Введение к работе
Актуальность исследования. Значение герпесвирусных инфекций (ГВИ) в патологии человека подтверждается высоким уровнем инфицированности населения. По мнению Всемирной организации здравоохранения, в настоящее время речь идёт о пандемии: от 65% до 90% взрослого и детского населения планеты инфицировано герпесвирусами (ГВ), причём у 50% из них отмечают рецидивирующее течение заболевания (Тимченко В.Н. и др., 2004; Симовьян Э.М. и др., 2004; Исаков В.А. и др., 2006; Боковой А.Г., 2007; Долгих Т.И. и др., 2010; Баранова И.П. и др., 2011). Первичное инфицирование вирусами семейства Herpesviridae в 60%-90% происходит в раннем детском возрасте (Cameron B. et al., 2006; Исаков В.А., Лобзин Ю.В., 2011). Герпесвирусы могут пожизненно персистировать в иммуноцитах, вызывая латентное инфицирование или манифестную форму заболевания, которой наиболее часто является инфекционный мононуклеоз (ИМ) (Wakiguchi H. et al., 2006; Arvin A. et al., 2007; Иванова В.В. и др., 2009; Зиновьева Л.И. и др., 2010; Слепичева Н.Р., 2010; Помогаева А.П. и др., 2011; Краснов В.В. и др., 2011; Levine H. et al., 2011).
В большинстве случаев этиологию ИМ связывают с лимфотропным вирусом герпеса IV типа – вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) (Ebell M.H., 2004; Левина А.С., 2006; Баннова С.Л., 2010; Собчак Д.М. и др., 2010; Иванова В.В. и др., 2011). Вместе с тем, возможность регистрации других вирусов семейства Herpesviridae (в том числе ЦМВ) подтверждена классификацией МКБ X пересмотра. В литературе также встречаются отдельные описания особенностей инфекционного мононуклеоза, обусловленного цитомегаловирусом (ЦМВ) и вирусом герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6) (Михайлова Т.А., 2008; Хмилевская С.А. и др., 2010; Егорова Н.Ю. и др., 2010; Новосад Е.В., 2010; Кожевина Г.И. и др., 2010; Shimojima Y. et al., 2010; Han X.Y. et al., 2010; Brncic N. et al., 2010; Tohyama M., Hashimoto K., 2011). Однако, недостаточно изучена этиологическая роль вируса простого герпеса (ВПГ-1,2) и смешанных ГВИ, несмотря на установленный синергизм ВПГ 1 и 2 типов по отношению к другим вирусам (Olson D., Huntington M.K., 2009; Bravender T., 2010; Nishikawa J. et al., 2011). Кроме того, синдром мононуклеоза могут вызывать другие вирусы (аденовирус), а также некоторые бактерии (иерсинии) и простейшие (токсоплазмы).
В случаях отсутствия полного синдромокомплекса ИМ, особенно у детей раннего возраста, ошибки диагностики на догоспитальном этапе составляют от 40% до 90% (Wakiguchi H. et al., 2006; Краснова Е.И. и др., 2007; Гордеец А.В. и др., 2008; Imran Mahmud et al., 2011), что требует совершенствования тактики обследования больных с учётом возможной полиэтиологичности заболевания.
Современные методы этиологической диагностики характеризуются рядом недостатков. Серологический метод (иммуноферментный анализ – ИФА), наиболее распространённый в практическом здравоохранении, недостаточно информативен у иммунокомпрометированных пациентов, детей раннего возраста, а также в начальной стадии заболевания (Краснов В.В. и др., 2006; Nystad T.W., Myrmel H., 2007; Liu C.Y. et al., 2007; Баранова И.П. и др., 2010). Молекулярно-биологический метод (полимеразная цепная реакция – ПЦР) не всегда доступен в клинической практике и требует осторожного подхода к оценке из-за большого числа обнаружения ДНК ГВ при отсутствии инфекционной активности (Cheng C.C. et al., 2007; Прохорова Н.А., 2008; Гетия Е.Г. и др., 2010). Диагностическая значимость ПЦР зависит от этиологии ИМ, изучаемого биосубстрата, варианта течения заболевания (первичный или на фоне реактивации латентной и хронической инфекции), составляя от 12%-24% до 77%-100% (Luderer R. et al., 2005; Васюнин А.В. и др., 2006; Siennicka J., Trzcinska A., 2007; Егорова Н.Ю., 2010). Выделение ДНК ГВ в слюне может свидетельствовать не о связи с клиникой острого заболевания, а о носительстве вируса, которое может продолжаться в течение десятков лет (Arvin A. et al., 2007).
Совершенствование этиологической верификации ГВИ ведётся как в направлении комплексного подхода к диагностике, так и в направлении поиска новых методов, позволяющих выявлять специфические антигены репликации ГВ в поражённых органах и клетках (Arvin A. et al., 2007; Глуховец Б.И. и др., 2008; Долгих Т.И. и др., 2010; Лобзин Ю.В., Жданов К.В., 2011). Учитывая тропность ГВ к эритроцитам, тромбоцитам, иммунокомпетентным клеткам крови – лимфоцитам, моноцитам/макрофагам и нейтрофилам – с развитием нарушения их морфоструктуры, грубых повреждений хромосом и большим скоплением антигена в лимфоцитах, перспективным является иммуногистоцитохимическое (ИГЦХ) выявление антигена (АГ) вирусов в клетках крови с помощью специфических моноклональных антител (Dawson C.W. et al., 2003; Егорова Н.Ю., 2006; Нисевич Л.Л. и др., 2006; Насыров Р.А. и др., 2007; Меловцова М.А., 2009; Помогаева А.П. и др., 2011). Несмотря на высокую специфичность метода и отсутствие необходимости в дополнительном дорогостоящем оборудовании, ИГЦХ редко используется в клинической практике, что требует научного обоснования практического применения метода (Александрова Н.В. и др., 2005; Иванова В.В. и др., 2009; Седенко О.В. и др., 2010; Гетия Е.Г. и др., 2010).
Цель работы: представить клинико-лабораторную характеристику инфекционного мононуклеоза у детей различных возрастных групп на основании их комплексного обследования с использованием иммуногистоцитохимического, молекулярно-биологического и серологического методов для совершенствования этиологической диагностики, контроля и коррекции терапии.
Задачи исследования
-
Установить анамнестические, клинические и лабораторные особенности инфекционного мононуклеоза у детей в зависимости от возраста.
-
Изучить возможности и преимущества иммуногистоцитохимического метода в диагностике инфекционного мононуклеоза.
-
Оценить результаты серологического и молекулярно-биологического методов выявления герпесвирусов у детей, больных инфекционным мононуклеозом.
-
Выявить этиологическую структуру инфекционного мононуклеоза у детей различных возрастных групп и охарактеризовать его клинико-лабораторные особенности при смешанной герпесвирусной этиологии.
-
Научно обосновать возможности применения иммуногистоцитохимического метода для клинико-морфологического мониторинга и коррекции противовирусной терапии больных инфекционным мононуклеозом.
Научная новизна
Впервые на основании комплексного исследования маркёров герпесвирусов I, II, IV, V, VI типов с применением иммуногистоцитохимического, серологического, молекулярно-биологического методов у детей, больных инфекционным мононуклеозом, было доказано, что инфекционный мононуклеоз является герпесвирусным заболеванием, вызываемым первичным инфицированием или реактивацией одного из вирусов IV, V, VI типов или их сочетанием, в большинстве случаев на фоне реактивации ВПГ-1,2. Установлена высокая частота реактивации латентного ВПГ-1,2 у больных инфекционным мононуклеозом в структуре смешанной этиологии заболевания.
Впервые доказано, что возрастные различия проявляются не только в клинической картине заболевания, обусловливая развитие преимущественно атипичных, лёгких форм инфекционного мононуклеоза у детей раннего возраста в отличие от подростков с типичными, часто тяжёлыми формами заболевания, но и в его этиологической структуре. Установлено, что у детей раннего возраста наиболее частыми этиологическими факторами являются ЦМВ и ВГЧ-6 как моноинфекция или в сочетании с другими герпесвирусами, у детей старше 4 лет – ВЭБ как моноинфекция или в сочетании с реактивацией ВПГ-1,2. Описаны различия клинико-лабораторных проявлений инфекционного мононуклеоза смешанной этиологии от заболевания, вызванного ВЭБ инфекцией.
Впервые использован иммуногистоцитохимический метод выявления антигенов ВЭБ, ЦМВ, ВПГ-1,2 в лимфоцитах периферической крови не только с целью лабораторной диагностики, но и для подтверждения активности вирусного процесса с учётом характера экспрессии вирусных антигенов, а также контроля и коррекции терапии.
Теоретическая и практическая значимость работы
Расширены представления об инфекционном мононуклеозе как о полиэтиологичном герпесвирусном заболевании, развивающемся не только в результате первичного инфицирования, но в большинстве случаев вследствие реактивации герпесвирусной инфекции.
Научно обоснована необходимость комплексного этиологического обследования больных острым инфекционным мононуклеозом с использованием иммуноферментного анализа для выявления антител классов IgM к герпесвирусам IV, V типов, IgG к вирусам I, II, IV, V и VI типов с определением индекса авидности, а также полимеразной цепной реакции для детекции ДНК ВЭБ и ВГЧ 6 типа в крови и слюне, ЦМВ – в слюне.
Установлена низкая частота выявления IgM к ВПГ-1,2, а также ДНК ЦМВ и ВПГ-1,2 в крови больных в остром периоде инфекционного мононуклеоза, что позволило обосновать объём необходимых лабораторных исследований.
Доказана эффективность иммуногистоцитохимического метода выявления маркёров активной ВЭБ, ЦМВ, ВПГ-1,2 инфекций в лимфоцитах периферической крови и аутопсийном материале для диагностики инфекционного мононуклеоза в случаях атипичного течения, смешанных инфекций и неблагоприятных исходов.
Научно обосновано включение противогерпетических препаратов в схемы терапии инфекционного мононуклеоза.
Основные положения, выносимые на защиту
Инфекционный мононуклеоз является герпесвирусным заболеванием, вызываемым первичным инфицированием или реактивацией одного из вирусов IV, V, VI типов или их сочетанием, в большинстве случаев на фоне реактивации ВПГ-1,2.
Клинико-лабораторные проявления инфекционного мононуклеоза зависят от типов, вызывающих его герпесвирусов, и возраста детей.
Использование иммуногистоцитохимического метода позволяет повысить частоту выявления активной герпесвирусной инфекции у больных инфекционным мононуклеозом и осуществлять контроль и коррекцию противовирусной терапии.
Внедрение результатов научного исследования в практику
Результаты работы внедрены в практическую деятельность врачей клиники респираторных (капельных) инфекций и амбулаторно-поликлинического отделения ФГБУ НИИДИ ФМБА России, в диагностическую работу патоморфологического отдела ФГБУ НИИДИ ФМБА России, в работу ОГУЗ «Инфекционная клиническая больница им. Е.Н.Павловского» г. Белгорода, ГУ «Республиканская инфекционная больница» г. Сыктывкара Республики Коми, ФГУЗ ЦМСЧ №91 ФМБА России г. Лесной Свердловской области, МУ «Пыталовская ЦРБ» г. Пыталово Псковской области. Результаты исследования используются в педагогическом процессе на кафедре инфекционных заболеваний у детей ФПК и ПП для врачей ГБОУ ВПО СПбГПМА Минздравсоцразвития России.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ: 5 статей, в том числе в ведущих научных рецензируемых журналах - 2, а также материалы научно-практических конференций и труды III Съезда Российского общества детских патологов.
Заключение этической комиссии
Работа одобрена Локальным Этическим Комитетом при ФГУ НИИ детских инфекций Росздрава. Протокол № 3 от 12 февраля 2008 г.
Апробация работы
Материалы и основные положения диссертации доложены на IV конгрессе педиатров-инфекционистов (Москва, 2005 г.); XXVIII, XXIX, XXX Итоговых научно-практических конференциях «Актуальные вопросы инфекционных заболеваний у детей» (Санкт-Петербург, 2006, 2007, 2008 гг.); III съезде Российского общества детских патологов (Санкт-Петербург, 2008 г.); Объединённом Иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Неотложные состояния при инфекционных заболеваниях у детей: факторы риска, диагностика, терапия» (Санкт-Петербург, 2008 г.); Юбилейной конференции, посвящённой 85-летию НИИ детских инфекций «Актуальные вопросы инфекционных заболеваний у детей» (Санкт-Петербург, 2012 г.); IV Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012 г.); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2012 г.).
Диссертационная работа апробирована на заседании проблемной комиссии ФГБУ НИИДИ ФМБА России 09 февраля 2012 г. и Учёном Совете ФГБУ НИИДИ ФМБА России 22 февраля 2012 г.
Личный вклад автора
Проведён аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, собраны, изучены и проанализированы анамнестические данные, собраны данные из первичной медицинской документации. Автором осуществлён клинико-диагностический и терапевтический мониторинг 158 детей, больных ИМ различных возрастных групп, в динамике заболевания и катамнестическое наблюдение после выписки из стационара в течение года. Результаты обследования занесены в компьютерную базу и проанализированы с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel и Word 2007 для Windows XP, StatSoft Statistica v.6.0. Доля участия автора в накоплении, обобщении и анализе материала составляет более 95%. Автором освоена и лично проводилась методика иммуногистоцитохимического исследования лимфоцитарной взвеси на антигены ВЭБ, ЦМВ, ВПГ 1,2 типа (97%).
Объём и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 161 странице машинописного текста на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 34 рисунками, содержит 3 выписки из историй болезни. Список литературы включает 139 отечественных источников и 101 зарубежный источник.
Комплексное клинико-лабораторное обследование проведено у 158 пациентов в возрасте от 8 месяцев до 15 лет с синдромокомплексом инфекционного мононуклеоза, находившихся на лечении в отделении респираторных (капельных) инфекций ФГБУ НИИДИ ФМБА России г. Санкт-Петербурга. Диагноз заболевания устанавливали по характерной клинико-гематологической картине и лабораторным данным.
Клинико-лабораторные данные представлены в зависимости от возраста детей и этиологии ИМ. В 1 группу вошёл 91 ребёнок (57,6%) в возрасте от 0 до 3 лет; во 2 группу – 21 ребёнок (13,3%) от 4 лет до 6 лет; в 3 группу – 14 детей (8,9%) от 7 лет до 9 лет; в 4 группу – 32 ребёнка (20,2%) от 10 лет до 15 лет. В зависимости от этиологии выделены две группы: дети с ИМ-моноинфекцией - 61 человек (38,6%) и ИМ-микстинфекцией – 97 человек (61,4%).
Лабораторное обследование проводили в динамике заболевания: на 1-3 день поступления в стационар и в период ранней реконвалесценции – через 10-15 дней после первого исследования. В последующем в течение года проводили катамнестическое наблюдение за 78 детьми, перенёсшими ИМ. Обследование включало: клинический анализ крови и общий анализ мочи; бактериологические посевы для идентификации микрофлоры носо- и ротоглотки, в том числе Corynebacterium diphtheriae для исключения дифтерии; биохимическое определение аминотрансфераз (АлАТ, АсАТ); УЗИ органов брюшной полости; скрининговое обследование на ВИЧ-инфекцию (форма 50). При необходимости РА с диагностикумом Y.pseudotuberculosis I и Y.enterocolitica О3, О9 для исключения псевдотуберкулёза и иерсиниозной инфекции. У детей с повышением АлАТ проводили обследование на HBsAg, анти-HCV-суммарные, анти-HAV-IgM для исключения вирусных гепатитов. Все больные проконсультированы оториноларингологом и при необходимости неврологом.
Острую ВЭБ инфекцию подтверждали обнаружением LMP1 ВЭБ в лимфоцитах периферической крови и/или ДНК в крови, IgM к капсидному антигену ВЭБ (IgM VCA) и/или низкоавидных IgG к капсидному антигену (IgG VCA), а также IgG к комплексу ранних антигенов (IgG EA). У детей с клиническими симптомами ИМ первичную ВЭБ инфекцию подтверждали выявлением IgM VCA ВЭБ и/или низкоавидных IgG VCA, а также IgG EA. Острую цитомегаловирусную и герпетическую инфекцию диагностировали при обнаружении рр65 ЦМВ и антигенов ВПГ-1,2 в лимфоцитах периферической крови и/или ДНК в крови, IgM к ЦМВ и ВПГ-1. О первичной инфекции, вызываемой ЦМВ и ВПГ 1,2 типа, свидетельствовали специфические антитела класса IgM и/или низкоавидные антитела класса IgG к данным вирусам.
Для подтверждения и этиологической расшифровки ИМ использовали серологический метод (иммуноферментный анализ – ИФА) и прямые методы – полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и иммуногистоцитохимию (ИГЦХ).
Определение серологических маркёров ГВ при ИМ методом ИФА проводили в отделе вирусологии и молекулярно-биологических методов исследования (руководитель – д.б.н. Е.А.Мурина). Исследование включало в себя определение антител (АТ) класса IgМ и IgG VCА, IgG EA и IgG EBNA ВЭБ; IgM и IgG к антигенам ЦМВ, ВПГ-1; IgG к антигенам ВПГ-2 и ВГЧ-6; индекс авидности антител класса IgG VCA ВЭБ, ЦМВ и ВПГ-1,2. Серологические маркёры ГВ определяли в сыворотке крови пациентов с помощью стандартных тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Определение индекса авидности проводили с помощью тест-систем ООО «НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород).
Постановку ПЦР осуществляли в отделе молекулярной микробиологии и эпидемиологии (руководитель – д.м.н., профессор С.В.Сидоренко). Определяли ДНК ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-6, ВПГ-1,2 в сыворотке крови и слюне с помощью тест-систем производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва).
ИГЦХ метод проводили в лаборатории патоморфологии (руководитель в период 2004-2007 гг. – д.м.н., профессор Р.А.Насыров). Определяли латентный мембранный протеин 1 (LMP1) ВЭБ, антиген pp65 ЦМВ и антигены ВПГ 1,2 типа в лимфоцитах периферической крови с использованием специфических антител в отношении каждого представителя группы – моноклональные антитела к ВЭБ («Novocastra»), ЦМВ («Novocastra») и поликлональные антитела к ВПГ-1,2 («Dako»). Критериями оценки служили: интенсивность окраски (светло-коричневые, тёмно-коричневые) и размеры гранул (крупные, мелкие), их локализация (на клеточной стенке, в цитоплазме, ядре), количество гранул в одной клетке, наличие перинуклеарной экспрессии в агломератах лимфоцитов, количество содержащих АГ лимфоцитов. При этом в каждом мазке оценивали не менее 100 клеток в одном поле зрения. При наличии более 5% лимфоцитов, содержащих АГ (в виде гранул) результат реакции считался положительным. В зависимости от характера экспрессии исследуемые элементы делили на 4 группы: с отрицательной реакцией (—), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Реакция считалась резко положительной (+++) при наличии тёмно-коричневой перинуклеарной экспрессии АГ в агломератах лимфоцитов (скопление 6-30 «слипшихся» лимфоцитов в одном поле зрения); положительной (++) – при наличии тёмно-коричневых крупных гранул в количестве 6-15, расположенных в ядре и цитоплазме одного свободнолежащего лимфоцита; слабо положительной (+) – при наличии 5-6 светло-коричневых мелких гранул в одном лимфоците, расположенных в цитоплазме. Отрицательной считалась реакция при отсутствии всех перечисленных компонентов экспрессии антигена. В качестве контроля пропускали обработку специфическими антителами, результат при этом был отрицательный.
В качестве контрольной группы ИГЦХ методом обследовано 6 детей с острой респираторной инфекцией дыхательных путей. Результаты ИГЦХ на антигены герпесвирусов были отрицательные.
Приведены данные, проведённого совместно с врачами патологоанатомами лаб. патоморфологии НИИ детских инфекций, патоморфологического исследования одного ребенка (мальчика 10 лет), умершего от инфекционного мононуклеоза.
Математико-статистическую обработку данных исследования осуществляли на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel и Word 2007 для Windows XP, пакета программ по статистической обработке данных StatSoft Statistica v.6.0. При статистической обработке данных вычисляли среднее значение (М), среднее квадратичное отклонение () для количественных данных, относительную частоту наблюдения качественного признака у группы пациентов (Р), среднюю ошибку относительной величины (m). Оценку достоверности различий средних проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для случаев нормально распределённых величин. При малом числе наблюдений и при оценке качественных переменных использовали непараметрические критерии - 2-Пирсона, 2-ML. Различия считались достоверными при p<0,05.
![Заболевания органов мочевой системы у детей экологически неблагополучного района крупного промышленного центра (эпидемиология, клинико-этиологическая характеристика, особенности течения и реабилитация) [Электронный ресурс]](/i/i/4315/187699.png "Заболевания органов мочевой системы у детей экологически неблагополучного района крупного промышленного центра (эпидемиология, клинико-этиологическая характеристика, особенности течения и реабилитация) [Электронный ресурс] Архипова Марина Михайловна")
