Содержание к диссертации
Введение
II. Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации. 8
III. Дифференциальное окрашивание хромосом. 21
1. Q-дифференциальное окрашивание (Q - бэндинг). 21
2. С-бэндинг. Гетерохроматин. 36
3. G-бэндинг 48
4. R-и Т-окрашивание. 51
5. Окрашивание серебром - ЯОР (М(Ж)-бэндинг. 52
6. Метод N-дифференциального окрашивания хромосом. 53
7. Cd- и Kt- окрашивание. 54
8. Высокоразрешающий бэндинг. 56
9. Нуклеазный бэндинг. 57
10. Выявление сестринских хроматидных обменов . 60
11. F-бэндинг 62
12. Ну-бэндинг. 63
13. Флуорохромирование препаратов хромосом красителями, специфичными для AT и ГЦ пар оснований.
14. Итоговые замечания по рассмотрению дифференциального окрашивания хромосом.
15. Молекулярные механизмы дифференциального окрашивания и природа бэндов.
IV. Другие методы хромосомного анализа. 81
1. Методы гибридизации in situ. 81
2. Микродиссекция хромосом и их отдельных участков . 87
3. Методы анализа изображений для цитогепетического анализа и физического картирования.
V. Некоторые проблемы, решаемые с помощью хромосомного анализа
1. Видообразование и хромосомный анализ.
2. Исследование хромосом растений с помощью методов дифференциального окрашивания.
3. Исследования хромосом растений, проводимые в Лаборатории функциональной морфологии хромосом института Молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.
VI. Заключение.
VII. Выводы.
VIII. Библиография.
- Выявление сестринских хроматидных обменов
- Микродиссекция хромосом и их отдельных участков
- Исследование хромосом растений с помощью методов дифференциального окрашивания.
Введение к работе
Хромосомный анализ - мощный инструмент генетики и молекулярной биологии, направленный на изучение генома. Его история насчитывает свыше ста лет - с тех пор, как В. Флемминг в 1879 году впервые наблюдал продольное расщепление хромосом при делении клетки аксолотля. В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны у множества самых разнообразных объектов как животного, так и растительного происхождения. Достигнутые успехи определялись в первую очередь совершенствованием оборудования и методик приготовления хромосомных препаратов. Первостепенное значение имело развитие техники микроскопирования и усовершенствование самих микроскопов. Естественно, что в течение всего этого времени неоднократно предпринимались попытки рассмотрения истории хромосомного анализа и определения его места в биологии и медицине (С.Г.Навашин, 1916, 1921; Левицкий, 1931; White, 1978; Дарлингтон, Ла Кур, 1980; Восток, Самнер, 1981; Прокофьева-Бельговская, 1986; Hsu 1992, 1995).
Хромосомный анализ является органической частью геномного анализа. Впервые термин «геном» был предложен в 1920 году Г. Винклером (Winkler, 1920) для обозначения гаплоидного набора хромосом данного вида. Естественно, что на этом этапе понятия хромосомного и геномного анализа практически совпадали. По мере развития генетики и молекулярной биологии понятие геномного анализа претерпевало значительные изменения. Геномный анализ включает в себя много разделов в зависимости от методов исследования. Так в цитогенетике растений традиционно под геномным анализом подразумевалось исследование филогенетического родства видов и определение геномного состава полиплоидов в пределах родственных систематических групп на основе анализа конъюгации хромосом в мейозе гибридов (Rosenberg, 1909). На современном этапе термин «геномный анализ» используется в более широком смысле, он также подразумевает, в первую очередь, выявление первичной структуры генома, т.е. определение последовательностей всех составляющих его нуклсотидов; включает в себя установление происхождения видов и оценку генетического родства геномов, иа основании анализа различных классов уникальных и повторяющихся последовательностей ДНК, структуры хромосом и сравнительного генетического картирования, структуры генов и спейсерных последовательностей (Friebe, Gill, 1996).
Последние достижения в геномном анализе неразрывно связаны с использованием и развитием методов молекулярной биологии: различные варианты амплификации ДНК (RFLP, PCR и др.) и цитологических подходов (дифференциальное окрашивание хромосом и гибридизация in situ, сравнение структуры геномов с легко изменяющимися (полиморфными) участками). Понятно, что ни один из вышеперечисленных методов не является всеобъемлющим и безошибочным. Эффективность методов определяется степенью, в которой они решают поставленные задачи, в частности характеризуют прямо или опосредованно сходство ДНК между видами. Несмотря на все эти достижения хромосомный анализ остается крайне важной, а в отношении некоторых объектов основной частью геномного анализа.
Традиционно хромосомный анализ начинается с установления числа хромосом и определение их размеров и морфологии (центромерный индекс, наличие и положение вторичных перетяжек). Впоследствии эти подходы были дополнены хромосомным бэндингом и гибридизацией in situ для анализа не только митотических, но и мейотических хромосом. Помимо этого методы геномного анализа включают в себя анализ мейотическои коныогации хромосом в гибридах, микроспектрофотометрию окрашенных по Фельгену препаратов, проточную цитометрию, сравнительное картирование ядерного, пластидного и митохондриального геномов, микродиссекцию и микроклонирование, системы компьютерного анализа изображения.
Представляет интерес соотношение понятий хромосомный анализ и кариология. В строгом смысле кариология - это наука о ядре, т.е. понятие более широкое, чем хромосомный анализ. Однако некоторьши авторами (White, 1978; Воронцов, 1980) эти понятия практически отождествляются. Хромосомный анализ - составная часть кариологического анализа - проводится с помощью арсенала различных методов. По мерс появления новых методов расширяются возможности и эффективность хромосомного анализа.
Хромосомный анализ начал формироваться давно. На каждом этапе создания новых технологий, используемых в нем, хромосомный анализ определялся по-разному. Поначалу он представлял собой описание морфологии хромосом для целей ботаники, зоологии и медицины. В дальнейшем он расширился за счет появления новых методов анализа и увеличения числа исследуемых объектов.
В настоящее время хромосомный анализ - это не просто описание кариотипа, а изучение хромосом с помощью комплекса методов, позволяющих получать разностороннюю информацию об изучаемом объекте. Наиболее интенсивно развиваются исследования в тех областях, где они могут быстро приносить практическую пользу (медицинская цитогенетика, включая пренатальную диагностику наследственных заболеваний, селекция новых сортов растений и пород животных).
В то же время, последнее десятилетие ознаменовалось стремительным прорывом в развитии науки, связанным с расшифровкой генома человека и ряда других видов животных, растений и микроорганизмов. Таким образом, созданные ранее классификации хромосомного анализа по ряду объективных причин не могли охватить достижений молекулярной биологии последних лет. С другой стороны, прогресс в определении первичной структуры генома лег в основу создания принципиально новых методов и подходов к изучению хромосом. В связи с перечисленными фактами, назрела насущная необходимость пересмотра истории хромосомного анализа в свете современных представлений и определения его места в биологической науке сегодняшнего дня. Это и послужило целью диссертационной работы.
Цель работы заключается в рассмотрении истории хромосомного анализа с учетом достигаутого прогресса в исследованиях геномов, выделении отдельных периодов его развития и определении наиболее перспективных направлений, конкретно в решении следующих задач:
- описании ключевых этапов развития хромосомного анализа за весь период его существования;
- рассмотрении основных методов исследования хромосом, характеристики наиболее широко используемых их модификаций, описании истории создания и области применения;
- определении места и роли хромосомного анализа в геномную эру; выделении основных этапов развития хромосомного анализа.
II. Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации.
Различными авторами предпринимались попытки рассмотрения истории хромосомного анализа (White, 1978; Дарлингтон, Ла Кур, 1980; Босток , Самнер, 1981; Прокофьева-Бельговская, 1986; Hsu 1992, 1995). Наиболее полную классификацию этапов его развития предложил известный австралийский цитогенетик и эволюционист М. Дж. Уайт в 1978 году (White, 1978). Он выделил шесть этапов развития кариологии:
? альфа-кариология - определение числа и размеров хромосом;
? бэта-кариология - детализация признаков кариотипа: определение относительной длины плеч хромосом, положения центромеры, выявление половых хромосом и пр.;
? гамма-кариология - идентификация специфических районов хромосом с использованием методов дифференциальной окраски;
? дельта-кариология - определение локализации сателлитной ДНК, ядрышкообразующих районов (рДНК), локусов, содержащих гены бБ-рибосомной РНК;
? эпсилон- и зета-кариологии - выявление активно работающих участков на хромосомах типа «ламповых щеток» и политенных хромосомах, что позволяет получить детальные карты строения и функционирования хромосом.
Классификация Уайта получила широкую известность в нашей стране благодаря ее пропаганде в работах Н.Н. Воронцова (Воронцов, 1980; 1986). Необходимо отметить, что эта классификация достаточно условна, поскольку она исторически не выдержана, и ряд направлений хромосомного анализа, выделенных им в качестве самостоятельных, развивался параллельно. Так исторически эпсилон- и зета-кариологии начали активно развиваться раньше дельта-кариологии, возникающей и активно развивающейся на наших глазах. Если быть точными, то Уайт описывает не этапы развития кариологии, а разделы хромосомного анализа. А конкретнее - вышеперечисленные этапы развития кариологии представляют собой детализацию наших знаний о хромосомах и кариотипе в целом. Поэтому классификация Уайта выглядит несколько однобокой. Она основана скорее на методических подходах изучения хромосом, и при этом в нее по историческим причинам не входят новейшие методы. Однако она позволяет судить по крайней мере о некоторых важных этапах развития учения о хромосомах.
Новейшая, молекулярная, кариология зарождается лишь сейчас; ее задачи - изучение молекулярной организации и функционирования хромосом. Современный хромосомный анализ - понятие достаточно условное. Так при исследовании хромосом человека анализ позволяет судить о множестве черт и особенностей хромосом: содержании в них ДНК, рисунке их окрашивания, наличии перестроек вплоть до выявления генных кластеров и индивидуальных генов. В то же время для многих организмов, в том числе для водорослей, мхов, грибов, лишайников большой проблемой является само определение числа хромосом. На самом примитивном уровне остается пока и изучение хромосом многих простейших, грибов, некоторых групп беспозвоночных и многих групп высших растений (Bennett, 1998). Между тем, по классификации Уайта, этот этап можно отнести к альфа - кариологии, которая зародилась еще в конце 19 века.
С 1831 года, т.е. с момента открытия английским ботаником Робертом Броуном клеточного ядра, началось активное изучение как его химического состава, так и функционального значения отдельных структур и компонентов. Уже в 1868 году Мишер выделил ДНК, а несколько позднее Коссель открыл гистоны. Параллельно шло развитие генетики (работы не были связаны с наблюдением хромосом). Несмотря на то, что в 1865 году была опубликована фундаментальная работа Грегора Менделя, в которой он сформулировал законы наследственности, свое официальное начало генетика ведет с 1900 года после переоткрытия законов Менделя тремя исследователями: Гуго Де Фризом, Карлом Корренсом и Эрихом Чермаком.
В конце 70-х гг. XIX века поведение хромосом изучалось многими исследователями, но наиболее значительный вклад в эту область знания внесли Э. Страсбургер и В. Флемминг. В 1880 году Флемминг наблюдал продольное расщепление хромосом при делении клетки, а двумя годами позже он предложил термин «митоз». В принципе этот период развития хромосомного анализа ознаменовался установлением самого факта существования хромосом и их описания. В 1903 - 1904 гг. В. Сэттон и Т. Бовери (Sutton, 1903; Boveri, 1904) показати, что именно хромосомы являются материальными носителями менделевских факторов наследственности. С этого времени начался новый этап изучения хромосом.
В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны у множества других объектов. Достигнутые успехи определялись совершенствованием оборудования и методик приготовления хромосомных препаратов. Важнейшее значение имело развитие методов микроскопирования и усовершенствование самих микроскопов.
Среди важнейших этапов развития микроскопических методов Дарлингтон и Ла Кур (Дарлингтон, Ла Кур, 1980) выделяют создание: И водоиммерсионных объективов (1850г.) Ш осветителя для микроскопа (1873г., Э. Аббе - ведущий конструктор фирмы Карл Цейсе) И масляной иммерсии и масляноиммерсиониого объектива (1878г., Э. Аббе) Ш апохроматического объектива (1886г.)
Таким образом к началу 20 века было завершено создание светооптического микроскопа, позволяющего достигнуть разрешения до 0.2 мкм. Последующие сто лет стали веком совершенствования микроскопической техники, в частности были созданы:
? объективы с широким полем зрения;
? фазово-контрастная (Mickel, 1941; Burch, Stock, 1942) и электронная микроскопия;
? создание и развитие флуоресцентной микроскопии;
? использование электронной микроскопии для исследования политенных хромосом.
? создание и активное использование компьютерных систем анализа изображения;
Параллельно совершенствовались методики приготовления препаратов. В 60 - 80-е гг. ХІХв. были подобраны и внедрены в практику консервирующие жидкости (фиксаторы) и клеточные красители, создание которых продолжается до сих пор.
Следует отметить, что именно разработка новых способов приготовления препаратов имела ключевое значение для развития хромосомного анализа. Долгое время хромосомы как животных, так и растений изучали на тканевых срезах. Такие препараты содержали в основном разрушенные митозы, хромосомы накладывались одна на другую, образуя клубки, плохо поддающиеся анализу. Технологии, основанные на использовании суспензий клеток (человек и животные) или приготовлении давленых препаратов (растения) позволили преодолеть эти трудности. Позже для исследования хромосом стали применять метод раскапывания клеточной суспензии. При этом дополнительно стали использовать протеолитические ферменты - трипсин, коллагеназу или гиалуронидазу - с целью дезинтеграции образцов тканей и получения суспензии, состоящей из отдельных клеток (Макгрегор, Варли, 1986). Параллельно с этим изучали нетипичные хромосомы: в 1881 году Бальбиани описал политенные хромосомы слюнных желез личинок двукрылых (Chironomus), а Флемминг, исследуя ооциты аксолотля, обнаружил хромосомы типа ламповых щеток. В течение последующих 50-70 лет в основном совершенствовались лишь методики выделения таких хромосом из ядер. Т.Х. Морган С именем Т.Х. Моргана и его школы связан совершенно новый этап развития генетики - установлена связь учения о хромосомах с генетикой.
Представления о линейном расположении генов, об их сцеплении и кроссинговсре позволили предсказывать многочисленные явления. Картина внутреннего строения хромосом, предложенная Морганом, стала одним из главных обобщений биологии, превратилась в неопровержимый факт, подтвержденный всем развитием генетики. Именно Морган, опытный экспериментатор, обратил внимание на незаменимые качества такого лабораторного объекта, как дрозофила (короткий жизненный цикл -11-12 дней, легкость и простота разведения). Такой объект требовался Моргану в опытах по получению искусственных мутаций (Morgan, 1907). Появившийся объект принес неожиданный успех не только Моргану и его «дрозофильной группе», но и стал незаменимым для всех генетиков впоследствии. Сейчас изучение политенных хромосом и хромосом типа ламповых щеток представляет собой отдельную область хромосомного анализа. Получены детальные карты строения и функционирования политенных хромосом слюнных желез дрозофилы, в том числе основанные на электронно-микроскопических фотографиях политенных хромосом, выделенных из клеток и растянутых с помощью микроманипулятора (Ананьев, Барский, 1985). с р Навашин.
В 20-30-е гг. XX в. прогресс хромосомного анализа определялся в основном изучением растительных объектов, сравнительная кариология растений резко опережала сравнительную кариологию животных. Этим она обязана трудам С.Г.Навашина (Навашин, 1910, 1911, 1912, 1914), Т. Сакамуры (Sakamura, 1915, 1920) и Г.А. Левицкого (Левицкий, Кузьмина, 1927; Lewitsky, Tron, 1930; Левицкий, 1931а, Левицкий, 1931). Наиболее интересные данные и теоретические выводы в этой области принадлежат С. Г. Навашину и его школе.
В 1912 году на заседании Императорской академии наук России С. Г. Навашин сделал сообщение, которое стало впоследствии знаменитым, «О диморфизме ядер в соматических клетках у Galtonia candicans» (семейство Liliaceae). На данном растительном объекте С. Г. Навашин впервые обнаружил наличие мельчайших постоянных придатков, присоединенных «ниточками» к двум хромосомам. Именно эти придатки и были названы Навашиным спутниками («satellites»). С.Г. Навашин показал, что эти тельца являются постоянной составной частью двух из четырех хромосом, т.к. при делении ядра они «расщепляются вместе с остальным телом хромосомы». Именно С. Г. Навашин впервые показал возможность различать хромосомы по особенностям их строения . А в 1916 году в юбилейном сборнике, посвященном К.А. Тимирязеву, вышла в свет работа С.Г. Навашина о внешних признаках внутренней организации хромосом (Навашин, 1916). Объектами исследования были хромосомы лилейных (рода Fritillaria и рода Galtonia). Работа иллюстрирована рис L Расчленение хромосом» у рисунками, уникальными по тонкости Fritillaria tenella. изображенных на них деталей для цитологической литературы того времени (рис. 1).
Большое значение в кариосистематике растений сыграли также труды другого классика науки в области цитогенетики Г.А. Левицкого (одного из наиболее выдающихся учеников академика С.Г. Навашина). Продолжая научное направление своего учителя, Г.А. Левицкий обогатил наши знания о строении и изменениях хромосом. Благодаря ему, русская школа в исследованиях морфологии хромосом стала всемирно известной, получив название «классической». Г.Л. Левицкий - автор первого - русского руководства по цитогенетике «Материальные основы наследственности» (Левицкий, 1924), по которому учились в 20-30-х годах ХХв. ОН наиболее тщательно для своего времени (1910-1913) изучил строение и размножение митохондрий (хондриосомразработав специальный фиксатор, позволивший установить детали микроскопической организации митохондрии и показать их преемственность путем деления (Прокофьева-Бельговская, 1980).
Г.А. Левицкий. Основная научная деятельность Г.Л. Левицкого была посвящена исследованиям морфологического строения хромосом. В 1931 году вышла в свет его работа «Морфология хромосом», в которой он предложил новую методику фиксации и окраски для выяснения особенностей строения хромосом культурных растений (ржи, ячменя, гороха, пшеницы, сахарной свеклы) и некоторых классических в цитологическом отношении растений (Najas, Muscari). Левицким было установлено, что открытое С.Г. Навашиным строение хромосом Galtonia candicans из двух плеч является общей закономерностью строения хромосом, основным принципом их организации. В круг интересов ученого входили вопросы систематики и эволюции (Левицкий, Кузьмина, 1927;
Lcvvitsky, Tron, 1930; Левицкий, 1931а). Г.А. Левицкий - один из основателей радиационной генетики растений (Левицкий, Араратян, 1931).
«Перед глазами цитолога, жившего до сих пор в атмосфере строгих и прочно установившихся внутриядерных соотношений, развертывается при исследовании рептгенизоваппых корешков непривычная и жуткая картина причудливых, поистине калейдоскопических преобразований «материальных носителей наследственности» хромосом, утративших свою обычную устойчивость», - так Левицкий описывает свои первые впечатления от увиденной им картины хромосом, подвергнутых действию рентгеновских лучей. Г.А. Левицкий ввел термин и развил учение о кариотипе (Левицкий, 1931), атермин «идиограмма» предложен его учителем С.Г. Навашиным (Навашин, 1921). Под «идиограммой» Навашин обозначил «совокупность метафазных хромосом в качестве элементов символа вида». В таком понимании термин не получил дальнейшего распространения. Г.А. Левицкий изменил его содержание и под «идиограммой» обозначил графическое изображение совокупности признаков хромосом (их длины, относительных размеров плеч, вторичного расчленения). В таком понимании термин «идиограмма» получил широкое распространение и стал достоянием цитологии (Прокофьева-Бельговская, 1980). В настоящее время под кариотипом подразумевается совокупность признаков, по которым можно идентифицировать данный хромосомный набор: число хромосом, их форма, определяемая прежде всего положением центромер, наличие вторичных перетяжек, L спутников,чередование эухроматиновых и гетерохроматиновых районов и т.д. Кариотип образно называют паспортом вида (Инге Вечтомов, 1989). Таким образом, хромосомы характеризуются длиной, положением в 7,0 3.0 1.7 10 Arm ratio (г) центромеры и наличием или отсутствием вторичных перетяжек и Рис.2. Классификация Левана. спутников. Предложено несколько систем классификаций хромосом, в основе которых лежит группировка по морфологическим (морфометрическим) признакам. Широкое (повсеместное) распространение получила классификация, в основу которой взята величина (г = L/S, где L- длина длинного плеча хромосомы, a S - короткого) соотношения плеч хромосомы (Levan et al., 1964;
AM system
ТАМ system
[Imai, 1975, 1976, 1991].
В 90-х гг. 20 века, взяв за отправную точку рис. 2). Данная
классификация достаточно произвольна,согласно ей хромосомы делятся на телоцентрические (Т), акроцентрические (А), субтелоцентрические (ST), субметацентричесткие (SM) и метацентрические (М).
Позже были предложены ТАМ (Imai, 1978; рис. 3) и AM (Imai, Crozier, 1980; рис. 3) классификации, основанные на не случайном местоположении центромеры (которое определяется путем соотношения короткого плеча -хромосомы к общей длине хромосомы гаплоидного набора) А М Т А м / 0,1 .6 С/2 Size of shod arms IS) Рис.3. ТАМ и AM классификация. sr 0.1 .6 С/2 С {—) Size of heterochromatlc short (Sh) or long (Lh) arms Size of euchromatfc short arms (S4) Рис.4. Модифицированная классификация ТАМ.
предположение о том, что ни одна из вышеупомянутых систем не может подойти для описания сложных образцов С-бэндинга эукариотических хромосом, была предложена модифицированная ТАМ классификация (Imai, 1991; рис. 4).
Короткое плечо хромосомы, длинное и общая (вся) длина хромосомы соответственно были обозначены S, L, С (от англ. Short, long, Chromosome) и C=S+L. Величины Sc, Le, Sh и Lh были предложены для обозначения I Ijt короткого и длинного плеча эукариотической хромосомы, а также для полностью гетерохроматических коротких и длинных плеч хромосомы. В Q результате хромосомы Д подразделили натри категории: 1. Хромосомы с Sc и Le. 2. Sh и Le или Se и Lh хромосомы. ! "N8 s S° L6 Ln h s6 С A Ам Ам Ам Ам І Mh H b Рис.5. E, EH, H хромосомы. 3. Sh и Lh хромосомы. Для упрощения терминологии эухроматические плечи (Se и Le) и гетерохроматические плечи (S и L ) были сокращены до Е и Н соответственно. И перечисленные выше три категории хромосом стали Е хромосомы, ЕН хромосомы и Н хромосомы соответственно (рис. 5). Многие виды растений имеют сходные хромосомы, которые невозможно различить при монохромном окрашивании (ацето-кармином, ацето-арсеином или окрашиванием по Фельгену) [Зурабишвили и др., 1974], что ограничивает применение кариотипического анализа. В этом случае используют анализ мейотических хромосом (мейоз моносомных или транслокационных линий, где хромосомы не образуют бивалентов и легко идентифицируются). Так в свое время были охарактеризованы хромосомы пшеницы, хлопка, табака и т.д. Данный подход до сих пор используется при анализе некоторых видов. Но уже в 30-40-х гг. XX века появились первые сведения о возможности изучения хромосом, основанные на неоднородности их окрашивания. В частности:
1) Выявляли так называемый холодовой гетерохроматин (Н-сегмснты). Под таковым подразумевали участки хромосомы некоторых видов растений и амфибий, обнаруживаемые с помощью окраски основными красителями как слабоокрашенные участки на метафазных хромосомах после охлаждения препаратов до температуры 0 - 3°С в течение 3-5 суток (Darlington, La Cour, 1940; Callan, 1942).
2) Обнаружили необычную степень дифференциации гетерохроматических участков хромосом Trillium, Tradescantia, Vicia, особенно вблизи центромеры, наблюдаемую при рентгеновском облучении в комбинации с холодовой обработкой (Darlington, La Cour, 1945; Kurabayashi, 1953).
3) Показано, что при обработке корешков растений солями тяжелых металлов в хромосомах проявляется неоднородное окрашивание (Элленгорн, 1940). В течение последних 30-ти лет, несмотря на появление отдельных публикаций, названные выше методы не получили широкого распространения в исследовательской практике.
С конца 50-х - начала 60-х годов фронт исследования хромосом и соответственно развитие хромосомного анализа переместились от растений к человеку и животным. Открытие, создание и совершенствование технологий хромосомного бэндинга в начале 70-х гг. 20 века снабдило цитогенетиков мощнейшим инструментом для идентификации как индивидуальных хромосом в целом, так и их частей, облегчив тем самьш процедуру анализа кариотипа (подробнее см. ниже).
Пора бурного развития цитогенетики человека, а затем и других млекопитающих приходится на 50-60-е гг. XX века. Благодаря ряду усовершенствований методик (использование в качестве материала культуры клеток, применению гипотонического раствора и колхицина [Hsu, 1952], фитагемагглютинина [Moorhead et al., 1960], приготовление тотальных препаратов, высушенных на воздухе - [Rothfels, Siminovich, 1958]) были выявлены структурные особенности аутосом и половых хромосом человека, определяемые их размерами, положением центромеры, наличием вторичных перетяжек и спутников. Как следствие, в 1956 году появилась работа Дж. Тио и Л. Левана (Tijo, Levan, 1956), в которой в культуре фибробластов легкого было впервые правильно определено число хромосом (46) человека. До этого момента исследователи находили у человека как 47 (Winiwarter, 1912), так и 48 хромосом (Painter, 1923). В 40-х гг. кариотип человека считали весьма неблагоприятным объектом для цитологического анализа из-за большого числа хромосом, тесного расположения в метафазах и трудности идентификации даже крупных хромосом. В результате в течение последующих 16 лет к этому вопросу почти не возвращались. Поэтому не удивительно, что открытие хромосомного числа 2п=46 у человека явилось полной неожиданностью для самих авторов: в 265 митозах, за исключением четырех, хромосомное число оказалось 46, а не ожидаемое 48. Дж. Тио и А. Леван дачи полный анаїиз кариотипа, установив в нем 20 хромосом с медианной или субмедианной центромерой, 20 хромосом с субтерминальной центромерой и 6 хромосом с терминальной центромерой.
С этого момента изучением хромосом человека занимались многочисленные исследовательские группы в разных странах мира. Полученные данные были обобщены на конференции по стандартизации хромосом человека, состоявшейся в Дэнвере (США) в 1960 г. В соответствие с рекомендациями этой конференции все хромосомы человека были разделены на 7 групп и обозначены буквами: А(1-3), В(4-5), С(6-12) + X, D(13-15), Е(16-18), F( 19-20) и G(21-22) +Y. Номенклатура оказалась почти универсальной и не изменялась (не считая минимальных модификаций) в течение 10 лет.
Важным вкладом в развитие цитогенетики человека стало сообщение о наличии 47 хромосом у больных болезнью Дауна (Down syndrome, позднее названный монголизм, Lejeune et al., 1958; опубликовано в янв. 1959) - трисомия по хромосоме G-группы (по 21 хромосоме). А 1960 году были опубликованы еще два сходных по механизму синдрома -трисомия по Е-группе (Edwards et al., 1960) и трисомия по D-группе (Patau et al., 1960).
Описание случаев необычного набора половых хромосом стало ключом к пониманию половой детерминации у человека. Индивиды с набором ХО оказались женщинами, а с ХХУ - мужчинами, т.е. Y хромосома отвечает за детерминацию пола (мужского). Эта ситуация оказалась диаметрально противоположна таковой у плодовой мушки Drosophila, где пол определяется балансом (соотношением) числа X хромосом и аутосом: ХО мухи - самцы, а ХХУ мухи - самки.
Значительным вкладом в цитогенетику млекопитающих стала гипотеза Мэри Лайн о сохранении активности в каждом организме и клетке лишь одной Х-хромосомы, предложенная в 1961 году (Lyon, 1961). Согласно этой гипотезе причиной мозаичного эффекта является инактивация одной из двух X хромосом на ранней эмбриональной стадии. У дрозофилы этот эффект был впервые продемонстрирован лишь в 1979 году (Henikoff, 1979).
Оперируя классификацией Уайта, этот этап развития хромосомного анализа можно условно отнести к бэта - кариологии. С конца 60-х годов можно очертить временные границы еще одного этапа развития хромосомного анализа, который соответствует гамма -кариологии по Уайту. Это появление методов дифференциальной окраски хромосом, позволившей выявлять специфические участки продольной дифференцированности хромосом.
Выявление сестринских хроматидных обменов
В отношении растительных объектов, число публикаций не столь велико (Schubert, Ricger, 1990; Schubert, 1990; Lozano et al., 1990; Frediani et al., 1987; было обнаружено, что обработка рестриктазами Mbol и Alul хромосом Vicia faba приводит к образованию 1-2 бэндов, аналогичных С-окрашиванию, на хромосому). Высказано предположение (Lozano et al., 1990), что устойчивость гетерохроматина ряда растений, например, представителей семейства лилейных {Allium sabvillosum, Muscari comosum), к воздействию рестриктаз может объясняться следующими причинами:
1) гетерохроматин растений имеет более высокую степень метилирования, чем животных, и это «маскирует» сайты распознавания для некоторых рестриктаз;
2) оптимальный размер экстрагируемых фрагментов из растительных хромосом меньше такового у животных;
3) в отличие от гетерохроматина животных, растительный гетерохроматин в основном недоступен рестриктазам из-за различной структуры и/или организации (хромосомы растений более конденсированы и содержат больше участков повторяющейся ДНК Greilhuber, 1977; Nagl, 1996) - а также некоторых различий в организации нитей хроматина растений и животных (Schweizer, 1979) - и различий в содержании определенных хромосомных белков (Commings et al., 1973).
10. Выявление сестринских хроматидных обменов. Первое описание сестринских хроматидных обменов (СХО) дано Тейлором (Taylor, 1958) на растительных хромосомах. В опытах этого исследователя клетки в течение одного цикла репликации выращивали на среде с тимидином, меченым тритием, а затем рост клеток продолжался на немеченой среде. Затем на радиоавтографах выявлялись митотические хромосомы, в которых меченой оказывалась лишь одна из сестринских хроматид. Иногда встречались хромосомы, в которых метках присутствовала в обеих хроматидах, хотя меченые участки не совпадали (следствие гомологичного обмена между сестринскими хроматидами - іМакгрсгор, Варли, 1986). С тех пор такие исследования многократно проводились на растительных и животных объектах (Oliveri, Brewen, 1966; Geard, Peacock, 1969 - конские бобы Vicia faba; Rommelaire et al., 1973 - китайский хомячок). Считается, что значительная часть таких обменов вызывается бэта-излучением используемого при радиоавтографии трития (Дарлингтон, Ла Кур, 1980).
Современные методы выявляют СХО без использования радиоактивных изотопов. Начало созданию этих методов положило исследование А.Ф. Захарова и др. (1972, 1974). Сестринские хроматиды в хромосомах клеток млекопитающих (китайский хомячок) имеют различный характер конденсации в метафазе после двух циклов репликации в присутствии 5-бромдезоксиуридина. В основе метода лежит выращивание клеток на протяжении двух циклов репликации ДНК в присутствии аналога тимидина - 5-бромурацилдезоксирибозида (БУДР). После двух циклов репликации в каждой хромосоме обе хроматиды должны содержать вместо тимидина БУДР, но в одной из хроматид БУДР будет входить в состав обеих цепей ДНК, а в другой - в состав только одной из двух цепей ДНК. При последующем окрашивании красителем Гимза хроматида, в которой БУДР содержит только одна цепь ДНК, окрашивается интенсивнее, чем другая сестринская хроматида (в которой БУДР содержат обе цепи ДНК) [Zakharov, Egolina, 1972]. Вместо красителя Гимза можно использовать флуоресцентный краситель Хёхст 33258, что также приводит к дифференциальному окрашиванию сестринских хроматид (Latt, 1973 - хромосомы человека). Флуоресценция, вызванная красителем Хёхст, нестойка и быстро исчезает на свету. В качестве флуорохрома можно использовать и акридиновый оранжевый (Репу, Wolff, 1974), но различие между хроматидами едва различимо, если не подсвечивть препарат возбуждающим светом, пропущенным через фильтр BG-12. Сейчас все чаще для выявления СХО после БУДР замещения используют комплексный метод «флуоресценция плюс краситель Гимза» (FPG) (Perry, Wolff, 1974; Макгрегор, Варли, 1986). На препаратах, окрашенных FPG способом, хромосомы напоминают одежду арлекинов (идет чередование в шахматном порядке темных и светлых участков по длине сестринских хроматид свидетельство многочисленных обменов между этими хроматидами), отсюда одно из названий этого метода «арлекин».
Механизм дифференциального окрашивания после БУДР - замещения объясняют тем, что негистоны прочнее связываются с ДНК, в которой тимидины замещены на БУДР, вследствие чего такая ДНК менее плотно упакована в хромосоме и окрашивается поэтому менее интенсивно (слабее) красителем Гимза (или флуоресцирует ярче с красителем Хёхст 33258) [Макгрегор, Варли, 1986]. До последнего времени эти эксперименты ограничивались клетками млекопитающих.
Существует множество других методов дифференциальной окраски, в частности F- и Ну- бэндинг. На хромосомах млекопитающих (мыши) было показано (Rodman, Tahiliani, 1973), что при окрашивании по Фёльгсну в хромосомах выявляются интенсивно (F+) и слабо (F-) окрашенные бэнды соответствующие AT- и GC- богатым районам гетерохроматина. Наличие F-бэндов описано и на растительных хромосомах (Yamasaki, 1973; D Amato et al., 1981; D Amato et al., 1981a,b; Marks, 1983). Тем не менее опыты по окрашиванию метафазных хромосом луковых Anemone blanda (анемона), Scilla siberica (пролеска), Fritillaria lanceolata (рябчик) не выявили прямой корреляции между AT- и GC- богатыми участками и F+ и F- бэндами соответственно (Friebe et al., 1993). Было высказано предположение, что F-бэнды отражают различия нуклеопротеидного состава различных участков хромосом (Marks, 1983). Интенсивность Фёльгсн - окрашивания напрямую связана с количеством апуриновой кислоты, возникающей и сохраняющейся in situ (Kjellstrand, 1980). После соответствующего гидролиза окрашивание по Фёльгену не влияет на результат хромосомного бэндинга. В отличие от F- бэндинга, С- и Q- дифференциальное окрашивание в основном дает лучшее разрешение. Поэтому F-метод не получил сколько-нибудь серьезного распространения. 12. Ну - бэндинг.
Чередование темных и светлых полос на хромосомах растений {Cypripedium debile, Trillium kamtschaticam) было описано после обработки препаратов смесью ацетоорсеин/горячая соляная кислота (Yamasaki, 1981; Greilhuber, 1973; 1974; 1975 - на Vicia /aba). На хромосомах Cypripedium гетерохроматические сегменты интенсивно окрашивались, тогда как районы эухроматина оставались неокрашенными. На хромосомах Trillium картина окрашивания была обратной (неокрашенный гетерохроматин и окрашенный эухроматин). Такое непостоянство в окраске объясняется видоспецифичной реакцией гетерохроматина и эухроматина к соляной кислоте в окрашиваемой среде. Результаты позволили сделать предположение о том, что гетерохроматиновые участки и хромоцентры Cypripedium ассоциированы с негистоновыми белками, тогда как эухроматиновые сегменты (как и два различных типа сегментов и хромоцентров Trillium) связаны с гистонами. Исходя из этого Ямасаки сделаа заключение, что у растений существуют два типа гетерохроматина - альфа- и бэта- гетерохроматин (как в гигантских хромосомах двукрылых Dipteran).
После фиксации препаратов хромосом конских бобов смесью этанол/ледяная уксусная к-та и 5 минутного гидролиза Ну-бэнды выявлялись в прицентромерных областях на обеих плечах хромосомы (метацентирическая SAT). Эти участки соответствовали темноокрашеппым С-бэндам и также (дифференциально) окрашивались Гимза после обработки мочевиной (Dobel et al., 1973) или репликативного бэндинга (Schubert, Rieger, 1990). 8ми минутный гидролиз и фиксация смесью метанол/ледяная уксусная к-та выявили Ну+ бэнды в районе вторичной перетяжки. Тем не менее темные С-окрашенные участки акроцептричных хромосом конских бобов Vicia /aba не окрашиваются после Ну-бэндинга, тем самым показывая, что последний лишь выявляет определенные типы конститутивного гетерохроматина. Было обнаружено, что ЛТ-богатые участки, ярко флуоресцирующие после обработки либо акрихином либо акрихин-ипритом, соответствуют Ну- -бэндам, тогда как Ну+ бэнды соответствуют Q- -бэндам (Greilhuber, 1973; 1974; 1975). Т.к. С-окрашивание выявляет большинство участков конститутивного гстерохроматина, тогда как лишь некоторые из них можно обнаружить при Ну-бэндинге, применение последней техники не нашло сколько-нибудь широкого распространения. Тем не менее, Ну-бэндинг можно использовать для выявления разных типов конститутивного гетерохроматина. Флуорохромирование препаратов хромосом красителями, специфичными для AT и ГЦ пар оснований.
Микродиссекция хромосом и их отдельных участков
Для проведения FISH на хромосомах необходимы маркеры, специфичные для конкретных участков определенных хромосом. Особую перспективность для создания маркеров открывает метод микродиссекции (Scalenghe et al., 1981), который позволяет вырезать под микроскопом с помощью микроманипулятора (или же путем выжигания лазером ненужной части препарата) необходимые участки хромосом и клонировать полученную ДНК. С помощью данного подхода получают хромосомо-, бэнд- и локус- специфические ДНК-библиотеки. Несомненным преимуществом метода является его применимость к различным объектам; для проведения микродиссекции достаточно небольшого количества материала (хромосома, плечо хромосомы или небольшой участок), скорость получения амплифицированной ДНК с помощью ПЦР во много раз превышает другие техники. Впервые метод был разработан применительно к политенным хромосомам дрозофилы (Scalenghe et al., 1981). В основу легло физическое вырезание участка хромосомы с помощью микроманиггулятора, выделение ДНК с последующей ее использованием. Слюнные железы Drosophila melanogaster фиксировали в 45% уксусной кислоте, и готовили раздавленные препараты. Необходимые хромосомы выделяли с помощью микроманипулятора. После экстракции, ДНК обрабатывали рестриктазой EcoRI, легировали в вектор и клонировали в фаге лямбда 641. В результате было получено 80 клонов. Клоны гибридизовали in situ с хромосомами дрозофилы. Их локализация совпала с вырезанным участком. Таким образом была доказана специфичность полученных ДНК клонов изучаемого региона.
С помощью метода микродиссекции были детально изучены политснные хромосомы двукрылых (Pirrotta et al., 1983a,b; Hennig et al., 1983; Walldorf et al., 1984; Press et al., 1985; Miklos et al., 1988; Yamamoto et al., 1989; Saunders et a., 1989), митотические хромосомы млекопитающих (Rohme et al., 1984; Fisher et al., 1985; Bates et al., 1986; Brockdorff et al., 1987; Weith et al., 1987; Greenfield et al., 1987; Bahary et al., 1993), растительные хромосомы (Sandery et al., 1991) и хромосомы типа «ламповых щеток» амфибий (Penrad-Mobayed et al., 1991).
Необходимым условием успешного использования метода микродиссекции является надежная идентификация под микроскопом диссектируемых хромосом или их участков. При этом необходимо избегать повреждений структуры ДНК, возникающих в процессе приготовления препаратов. Это достаточно легко в отношении крупных политенных хромосом, обладающих характерной морфологией, что делает возможным не использовать фиксацию и окрашивание.
Существует несколько способов идентификации и достаточно мелких хромосом млекопитающих на неокрашенных (дифференциально) метафазных пластинках. Так линия мышей, несущая Робертсоновскую транслокацию, позволяет идентифицировать хромосомы, т.к. все хромосомы мыши являются акроцентрическими, а перестроенные хромосомы отличаются морфологически (Rohme et al., 1984; Fisher et al., 1985; Tonjies et al., 1991; Bahary et al., 1993). Для хромосом человека использовались различные методы идентификации: например неокрашенную хромосому 2 легко выявляли благодаря созданному банку клонированных последовательностей ДНК короткого плеча хромосомы (Bates et al., 1986), а микродиссекцию длинного плеча хромосомы 7 проводили на метафазных хромосомах, приготовленных их культуры гибридных клеток человек-мышь, содержащей только хромосому 7 человека. Для сохранения необходимых свойств ДНК предлагались и новые методы фиксации хромосом (Kaiser et al., 1987; Richa and Lo, 1989). Параллельно с этим предпринимались попытки использования дифференциально окрашенных хромосом. В 1989 году описан метод микродиссекции на дифференциально окрашенных митофазных хромосомах человека (Ludecke et al., 1989). Помимо этого авторы предложили и новый метод вырезания участка хромосомы с помощью инвертированного микроскопа и микромапипулятора, что позволяло использовать большое увеличение.
Еще одна процедура фиксации была предложена в 1992 году (Yu et al., 1992) для хромосом человека. Клетки фиксировали в 100% метаноле (вместо фиксаторов, содержащих уксусную ксилоту) во избежание повреждений ДНК. Для хорошего разброса хромосом в пластинке, фиксированные клетки раскапывали на стекло, и еще влажными отмывали в смеси метанол-уксусная кислота (9:1) с последующей сушкой на воздухе (подсушивали феном). Для точной идентификации хромосомы дифференциально окрашивали с помощью трипсин - Гимза техники (G - бэндинг).
В 1986 году при микродиссекции хромосом человека впервые применили лазер для выжигания ненужной части препарата (Monajembashi et al., 1986). Несколькими годами позже выжигание лазером описано при исследовании клеток табака (Sakai, Fukui, 1988) и микродиссекции хромосом ячменя (Sakai et al., 1989) и риса. Лазерная микродиссекция легла в основу получения биологического материала при похромосомном клонировании генома риса (Мао et al., 1998; Cheng et al., 2001).
Метод микродиссекции можно подразделить натри основные группы:
1. Оригинальный метод (Scalenghe et al., 1981) в масляной камере.
2. Метод микродиссекции во влажной камере (Claussen et al., 1986).
3. Метод микродисекции с помощью лазера.
Все выше перечисленные подходы одинаково успешно используются для микродиссекции как растительных, так и животных хромосомных фрагментов. Размер иссекаемых участков колеблется от целой хромосомы или плеча до небольшого сегмента порядка l-2mb на митотических хромосомах и 40kb на политенных хромосомах в зависимости от целей эксперимента и используемой техники.
Сочетание метода микродиссекции с амплификацией ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) существенно повысило эффективность и применяемость метода при изучении геномов различных объектов. По крайней мере для диссекции и амплификации в векторе лямбда необходимо до 100 хромосом. А для создания регион-специфической ДНК бибилиотеки с использованием ПЦР с последующим клонированием в плазмидном векторе достаточно от одного до 20 хромосомных сегментов.
Микродиссекция и микроклонирование как методы изучения генома, являются гибкими и эффективными способами выделения и анализа -ДНК, создания геномных бибилиотек и получения ДНК маркеров для любых участков хромосом. Широкое применение метод микродиссекции нашел при исследовании хромосом человека и животных, особенно для создания молекулярных маркеров ко многим наследственным заболеваниям человека (Синдром Дауна, хромосома 21 - Као, Yu, 1991; Yu et al., 1992; Kao et al., 1991; -Waandenburg syndrome, type I, chromosome region 2q33-qter - Yu et al., 1992; Hirota et al., 1992; - Huntington disease, chromosome region 4pl6.3-pter - Hadano et al., 1991; - Langer-Giedion syndrome, сЬгорешаются ряд проблемтозоте region 8q23-24 - Ludecke et al., 1989, 1990; Senger et al., 1990; La Pillo et al., 1993; - Prader-Willi syndrome, chromosome region 15ql 1-12 - Sengler et al., 1990; Ludecke et al., 1990; Buiting et al., 1992). Микродиссекция активно используется для анализа участков хромосом, ассоциированных с злокачественными заболеваниями: 2р, дистальная часть (нейрофибробластома, онкоген N-mye, Bates et al., 1986), 22ql2-13 (neurofibromatosis-2; лейкемия, Senger et al., 1990; Ludecke et al., 1990; Fiedler etal., 1991).
С помощью микродиссекционного подхода был внесен существенный вклад в расшифровку генома человека, в частности осуществлено тонкое картирование отдельных хромосомных локусов. Значительную роль этот метод сыграл и будет играть в изучении геномов других организмов, для которых плохо применима техника выделения фракций индивидуальных хромосом, в частности и в первую очередь, геномов растений.
Особое место занимают исследования по секвенированию генома риса (Kharb et al., 2001; Butler, 2002). Геном этого чрезвычайно важного в хозяйственном отношении растения составляет 460 млн п.н., и его секвенирование интенсивно проводится в течение нескольких лет. При этом, подобно геному человека, для этих целей используется стратегия похромосомного картирования. Кариотип риса состоит из 10 пар индивидуальных хромосом. Получение хромосом-специфичных библиотек было осуществлено с помощью метода лазерной микродиссекции. Опубликованы детальные карты секвенирования значительной части генома риса.
Исследование хромосом растений с помощью методов дифференциального окрашивания
Основополагающая роль науки о хромосомах в развитии генетики и геномики не вызывает сомнений. Коротко она состоит в следующем:
1) Определение роли хромосом как клеточных структур - носителей генетической
информации.
2) Понятие о кариотипе как о совокупности признаков, по которым можно идентифицировать данный хромосомный набор.
3) Понятие генома. Термин "геном" в цитогенетическом смысле был предложен в 1920 г. (Winkler, 1920) для обозначения гаплоидного набора хромосом и суммы всех генов в наборе (Ригер, Михаэлис, 1967). В наше время под геномом подразумевается совокупность всех генов, содержащихся в организме, и негенных ДНК-структур (некодирующих повторов), т.е. вся ядерная ДНК, которая входит в состав хромосом. Часто говорят и о цитоплазматическом геноме (или плазмоне), охватывающем ДНК митохондрий и пластид, однако это выходит за пределы рассмотрения данной работы.
4) Понятия о гаплоидных, диплоидных и полиплоидных организмах.
5) Понятия об анеуплоидии, различных хромосомных абберациях (делениях, транслокациях, инсерциях, дупликациях и т.д.).
Был разработан комплекс методов по детальному изучению структуры и функций хромосом, получивший название хромосомного анализа. Круг методов и подходов хромосомного анализа и его история возникновения были детально рассмотрены выше. Современный хромосомный анализ представляет собой не просто описание кариотипа, а изучение хромосом с помощью комплекса методов, позволяющих получать разностороннюю информацию об изучаемом объекте.
По мере развития представлений о структуре и функции хромосом и детального описания кариотипов различных организмов открывались возможности хромосомно-генетического картирования геномов, т.е. локализации конкретных генов на отдельных хромосомах и их участках. В течение длительного времени такие работы осуществлялись путем установления взаимосвязи между утратой того или иного генотипического признака и изменением морфологии хромосом.
Большое количество таких исследований было проведено на дрозофиле. Короткий жизненный цикл и возможность быстрого получения в результате скрещивания особей с измененными генетическими свойствами, с одной стороны, и наличие политенных хромосом, доступных для детального морфологического исследования даже с помощью примитивных методов микроскопического анализа, с другой, сделало эти организмы чрезвычайно удобным объектом для установления таких корреляций (Ананьев, Барский, 1985).
Постепенно подобные исследования стали проводить на других организмах, в частности на человеке. Это стало возможным после детального описания кариотипа человека (Tjio, Levari, 1956). Позже благодаря применению целого ряда методик (использование в качестве материала культуры клеток, гипотонического раствора, фитогемагглютинина, приготовление препаратов из интактных клеток) были выявлены и другие структурные особенности аутосом и половых хромосом человека, определяемые их размерами, положением центромеры, наличием вторичных перетяжек и спутников.
Особое значение имела разработка методов приготовления препаратов. Долгое время хромосомы как животных, так и растений изучали на тканевых срезах. Техника получения срезов была такова, что готовые препараты, как правило, содержали разрушенные митозы, хромосомы накладывались одна на другую, образуя клубки, плохо поддающиеся анализу. Эти трудности были преодолены благодаря разработке технологий, основанных на использовании суспензий клеток, из которых можно было получать тонкие «давленные» препараты без приготовления срезов. Позже для исследования хромосом стали применять метод раскапывания клеточной суспензии. При этом дополнительно стали использовать протеалитические ферменты - трипсин, коллагеназу или гиалуронидазу - с целью дезаггрегации образцов тканей и получения суспензии, состоящей из отдельных клеток.
Резкая интенсификация работ по картированию генома человека произошла в конце 60-х -самом начале 70-х годов прошлого века. Это стало возможным в результате двух почти одномоментных событий - развитию метода дифференциального окрашивания хромосом (Q- и G-бэндинг), позволившего легко и надежно идентифицировать под микроскопом все индивидуальные хромосомы человека и их отдельные части (Caspersson et al., 1968; Sumner et al., 1971; Sumner, 1972), и метода искусственной гибридизации клеток человека и других животных (см. Рингерц, 1979). С помощью последнего подхода удалось получить активно пролиферирующие гибридные клетки, образовавшиеся в результате слияния соматических клеток человека и грызунов (хомячок или мышь). Оказалось, что при последовательных делениях таких гибридных клеток в них постепенно утрачиваются хромосомы человека, а кариотип грызуна остается при этом неизменным. Электрофоретическое изучение маркерных белков позволяло при этом выявить утрату в гибридном клоне того или иного белка человека, а анализ дифференциально окрашенных хромосом увязать это событие с конкретной хромосомой человека.
В результате использования этого подхода уже к середине 70-х годов прошлого века на индивидуальных хромосомах человека были клонированы многие десятки тысяч генов. В ряде случаев хромосомы человека утрачивались в гибридных клетках не полностью. При этом в клетках оставались небольшие, но идентифицируемые с помощью дифференциального окрашивания фрагменты хромосомы, что позволяло осуществлять картирование генов на определенном участке хромосом. Возможности такого исследования резко расширились с разработкой техники так называемых радиационных гибридов. Для слияния брали клетки человека, предварительно подвергнутые воздействию ионизирующего облучения. В результате в гибридных клетках появлялось множество мелких фрагментов хромосом человека.
Параллельно с изучением геномов методами хромосомных технологий, с середины 70-х годов началось прямое изучение последовательностей ДНК путем ссквенирования отдельных клонированных генов и анонимных последовательностей. Получение таких фрагментов ДНК резко расширило возможность прямого физического картирования генома с помощью локализации генов на хромосомах методом гибридизации in situ, сначала в радиоактивном (Gall, Pardue, 1969; John et al., 1969), а впоследствии флуоресцентном варианте (Pinkel et al., 1986; Lichter et al., 1990; Wiegant et al., 1991). Последний метод, получивший название FISH (fluorescence in situ hybridization), приобрел за прошедшие годы широчайшее распространение и стал одним из важнейших, а во многих случаях основным методом прямого, так называемого физического картирования генов на хромосомах.
Развитие и усовершенствование методов секвенирования протяженных участков ДНК и создание разнообразных технологий клонирования позволило уже в середине 80-х годов XX века поставить задачи тотального секвенирования организмов, сначала прокариотических, а вскоре и эукариотических. Однако большинство геномов этих организмов оказались слишком протяженными, чтобы их клонирование, картирование и секвенирование было осуществление впрямую, без предварительного разбиения на части. С особой остротой эта проблема возникла в тот момент, когда перед наукой была поставлена задача тотального секвенирования генома человека, состоящего из 3.2 млрд пар нуклеотидов .
Наиболее простым и очевидным способом разбиения генома человека на части может служить его похромосомное разделение. Однако, это оказалось непростым делом, для которого понадобилось использование всего арсенала методов хромосомного анализа, имевшегося к этому времени. Самым прямым подходом стало выделение чистых или практически чистых фракций хромосом с помощью проточной цитофлуориметрии. Такое разделение основывается на результатах связывания индивидуальными хромосомами AT и GC-специфичных флуоресцентных красителей (Hoechst 33258, DAPI, антибиотиков митромициновой группы и 7-актиномицина Д), т.е. по-существу на результатах хромосомного бэндинга. С помощью этой технологии удалось выделить фракции индивидуальных аутосом 1-8 и 13-22 человека и обеих половых хромосом (X и Y).
Параллельно технологии проточной флуориметрии широкое распространение получило использование гибридов соматических клеток. Были созданы панели гибридных клеток хомячка (или мыши) и человека, содержащие полный набор хромосом грызуна и индивидуальные хромосомы человека. Комбинируя эти подходы, оказалось возмржным заполнить вышеупомянутый пробел (9-12 хромосомы) и получить индивидуальные фракции всех 24-х хромосом человека.
