса. Два контрольных подсвинка заболели с типичной клинической картиной РРСС: повышение температуры тела на 1-2С, отсутствие аппетита, угнетение, конъюнктивит и кашель. Дальнейшие опыты по определению антигенной активности вакцины против РРСС проводили в свиноводческих хозяйствах ЗАО «Шувалове» Костромской области и ЗАО «Кудряшовское» Новосибирской области. Вакцину применяли согласно разработанному в НПО НАРВАК «Наставлению по применению вакцины инактивированной эмульгированной против РРСС», вакцину вводили внутримышечно свиноматкам, поросятам (65-85 суток) и хрякам-производителям. От вакцинированных и контрольных животных через 2 месяца после иммунизации отбирали пробы крови. Сыворотки исследовали в ИФА и РН. Результаты исследований сывороток крови от вакцинированных и контрольных животных представлены в таблицах 13 и 14.
