Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 12
Глава 1. Современное состояние проблемы гриппа 12
1.1. Вирус гриппа в этиологической структуре острых респираторных заболеваний 12
1.2. Патогенез и иммунологические признаки гриппозной инфекции 18
1.3. Роль генетических факторов в развитии гриппа 22
1.4. Клинико-лабораторная характеристика гриппа A (HlNl)pdm09 и его осложнений 29
Часть II. Собственные исследования 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Общая характеристика исследуемых групп 39
2.2. Методы стандартного клинико-лабораторного анализа 42
2.3. Методы молекулярно-генетического анализа 44
2.4. Иммунологические методы исследования 45
2.5. Статистическая обработка данных 47
Глава 3. Сравнительная клинико-лабораторная и эпидемиологическая характеристика гриппа 49
3.1. Этиологическая структура гриппа и других ОРЗ в различные эпидсезоны 49
3.2. Оптимизация диагностических подходов в тактике ведения больных гриппом и острыми респираторными заболеваниями 52
3.3. Клинико-лабораторная характеристика больных гриппом среднетяжелого течения, вызванным разными типами/субтипами вируса 59
3.4. Клинико-лабораторная характеристика среднетяжелой формы гриппа A(HlNl)pdm09, осложненного пневмонией 69
3.5. Клинико-лабораторная характеристика больных гриппом A(HlNl)pdm09 тяжелого течения 75
Глава 4. Особенности цитокинового статуса у больных гриппом 89
4.1. Цитокиновый статус больных гриппом в сопоставлении со здоровыми людьми 89
4.2. Половозрастные факторы и их влияние на показатели цитокинового статуса при гриппе 99
4.3. Особенности клинического течения гриппа и их взаимосвязь с цитокиновым статусом 105
Глава 5. Прогностическое значение полиморфизмов генов у больных гриппом 115
5.1. Общая характеристика генетических исследований 115
5.2. Прогностическое значение полиморфизмов генов при гриппе 117
5.3. Прогностическое значение полиморфизмов генов при гриппе, вызванном разными типами вируса 125
5.4. Прогностическое значение полиморфизмов генов при гриппе A(HlNl)pdm09 разной тяжести и исходов 130
5.5. Прогностическое значение полиморфизмов генов при неосложненном и осложненном гриппе 141
Заключение и обсуждение 165
Выводы 186
Практические рекомендации 188
Список литературы 190
- Вирус гриппа в этиологической структуре острых респираторных заболеваний
- Оптимизация диагностических подходов в тактике ведения больных гриппом и острыми респираторными заболеваниями
- Половозрастные факторы и их влияние на показатели цитокинового статуса при гриппе
- Прогностическое значение полиморфизмов генов при неосложненном и осложненном гриппе
Введение к работе
Актуальность проблемы
Грипп и острые респираторные заболевания (ОРЗ) относят к самым массовым заболеваниям человека, в России на их долю приходится ~ 90% всей регистрируемой инфекционной заболеваемости [Покровский В.И. и соавт., 2007]. По данным ВОЗ, во время сезонных эпидемий, вызванных различными вирусами гриппа, в мире ежегодно умирают от 250 до 500 тысяч (большинство из них в возрасте старше 65 лет), причем в некоторые годы число смертей может достигать миллиона [ВОЗ]. Пандемии гриппа возникают с периодичностью от 10 до 40 лет, и характеризуются высокими показателями заболеваемости и смертности [Климова Е.А. и соавт., 2010]. В связи с этим актуальным является поиск факторов риска тяжелого течения и летального исхода гриппа и других острых респираторных заболеваний, которые позволяли бы своевременно проводить необходимые лечебные мероприятия.
Для человеческой популяции эпидемически значимыми являются два подтипа вируса гриппа А – H3N2 и H1N1 и вирус гриппа типа В. При такой совместной циркуляции появляется возможность развития в различных странах в один и тот же эпидемиологический сезон эпидемий гриппа различной этиологии. Разнообразие популяции вирусов гриппа возрастает также за счет дивергентного характера их изменчивости, что приводит к одновременной циркуляции изолятов, относящихся к различным эволюционным ветвям [Литвинова О.М. и соавт., 2001], формированию смешанных популяций и генетической рекомбинации (реассортации), как между вирусами одновременно циркулирующих в популяции подтипов, так и среди штаммов в пределах одного подтипа [Киселев О.И. и соавт., 2000]. В связи с этим возникает предположение, что выраженное генетическое разнообразие различных возбудителей ОРЗ и, в первую очередь, гриппа должно порождать и разнообразие ответных реакций организма человека, а поиск общих закономерностей и индивидуальных особенностей иммунного реагирования входит в число актуальных задач клинической инфектологии и иммунологии.
В патогенезе гриппа имеют значение не только генетическая изменчивость возбудителя, но и генетические особенности макроорганизма, которые могут определять течение заболевания. Так, на сегодняшний день известно более 400 полиморфизмов генов человека, определяющих вариабельность течения различных вирусных инфекций [ et al., 2010; Miyairi I et al., 2008]. Изучение генетических особенностей человека позволит выделить факторы, способствующие тяжелому течению гриппа, что, в свою очередь, позволит прогнозировать возможный исход заболевания уже на ранних сроках болезни [Горбачева А., 2012]. В литературе не встречались работы, посвященные изучению влияния полиморфизмов генов человека на восприимчивость к вирусу гриппа, тяжесть течения гриппа и других ОРЗ, развитие их осложнений, а также - исход заболевания. Данная работа посвящена изучению этих вопросов.
Цель исследования
Обосновать возможность прогнозирования исходов гриппа на основе клинико-лабораторных особенностей современного течения заболевания с использованием новых молекулярно-биологических методов исследования с целью усовершенствования тактики наблюдения пациентов.
Задачи исследования
-
Оценить этиологическую структуру ОРЗ у больных, поступивших в ИКБ №1 ДЗ г. Москвы в эпидсезоны 2009 – 2013 гг., с использованием методов ОТ-ПЦР и прямой ИФ.
-
Провести сравнительный анализ клинико-лабораторной картины гриппа, вызванного его различными типами и субтипами, а также - среднетяжелого и тяжелого течения гриппа А(H1N1)pdm09 с учетом осложнений и исходов заболевания.
-
Выявить особенности цитокинового профиля больных гриппом, инфицированных различными типами вируса, на различных сроках от начала заболевания и влияние пола и возраста на показатели цитокинового статуса.
-
Провести генетическое исследование у пациентов с гриппом и другими ОРЗ для выявления полиморфизмов генов человека, ассоциированных с тем или иным характером течения заболевания.
-
Определить прогностическую роль изученных полиморфизмов генов человека в оценке риска развития осложнений и неблагоприятного исхода гриппа, вызванного различными типами и субтипами вируса.
Научная новизна работы
В процессе настоящего исследования впервые:
- Установлено особое значение сопутствующей патологии с поражением сердечно-сосудистой и эндокринной систем как факторов риска гриппа А(H1N1)pdm09 тяжелого течения.
- Выявлено значение микст-инфекции с преобладанием в качестве ассоцианта респираторно-синцитиального вируса как фактора риска гриппа А(H1N1)pdm09 тяжелого течения.
- Определены в качестве факторов риска летального исхода при тяжелом течении гриппа А(H1N1)pdm09 наличие сопутствующих заболеваний сердечно-сосудистой системы в состоянии декомпенсации, а также развитие пневмонии тяжелого течения.
- Установлены как общие закономерности отклонений цитокинового статуса у больных гриппом, так и цитокиновые профили в соответствии с типом/субтипом вируса гриппа.
- Определены диапазоны значений отдельных цитокинов, являющиеся маркерами осложненного течения гриппа, вызванного разными типами/субтипами вируса.
- Изучен широкий диапазон вариантов полиморфизмов генов человека, связанных с развитием противовирусного иммунного ответа, с точки зрения их взаимосвязи с развитием гриппа в целом, поражением человека разными типами/субтипами вируса гриппа, осложненным и тяжелым течением гриппа различной этиологии, летальными исходами при этом заболевании.
- Определены неблагоприятные генотипы 5 генов человека для развития гриппа, вызванного разными типами/субтипами вируса.
Практическая значимость работы
Показано, что среди циркулирующих вирусов гриппа в эпидсезоны 2009-2013 гг. преобладал вирус гриппа А(H1N1)pdm09 в виде моноинфекции, клиническая картина которого мало отличима от ОРЗ другой этиологии и менее благоприятна при наличии сопутствующей сердечно-сосудистой и эндокринной патологии.
Показана высокая диагностическая ценность метода ОТ-ПЦР в диагностике гриппа.
На основе проведенного углубленного клинико-лаборатоного, иммунологического и молекулярно-генетического обследования вывялены факторы риска развития осложненного течения и летального исхода при гриппе, вызванным разными типами и субтипами вируса.
Проведенные исследования служат основой для усовершенствования тактики ведения больных гриппом на ранних сроках заболевания, а также – для выявления лиц с наибольшим риском развития неблагоприятных исходов заболевания в межэпидемический период.
Внедрение результатов
Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работу ГКУЗ «Инфекционной клинической больницы №1» ДЗ Москвы. Обоснована необходимость первоочередного обследования на грипп пациента, поступающего в стационар с клиническими признаками ОРЗ в эпидсезон гриппа, и отсутствие необходимости обследования методом ПЦР на наличие других возбудителей ОРЗ больных со среднетяжелой формой заболевания. Результаты обследования позволили скорректировать закупки тест-систем для ПЦР в ГКУЗ ИКБ №1 ДЗМ на 2013-2014 гг. Рекомендовано определение полиморфизма в позициях 88 и 123 гена МхА с целью выявления лиц с риском осложненного и тяжелого течения гриппа, которые в первую очередь нуждаются в проведении плановой вакцинации.
Результаты настоящего исследования используются в учебном процессе ГБОУ ВПО МГМСУ им.А.И. Евдокимова Минздрава России по подготовке интернов, клинических ординаторов, врачей – слушателей курсов на факультете последипломного обучения в лекционных материалах и при проведении семинарских занятий. При усовершенствовании рабочей программы «Избранные вопросы инфекционных болезней» внесены дополнения в раздел, касающийся вопроса дифференциальной диагностики гриппа с другими ОРЗ.
Апробация диссертации и публикации
Основные положения работы доложены на: заседаниях кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России на базе ГКУЗ ИКБ №2 ДЗМ; XXXIV Итоговой конференции общества молодых ученых МГМСУ; Научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства»; V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням.
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах, рекомендованных ВАК.
Апробация диссертационной работы состоялась 19 июня 2013г., протокол №132, на совместном заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, сотрудников ФБУН «Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии» Роспотребнадзора, сотрудников ГКУЗ ИКБ №1 ДЗМ и ГКУЗ ИКБ №2 ДЗМ.
Структура и объем диссертации
Вирус гриппа в этиологической структуре острых респираторных заболеваний
Структура острых респираторных заболеваний полиэтиологична, а спектр возбудителей включает около 300 видов РНК- и ДНК-сод ержащих вирусов, бактерий и других микроорганизмов. Среди вирусов преобладают представители семейств ортомиксовирусов, парамиксовирусов, коронавирусов, пикорнавирусов, аденовирусов и герпесвирусов.
Среди различных возбудителей ОРЗ вирус гриппа обладает наибольшей мутационной изменчивостью в областях генома, которые кодируют белки, обеспечивающие репродукцию вируса в респираторном тракте, что снижает эффективность вакцинации, поэтому изучение структуры вируса гриппа представляет наибольший интерес для вирусологов.
Оценивая значение ОРЗ в патологии человека, следует подчеркнуть, что чаще всего заболевания этой группы протекают в легкой или среднетяжелой форме, однако среди них можно выделить некоторые заболевания, при которых отмечается возможность развития тяжелого течения и летального исхода. К таким заболеваниям относятся грипп, SARS и PC-вирусная инфекция (прежде всего у детей), при этом только вирус гриппа обуславливает периодическое возникновение тяжелых эпидемий и пандемий. Это обстоятельство объясняется тем, что антигенная структура вируса гриппа может меняться настолько, что специфический иммунитет, приобретенный после перенесенного заболевания, практически не защищает от инфицирования вновь появившимся штаммом вируса.
Вирус гриппа был открыт в 1931 г. Richard Shope, в 1933 г. -английские вирусологи (W. Smith, С.Н. Andrewes, P.P. Laidlaw) впервые выделили вирус гриппа А от больного человека, в нашей стране он был выделен А.А. Смородинцевым в 1936 г. Через 3 года Т. Francis выделил вирус гриппа В, а в 1947 г. R. Taylor открыл вирус гриппа типа С [126].
Для человеческой популяции эпидемически значимыми являются два подтипа вируса гриппа А - H3N2 и H1N1 и вирус гриппа типа В. При такой совместной циркуляции появляется возможность развития в различных странах в один и тот же эпидемиологический сезон эпидемий гриппа различной этиологии. Разнообразие популяции вирусов гриппа возрастает также за счет дивергентного характера их изменчивости, что приводит к одновременной циркуляции изолятов, относящихся к различным эволюционным ветвям [13]. В этих условиях создаются предпосылки для одновременного инфицирования человека различными возбудителями, что приводит к формированию смешанных популяций и генетической рекомбинации (реассортации) как между вирусами одновременно циркулирующих в популяции подтипов, так и среди штаммов в пределах одного подтипа [8].
Представляет определенный интерес появление новых штаммов вируса гриппа в человеческой популяции и связанные с ними пандемии. Благодаря антигенным шифтам вирусов гриппа А, возникли следующие пандемии XX века: в 1918-1919 гг. - (подтип H1N1); в 1957-1958 гг. - азиатский грипп (штамм H2N2 A/Singapore/1/57); в 1968-1969 гг. - гонконгский грипп (штамм H3N2 A/Hong Kong/1/68); в 1977-1978 гг. - пандемия, вызванная штаммом H1N1 A/USSR/1/77 (многие ученые не рассматривали это как пандемию, но с появлением этого штамма сложилась ситуация с одновременной циркуляцией двух штаммов вируса гриппа А - H3N2 и H1N1).
Самой большой была пандемия 1918-1919 гг. («испанка»), вызванная вирусом гриппа А(Н1Ш). Тогда было инфицировано 20 - 40% населения Земли (около 200 млн. человек), при этом погибло, по данным разных источников, от 40 - 50 млн. до 100 млн. человек, а половину погибших составили люди в возрасте от 20 до 50 лет [76; 103]. В настоящее время известно, что вирус гриппа А(НШ1) является реассортантным: 5 генетических сегментов были получены от «человеческого» вируса гриппа, а гены гемагглютинина (НА), нейраминидазы (NA) и ген, кодирующий один из белков полимеразы (РВ1) - от «птичьего» вируса гриппа. По мнению J .К. Tanbenberger et al. (2005 г.), все 8 генов вируса гриппа А(НШ1), вызвавшего пандемию 1918 г., имели большее сходство с вариантами «птичьего» вируса гриппа, нежели человеческого [131], что указывает на то, что вирус гриппа птиц может инфицировать (минуя промежуточного хозяина) человека, с последующей передачей от человека к человеку [31].
Вирус «азиатского» гриппа 1957-1958 гг. впервые был зарегистрирован в Центральном Китае (штамм H2N2 A/Singapore/1/57). Общая летальность в мире составила 1-2 млн. человек, при этом самая высокая смертность наблюдалась среди больных старше 65 лет. Этот вирус гриппа A(H2N2) также был реассортантным: 3 гена (НА, NA, РВ1) были получены от «птичьего» вируса гриппа и 5 генов штамма вируса гриппа, циркулировавшего тогда в человеческой популяции.
Пандемия 1968-1969 гг. («гонконгский» грипп) была вызвана реассортантным вирусом гриппа A(H3N2) - A/Hong Kong/1/68. Данный штамм появился в результате замены гемагглютинина 2-ого типа (Н2) и гена полимеразы (РВ1) вируса H2N2 на 2 новых гена вируса гриппа птиц - НЗ и РВ1. Остальные 6 генов этого вируса были получены от штамма вируса гриппа, циркулировавшего в то время среди людей. По мнению R.B. Belshe et al., 2005 г., гены вируса гриппа A(H3N2), происходят от вируса, вызвавшего пандемию в 1918 г. При «гонконгском» гриппе не наблюдалась столь высокая смертность, как во время предыдущих пандемий, так как изменения произошли только в гене, кодирующим белок НА (антигенный шифт), a NA вируса осталась неизмененной. Низкая смертность среди пожилых людей при инфицировании данным штаммом вируса гриппа, вероятнее всего, была обусловлена наличием протективного иммунитета у людей старше 60 лет, сохранившимся после предыдущих пандемий [125]. После 20-летнего перерыва появился новый штамм вируса гриппа A(H1N1) - A/USSR/1/77, вызвавший умеренную пандемию 1977-1978 гг., после которой в мире одновременно стали циркулировать 3 варианта вирусов гриппа: вирусы гриппа типа A(H1N1 и H3N2) и типа В.
В последующие годы эпидемии гриппа были связаны с вирусом гриппа A(H1N1). Так, в 1986 г. в Китае обширную эпидемию вызвал вирус гриппа A(H1N1) (А/Тайвань/1/86), продолжавшуюся до 1989 г. Дрейф-варианты этого вируса просуществовали до 1995 г., вызывая локальные вспышки и спорадические случаи заболевания. По результатам молекулярно-биологических исследований в геноме вируса A(H1N1) в эти годы возникли множественные мутации. В 1996 г. появились два антигенных варианта вируса гриппа A/H1N1: А/Берн и А/Пекин, их особенностью являлась не только антигенная, но и географическая разобщенность. Например, в России в 1997-98 гг. в разных регионах страны эпидемический подъем заболеваемости был обусловлен различными субтипами вируса гриппа А (А/Берн и А/Пекин). В 2000-2001 гг. возбудителем эпидемии гриппа в России также являлся вирус гриппа A(H1N1).
Отдельно следует сказать о вирусе гриппа птиц, который до недавнего времени считался непатогенным для человека. При этом штаммы вирусов гриппа, которые вызвали пандемии 1918-1919, 1957-1958 и 1968-1969 гг. содержали в своем геноме гены вируса гриппа птиц из популяции диких уток. В 1997 г. в Китае вирус гриппа A(H5N1) вызвал тяжелую вспышку заболевания, которая в 1/3 случаев имела летальный исход [10]. В настоящее время единичные случаи заболевания регистрируются практически ежегодно. Есть данные, что и другие вирусы гриппа птиц (H7N1, H9N2, H7N3) патогенны для человека и могут вызывать тяжелые формы заболевания. При проникновении вирусов гриппа птиц в популяцию свиней создаются благоприятные условия для реассортации вирусов и приобретения ими новых патогенных свойств. Примеры такой реассортации как раз и наблюдали в описанных эпидемиях и пандемиях. Не стал исключением и новый вариант вируса A(HlNl)pdm09, вызвавший пандемию в 2009г. Данный подтип вируса был выделен 24 апреля 2009 г. в Калифорнии и получил название «swine flu». В структуру генома вируса A(HlNl)pdm09 входят: гены свиного гриппа, поражающего свиней Северной Америки; гены свиного гриппа, поражающего свиней Европы и Азии; гены птичьего гриппа; гены человеческого гриппа. Итогом такой квадриреассортации явилось повышение тропности вируса к клеточным рецепторам бронхиол и альвеол человека, что обусловило возможность развития тяжелых форм заболевания (помимо лиц, относящихся к группам риска) у практически здоровых молодых людей. В первую очередь тяжесть течения заболевания была обусловлена развитием двухсторонней пневмонии.
11 июня 2009 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила о начале пандемии свиного гриппа [72].
В России первый случай гриппа A(HlNl)pdm09 был официально зарегистрирован 21 мая 2009 г. За 12 месяцев 2009 года, по сравнению с тем же периодом 2008 года, заболеваемость гриппом в РФ выросла в 1,9 раза и составила 416,8 против 224,9 на 100 тысяч населения. Среди обследованных больных в ноябре 2009 года в этиологической структуре ОРЗ удельный вес вируса гриппа A(HlNl)pdm09 достиг 30% и его циркуляция отмечалась уже во всех регионах страны [69].
Оптимизация диагностических подходов в тактике ведения больных гриппом и острыми респираторными заболеваниями
С целью оптимизации диагностических подходов в тактике ведения больных гриппом и острых респираторных заболеваний был выполнен сравнительный анализ диагностической значимости методов прямой иммунофлуоресценции и ПЦР в режиме реального времени для установления диагноза пациентам с подозрением на грипп в условиях инфекционного стационара.
Всего в исследование включен 81 мужчина и 59 женщин (140 пациентов), поступивших в отделения острых респираторных вирусных инфекций ГКУЗ ИКБ№1 ДЗМ в состоянии средней тяжести, с направительным диагнозом: «Острое респираторное вирусное заболевание» (ОРВЗ), либо «Грипп». Средний возраст больных - 35,5 ±1,6 (от 15 до 87 лет). Критериями включения пациентов в исследование были: наличие симптомов ОРЗ (повышение t тела, симптомы интоксикации и катарального воспаления дыхательных путей); обследование двумя методами для подтверждения гриппа (прямая ИФ и ОТ-ПЦР) в первые двое суток от поступления больного в стационар. При этом материал, взятый от больного для проведения этих исследований должен был быть информативным, т.е. содержать достаточное количество клеток эпителия носоглотки для анализа.
Для проведения сравнительного анализа методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР группа больных (п=140), в которой были применены одновременно эти две методики с целью уточнения этиологии основного заболевания, была разделена на 3 подгруппы: 1 подгруппа - пациенты, у которых диагностика гриппа двумя методиками проводились в один день; 2 подгруппа - пациенты, которым ОТ-ПЦР было выполнено раньше метода ИФ на 1-2 суток; 3 подгруппа - пациенты, которым метод прямой ИФ был проведен раньше ОТ-ПЦР на 1-2 суток. Результаты исследования эпителия носоглотки методами прямой ИФ и ОТ-ПЦР у 140 больных, включенных в исследование, представлены в таблицах №3.2.1, 3.2.2, 3.2.3.
Выполнено сравнение частоты регистрации четырех комбинаций (профилей) результатов тестов прямой ИФ и ОТ-ПЦР: ИФ«+»/ПЦР«+», ИФ«-»/ПЦР«+», ИФ«+»/ПЦР«-», ИФ«-»/ПЦР«-».
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (п=20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день, в первые 3 дня от начала заболевания частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (р=0,0005 и р=0,0019, соответственно).
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (п=37), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день, на 4-5 сутки от начала заболевания частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ГЩР«-» (р=0,0001 и р=0,0001 соответственно).
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (п=11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день, позже 5 суток от начала заболевания частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой, но достоверно отличалась только от частоты выявления профиля ИФ«+»/ПЦР«-» (р=0,0078), в то время как, достоверной разницы с частотой выявления профиля ИФ«+»/ПЦР«+» не выявлено (р=0,0868).
Как видно из таблицы 3.2.1, в группе больных (п=20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один и тот же день в первые 3 дня от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 17 (85%) пациентов, при этом большая часть (82%, 14/17) положительных результатов получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось только в 11,8% (2/17) случаев, в то время как, в 70,6% (12/17) случаев методом прямой ИФ антигены вируса гриппа выявить не удалось.
В группе больных, которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день на 4-5 сутки от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 28 (75,7%) пациентов, при этом большая часть положительных результатов (92,9%, 26/28) также была получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось в 10,7% (3/28) случаев, а в 82,1% (23/28) выявить антигены вируса гриппа методом прямой ИФ не удалось.
В группе больных (п=11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день, позже 5 суток от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у всех пациентов. При использовании метода ОТ-ПЦР этиология была установлена у 90,9% (10/11) больных, совпадение результатов двух методик регистрировалось в 3 (27,3%) случаях.
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (п=11), которым исследование ОТ-ПЦР было выполнено на 1-2 дня раньше прямой ИФ и в 1-3 день от начала болезни, грипп был подтвержден у 9 пациентов и только методом ОТ-ПЦР в 100% случаев (профиль ИФ«-»/ПЦР«+»). При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (п=40), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1-2 дня и на 4-5 сутки от начала заболевания частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (р=0,0001 и р=0,0001 соответственно).
При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (п=18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1-2 дня и позже 5 суток от начала заболевания частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (р=0,0006 и р=0,0002 соответственно).
Как видно из таблицы 3.2.2, в группе пациентов (п=11), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1-2 дня, на 1-3 сутки от начала заболевания, при помощи последнего выявить антигены вируса гриппа не удалось ни у 1 пациента, в то время как при использовании метода ОТ-ПЦР генетический материал вируса гриппа был выявлен у 9 (81,8%) больных.
В группе больных (п=39), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1-2 дня и на 4-5 сутки от момента заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом в 76,9% случаев, при этом большинство положительных результатов (90%, 27/30) было получено при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось лишь в 4 (13,3%) случаях.
Половозрастные факторы и их влияние на показатели цитокинового статуса при гриппе
Основным принципом группировки данных служили тип вируса и его ассоциация с другими вирусами, оказывающие наиболее выраженное влияние на цитокиновый профиль.
Влияние пола на цитокиновый профиль больных каждой группы отражено в таблице 4.2.1 и на рисунках 4.2.1 и 4.2.2, в последнем случае показаны 95% доверительные интервалы и ROC-кривые по двум цитокинам, дающим достоверные различия - уровень ИЛ-1(3 у мужчин (рисунок 4.2.1) и уровень ФНОа у женщин (рисунок 4.2.2).
Как видно из таблицы, пол в определенной мере влияет на некоторые показатели цитокинового статуса у больных гриппом А и В. Так, у женщин было отмечено достоверно более высокое содержание ИЛ-10 при гриппе A(H3N2). Анализ 95% доверительных интервалов показателя (рисунок 4.2.1) подтвердил это наблюдение и позволил установить, что при величине AUROC=0,734 уровень ИЛ-1(3 действительно имеет диагностическое значение, а его величины выше 0,14 пг/л регистрируются только у женщин.
Было установлено также, что отмеченное выше значительное повышение уровня в крови ФНОа выше 0,720 пг/л при гриппе A(H3N2) наблюдается только у мужчин при AUROC = 0,706 (рисунок 4.2.2).
Результаты изучения влияния возраста больных гриппом A(H3N2) и В на цитокиновый статус представлены в таблице 4.2.2. Возраст при гриппе А в виде микст-инфекции не анализировался, так как заболевание было представлено в разных возрастных группах в виде единичных случаев, не поддающихся статистическому анализу.
Как следует из иллюстраций, возрастной фактор имеет значение при анализе такого показателя как уровень ИЛ-6 у больных моложе 18 лет и уровень ИФНу у больных гриппом A(H3N2) в возрасте 46-60 лет.
Значительное падение содержания интерлейкина-6 в крови (ниже 0,17) больных гриппом A(H3N2) в возрастной группе моложе 18 лет приводит к высоко выраженным различиям между гриппом A(H3N2) и В, судя по 95% доверительному интервалу, а по величине AUROC (1,0) является практически абсолютно диагностически значимым, что отчетливо видно на рисунке 4.2.3. В связи с этим в перечень цитокинов, достоверно различающихся в группах больных гриппом A(H3N2) и В, помимо ФНОа у мужчин, следует включить и ИЛ-6, но только в возрастной группе моложе 18 лет.
Что касается ИФНу, то уровень этого цитокина был достоверно ниже у больных гриппом A(H3N2) при переходе в возрастную группу 46-60 лет, которая отсутствовала и не подвергалась статистической обработке у больных гриппом В. Однако отмеченное падение уровня ИФНу не было диагностически значимым, как показывают колебания 95% доверительных интервалов этого показателя в разных возрастных группах и относительно низкая величина AUROC, равная 0,553 (рисунок 4.2.4).
Прогностическое значение полиморфизмов генов при неосложненном и осложненном гриппе
Данный раздел исследований посвящен изучению генетических аспектов развития осложнений, в первую очередь, пневмонии, при гриппе среднетяжелого течения.
Результаты исследования полиморфизмов генов, отвечающих за синтез клеточных рецепторов к вирусу, представлены в таблице 5.5.1.
Анализ взаимосвязи полиморфизмов генов, отвечающих за синтез клеточных рецепторов к вирусу, с осложненным течением гриппа и других ОРЗ позволил выявить на достоверном уровне только одну закономерность, касающуюся генотипа AG гена ST3GAL1 rs3758105. Этот ген кодирует белок, относящийся к группе мембранных а2,3-сиалозид и способствующих присоединению вируса гриппа к клеткам дыхательных путей. Относительный риск носительства неблагоприятного генотипа был не повышен, а наоборот, достоверно снижен при ОРЗ не гриппозной этиологии, протекающих с осложнениями.
Развитие осложнений при гриппе и других ОРЗ в значительной мере определялось полиморфизмом генов, отвечающих за синтез противовирусных интерферон-индуцибельных белков группы Mxl и ассоциированных с Toll-подобными рецепторами сигнальных КЬКРЗ-белков инфламмасомы, как это следует из таблицы 5.5.2. Результаты показывают, что у носителей генотипа GT гена Mxl G-88T относительный риск развития гриппа A(HlNl)pdm09, осложненного пневмонией и осложненного гриппа В достаточно велик и проявляется на достоверном уровне, в отличие от гриппа A(H3N2) и других ОРЗ.
Особенностью носителей генотипа С А гена Mxl С-123 А является высокий относительный риск развития осложнений при среднетяжелои форме гриппа в целом, независимо от типа/субтипа вируса, но не при других ОРЗ.
Что касается носителей генотипа ТТ гена IFITM3 rs 12252, то у них высокий относительный риск проявляется для развития гриппа в целом, независимо от типа/субтипа вируса и наличия осложнений, а при других ОРЗ регистрация данного генотипа позволяет прогнозировать только осложненное течение заболевания.
В таблице 5.5.3 представлены результаты исследований по соответствию изученных полиморфизмов генов, кодирующих цитокины, осложненному течению гриппа и других ОРЗ.
Как видно из таблицы, только в двух случаях удалось отметить значимую роль полиморфизмов генов, отвечающих за синтез цитокинов, в развитии осложнений ОРЗ при среднетяжелом течении. В одном случае это был Т-аллельный вариант гена ILla С-889Т при неосложненном течении гриппа A(HlNl)pdm09, а в другом - С-аллельный вариант гена IL6 G-174C при осложненном течении ОРЗ другой этиологии. Однако и в том и в другом случае речь шла о снижении относительного риска носительства неблагоприятных генотипов, что не имеет существенного прогностического значения.
Анализ значения полиморфизмов генов, отвечающих за синтез рецепторов клеточной регуляции как факторов риска осложнений, при гриппе и других ОРЗ проводился по данным таблицы 5.5.4.
Как следует из таблицы, у больных неосложненным гриппом A(H3N2) отмечено снижение частоты встречаемости неблагоприятных генотипов гена CCR5delta32. Этот факт является весьма благоприятным для данной категории людей, но не входит в искомые критерии риска осложненного течения заболевания.
Иная ситуация складывается для гриппа A(HlNl)pdm09, у носителей неблагопиятного генотипа СС гена CD14 С-159. Данные таблицы и рисунка отчетливо демонстрируют, что при наличии этого генотипа достоверно возрастает риск развития пневмонии при среднетяжелом течении гриппа.
![Заболевания органов мочевой системы у детей экологически неблагополучного района крупного промышленного центра (эпидемиология, клинико-этиологическая характеристика, особенности течения и реабилитация) [Электронный ресурс]](/i/i/4315/187699.png "Заболевания органов мочевой системы у детей экологически неблагополучного района крупного промышленного центра (эпидемиология, клинико-этиологическая характеристика, особенности течения и реабилитация) [Электронный ресурс] Архипова Марина Михайловна")
