Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы
1.1. Понятие об адаптации 12
1.2. Особенности клинических проявлений и функциональной активности ЦНС у детей в период адаптации к школе 16
1.3. Прогнозирование течения адаптации детей к обучению в школе 21
1.4. Роль иммунитета в развитии реакций адаптации 23
1.5. Взаимообусловленность внутриклеточного метаболизма и функциональной активности лимфоцитов 25
ГЛАВА II Объект и методы исследования
2.1. Объект исследования 31
2.2. Методы исследования
2.2.1. Клинико-анамнестический метод 31
2.2.2. Метод оценки функционального состояния ЦНС по параметрам зрительно-моторной реакции 33
2.2.3. Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови 36
2.2.4. Цитоморфоденситометрические методы определения активности ферментов в лимфоцитах крови 39
2.2.5. Статистические методы исследования 42
ГЛАВА III Клинические проявления адаптационных реакций у детей при обучении в школе
3.1. Оценка прогноза течения адаптации к школе детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах 44
3.2. Состояние здоровья детей в начале учебного года 45
3.3. Состояние здоровья детей в конце учебного года 47
3.4. Оценка физического развития детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах 53
3.5. Оценка эмоционального статуса детей и выявление признаков невротизации у детей в течение учебного года 56
3.6. Оценка успеваемости детей в течение учебного года 63
3.7. Частота острых респираторных заболеваний в течение учебного года у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах 65
3.8. Оценка течения адаптации к школе у учащихся 1-х и 5-х классов 66
ГЛАВА IV Особенности метаболизма лимфоцитов крови у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах школы
4.1. Активность оксидоредуктаз в лимфоцитах крови у детей, обучающихся в 1-х классах, в зависимости от прогноза течения адаптации к школе в начале учебного года 68
4.2. Активность оксидоредуктаз в лимфоцитах крови у детей, обучающихся в 5-х классах, в зависимости от прогноза течения адаптации к школе в начале учебного года 78
4.3. Активность оксидоредуктаз в лимфоцитах крови у детей, обучающихся в 1-х классах, в конце учебного года в зависимости от течения адаптации к школе 84
4.4. Активность оксидоредуктаз в лимфоцитах крови у детей, обучающихся в 5-х классах, в конце учебного года в зависимости от течения адаптации к школе 98
ГЛАВА V Функциональные возможности цнс у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах
5.1. Уровни функциональных возможностей ЦНС у учащихся 1-х и 5-х классах в начале учебного года в зависимости от прогноза течения адаптации к школе 111
5.2. Функциональные возможности ЦНС у детей, обучающихся в 1-х классах, в зависимости от течения адаптации 113
5.3. Функциональные возможности ЦНС у детей, обучающихся в 5-х классах, в зависимости от течения адаптации 115
5.4. Взаимосвязи функционального состояния ЦНС и активности оксидоредуктаз лимфоцитов у учащихся 1-х классов в зависимости от течения адаптации 117
5.5. Взаимосвязи функционального состояния ЦНС и активности оксидоредуктаз лимфоцитов крови у учащихся 5-х классов в зависимости от течения адаптации 122
Заключение 125
Выводы 136
Практические рекомендации 13 7
Список литературы 139
- Особенности клинических проявлений и функциональной активности ЦНС у детей в период адаптации к школе
- Метод оценки функционального состояния ЦНС по параметрам зрительно-моторной реакции
- Состояние здоровья детей в конце учебного года
- Активность оксидоредуктаз в лимфоцитах крови у детей, обучающихся в 1-х классах, в зависимости от прогноза течения адаптации к школе в начале учебного года
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ:
Вопросы адаптации детей к школе представляют как научный, так и практический интерес. По мнению В.П. Казначеева (1986) процесс адаптации есть особая форма жизнедеятельности человека, поддержания и сохранения его здоровья в неблагоприятных условиях среды. Многие авторы считают, что оценка функционального состояния по типу развивающейся в организме адаптационной реакции дает возможность судить об уровне резистентности, адап-табельности, резервах и уровне здоровья в целом [28,36, 89]. Стресс необходим для реакций адаптации, он позволяет переключать пластические процессы на энергетические [20, 46, 47, 89, 178, 218]. Ганс Селье (1936) предложил простую диагностику стрессов - по лейкоцитарной формуле периферической крови -развитие эозино- и лимфопении с нейтрофиллезом. Другие авторы судят о типе адаптационных реакций (тренировка, спокойная или повышенная активация, стресс) по количеству лимфоцитов в лимфоцитарной формуле [21,81].
ЦНС, по мнению большинства исследователей, контролирует адаптационные реакции организма [2, 79, 137, 147, 180, 203]. Многочисленные исследования показали ведущее значение симпатико-адреналовой системы в начальный период адаптации к новой ситуации [35, 39, 109, 118, 132, 142]. Ведущее значение для адаптации имеет состояние центральной и вегетативной нервных систем, неироэндокриннои регуляции, сенсорных систем, в этом смысле исходные биологические возможности детей не равны [1, 133, 184]. Интенсивное изучение в последние десятилетия различных аспектов адаптационной реакции позволило накопить большое количество фактов и создать определенные гипотезы [36,41, 56, 89,113,116]. Однако маркеров, позволяющих оценить приспособительные возможности организма, явно недостаточно и прогнозировать течение адаптационной реакции трудно. В настоящее время достаточно хорошо изучены клинико-психологические критерии адаптации детей к школе [44, 53,
7 98, 130, 167, 217]. Среди показателей адаптационного процесса к школе ряд авторов использует уровень физического, биологического развития детей [13, 23, 27, 35, 45, 73, 152, 163]. Проводилось также детальное изучение показателей деятельности сердечно-сосудистой системы у первоклассников и пятиклассников [15, 34, 130]. В последние годы изучались также некоторые показатели функционального состояния ЦНС у школьников [33, 64, 79, 102, 124, 142, 152]. В литературе описаны некоторые показатели функционального состояния ЦНС при различных заболеваниях [2, 100, 103, 134, 135, 139, 146, 160]. Однако данных, отражающих особенности функционального состояния ЦНС при адаптации к школе описано в литературе крайне мало, особенно для детей 5-х классов при переходе на предметное обучение.
Оценка уровня здоровья и адаптивных возможностей ребенка не может быть полной и адекватной без использования критериев, характеризующих состояние иммунной системы - основной системы, обеспечивающей антигенно-структурный гомеостаз и защитные реакции организма [19, 46, 61, 72, 87, 108, 109, 123]. Основной функциональной единицей иммунной системы является лимфоцит. По результатам исследования ряда авторов было обосновано положение, согласно которому по метаболическим параметрам ИКК можно судить о направленности обменных процессов организма в целом. В настоящее время доказано, что изменение функциональной активности ИКК происходит при соответствующих изменениях метаболизма лимфоцитов [20,46, 95,117, 122].
Большое количество исследований, опубликованных в последние годы,. убедительно показало высокую информативность показателей гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов лимфоцитов, возможность их использования для наблюдения за эффективностью терапии и прогноза течения многих заболеваний [54, 63, 71, 86, 87, 128, 155,162, 166, 205]. По мнению ряда авторов, ферменты лимфоцитов могут быть использованы в качестве маркеров адаптационных реакций организма [17, 46, 88, 94, 109, 123, 157]. Метаболические процессы в лимфоцитах в период адаптации детей к школе изучены недостаточно [109,138].
8 Таким образом, изучение активности ферментов лимфоцитов позволит
оценить состояние ИКК, а также состояние иммунореактивности ребенка, его здоровье и заболеваемость. Представляется весьма актуальным проведение динамических исследований детей, исследование метаболических показателей лимфоцитов и показателей функционального состояния ЦНС в период адаптации к школе и выявление наиболее информативных показателей срыва адаптации для проведения у детей с прогностическими признаками неблагоприятного течения адаптации к школе комплекса профилактических мероприятий. Отсюда ясна актуальность физиологического и иммунологического исследования проблемы адаптации у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах общеобразовательной школы.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Изучить особенности клинических проявлений адаптационных реакций, метаболизм лимфоцитов крови и показатели функционального состояния ЦНС у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах, и разработать рекомендации по прогнозу течения адаптации к школе.
ЗАДАЧИ:
Провести анализ клинических проявлений адаптационных реакций к обучению в школе у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах.
Изучить у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах, в начале и в конце учебного года в лимфоцитах крови активность ряда НАД(Ф)- и ФАД-зависимых дегидрогеназ, характеризующих основные метаболические пути в клетке.
Оценить особенности функционального состояния ЦНС и корреляционные взаимосвязи с дегидрогеназами лимфоцитов крови у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах в начале учебного года.
Разработать рекомендации по прогнозу течения адаптации к школе у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах.
9 НАУЧНАЯ НОВИЗНА:
Впервые было проведено комплексное исследование, включающее изучение активности метаболических ферментов в лимфоцитах периферической крови в сопоставлении с данными клинических проявлений и функционального состояния ЦНС у школьников 1-х и 5-х классов в период адаптации к школе.
Проведенное в динамике комплексное изучение активности ФАД- и НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах, позволило судить об активности обменных процессов в ИКК.
Впервые проведено изучение функционального состояния ЦНС и доказана взаимосвязь процессов возбуждения и торможения ЦНС с показателями активности оксидоредуктаз лимфоцитов крови во время адаптации к школе у детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСЬ:
Получены новые данные о том, что практически у половины детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах, адаптация протекала неблагоприятно (у 43,7% первоклассников и у 52,1% пятиклассников). В течение учебного года у части детей выявлено ухудшение состояния здоровья детей, проявляющееся появлением у 8,3% первоклассников и у 25% пятиклассников хронической патологии, ростом числа заболеваний опорно-двигательного аппарата, нарушениями остроты зрения, заболеваниями ЛОР органов, различными нарушениями эмоционально-поведенческой сферы, признаками невротизации, нарушениями социальной адаптации и астенизацией.
Установлено, что характер адаптационных реакций у школьников 1-х и 5-х классов зависит от особенностей метаболических процессов лимфоцитов крови. Сведения об активности ферментов лимфоцитов крови в начале учебного года могут служить прогностическими признаками течения адаптационного процесса к школе у детей 1-х и 5-х классов.
10 Показано, что у учащихся 1-х и 5-х классов имеется выраженная взаимосвязь между показателями функционального состояния ЦНС с уровнем функциональной активности лимфоцитов крови при благоприятном и неблагоприятном течении адаптации.
Полученные сведения о клинических проявлениях, метаболизме лимфоцитов крови, функциональном состоянии ЦНС в период адаптации детей к началу обучения в школе и при переходе на предметное обучение углубляют теоретические знания в областях школьной медицины, педагогики, валеологии, возрастной физиологии, иммунологии и гигиены детей и подростков.
Результаты исследований используются в учебно-педагогическом процессе при чтении курсов лекций для врачей ФПК, студентов педиатрического факультета и проведении практических занятий на кафедре поликлинической педиатрии с курсом пропедевтики детских болезней Красноярской государственной медицинской академии.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
Начало обучения в школе и переход к предметному обучению у части детей сопровождается развитием клинических признаков дезадаптационных реакций.
Адаптационные процессы к обучению в школе у школьников 1-х и 5-х классов характеризуются специфической особенностью активности метаболических ферментов лимфоцитов периферической крови.
Функциональное состояние ЦНС и взаимосвязи с уровнем функциональной активности лимфоцитов характеризуют течение адаптации детей к обучению в 1-х и 5-х классах.
АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ:
Основные положения работы доложены и обсуждены на VIII междунар. симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма» (Красноярск, 2000); краевых межвузовских научн. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Интеллект - 2001» и «Интеллект - 2002» (Красноярск, 2001, 2002);
Всеросс. науч. конф. с международ, участием, посвященной 25-летию НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 2001); III конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2002); I Всеросс. науч. конф. по финансово-актуарной математике и смежным вопросам (Красноярск, 2002); краевой научно-практ. конф. «Актуальные вопросы педиатрии и детской хирургии» (Красноярск, 2002); VI Всеросс. науч. конф. с международ, участием «Дни иммунологии в г. Санкт-Петербурге» (С-Пб., 2002); конф. молодых ученых СО РАМН по проблемам фундаментальной и прикладной медицины (Новосибирск, 2002); итогововых научно-практ. конф. ГУ НИИ МПС СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2002, 2003); научно-практ. конф. «Вопросы формирования здоровья и патологии человека на Севере: факты, проблемы и перспективы» (Якутск, 2002); VIII Конгрессе педиатров России «Современные проблемы профилактической педиатрии» (Москва, 2003); краевой научно-практ. конф. «Питание здорового и больного ребенка. Современные аспекты» (Красноярск, 2003); VII Всеросс. форуме с международ, участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С-Пб., 2003); III Всеросс. конф. с международ, участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 175-летию со дня рождения Ф.В. Овсянникова (С-Пб., 2003), III Конф. молодых ученых России с международ, участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004).
ПУБЛИКАЦИИ: Основные положения диссертации опубликованы в 20 печатных работах (7 статей и 13 тезисов).
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ:
Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 31 рисунком, указатель литературы включает 218 библиографических издания (164 отечественных и 54 иностранных).
Особенности клинических проявлений и функциональной активности ЦНС у детей в период адаптации к школе
На формирование приспособительных реакций и качества адаптации ребенка к школе оказывают целый комплекс биологических факторов, начиная с антенатального периода, а так же микросоциальные условия в семье и индивидуальные особенности организма ребенка [10, 50, 59, 74, 167, 207]. Анализ причин негативных изменений в состоянии здоровья школьников показывает, что доля влияния социально-гигиенических условий жизни детей и внутришколь-ной среды на формирование их здоровья может достигать 28-35%, а воздействие собственно школьной среды от 1-го к 8-му классу возрастает до 21-27% [76]. В связи с реформированием системы школьного образования в последние годы особенно много работ опубликовано о состоянии здоровья детей, обучающимся по разным программам, причем почти все авторы указывают о высокой цене адаптации детей, обучающимся по нетрадиционным программам [11, 16, 51, 73, 75,130, 145, 153, 154].
Несмотря на то, что условия школы и учебные нагрузки далеки от экстремальных, процесс адаптации к этим микросоциальным условиям носит иногда характер выраженной стрессовой реакции [33, 35, 42, 195, 217]. Критические периоды обучения детей в школе могут возникать как результат резкой смены социально-средовых факторов и их взаимодействия с процессом внутреннего морфофункционального развития. Известно, что период поступления ребенка в первый класс является одним из критических, узловых периодов, когда наблюдаются наиболее интенсивные гистоморфологические и функциональные перестройки систем и органов организма ребенка и, прежде всего, ЦНС и иммунной системы на фоне резкой смены социальных условий [2, 13, 16, 45, 53, 77]. В этом возрасте происходят сложные изменения деятельности головного мозга, изменение активности тех или иных ферментов, что приводит к изменению энергетического потенциала клетки, а значит и всего организма в целом [125]. Адаптационный период к школе сопровождается разнообразными сдвигами в функциональном состоянии детей: снижаются факторы местной защиты, отмечается напряжение функции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой, симпатоадреналовой и вегетативной нервной систем, меняется уровень метаболизма, центральное и периферическое кровообращение. В младшем школьном возрасте многие органы в функциональном отношении достигают своего полного развития, заканчивается дифференцировка клеток коры больших полушарий, кора все больше доминирует над подкоркой [33, 77, 79, 98, 102, 124, 147]. У детей, обучающихся в 1-х классах, значительно развивается сила, подвижность и уравновешенность нервных процессов, снижается тенденция генерализации возбуждения, легче начинает вырабатываться внутренне торможение, но оно остается еще недостаточно прочным. У школьников 1-х классов нервные процессы становятся сильными и уравновешенными, быстро образуются положительные условные рефлексы на звуковые раздражители, медленнее - зрительные и кожные, еще медленнее - на температурные. У первоклассников условные рефлексы образуются с 2-8 сочетаний, имеют короткий латентный период [124]. У некоторых из первоклассников формируются невротические реакции, частота которых зависит от психофункциональной зрелости ребенка и организации условий обучения. У первоклассников в период адаптации к школе могут отмечаться расстройства моторики в виде гипердинамического синдрома или фобические проявления, у части детей имеет место астенический синдром и невротические нарушения, которые выражаются в появлении утомляемости, общей слабости, раздражительности, головной боли, боли в области сердца, живота, нарушения сна и аппетита, тиков, энуреза, заикания, кроме этого в период адаптации могут возникать или возобновляться вредные привычки; у трудно адаптирующихся детей снижена умственная работоспособность и успеваемость, кроме того, могут возникать нарушения зрения, осанки, снижение уровня гемоглобина и другие функциональные отклонения [1, 27, 35, 41, 51, 57, 113,130]. Имея низкий уровень здоровья перед поступлением в школу, в процессе
обучения дети утрачивают его еще больше, о чем свидетельствует переход детей из группы риска в группу больных [68]. В структуре заболеваемости ведущее место многие авторы отводят патологии сердечно-сосудистой системы и опорно-двигательного аппарата, а также в настоящее время очень велик процент детей с легкой резидуально-органической: церебральной недостаточностью. Это так называемые дети с минимальными мозговыми дисфункциями. У таких детей очень часто бывают трудности в учебе, отклонения в поведении: негативизм, беспокойство, агрессивность и гиперактивность. Для них характерна быстрая истощаемость психических процессов (нарушения внимания, колебания работоспособности с тенденцией к утомляемости). Часто у них бывают нарушения счета и письма, речевые нарушения [53, 57, 130, 187]. Напряжение механизмов адаптации по данным разных авторов испытывают от 21,3% до 73% первоклассников [13, 35, 149].
В настоящее время количество детей школьного возраста, имеющих отклонения в состоянии здоровья органического и функционального характера, возрастает с каждым годом [165, 172]. Одним из ведущих критериев здоровья детей принято считать физическое развитие (ФР), исследования ученых на современном этапе подтверждают высокий уровень отклонений в физическом и биологическом развитии у детей в период обучения в школе [35, 45, 74, 163, 198, 199]. По мнению Л.Я. Оберг(1981), Н.Н. Сухановой (1999), Р.С. Джубато-вой (2001) дисгармоничное физическое развитие является фактором риска повышенной заболеваемости. Важным критерием, отражающим течение адаптационного процесса к школе, является уровень физического развития [23, 35, 163, 169]. С.Г. Кривощеков и авт. (2003) указывают на то, что уровень эмоциональных и поведенческих проблем у детей 1-5-х классов в Сибири и процесс адаптации к школьной среде зависят от физического развития и функционального состояния ребенка.. При этом доказано, что дисгармоничное ФР является прогностическим неблагоприятным критерием течения адаптации детей к школе [35, 132, 163]. Так по мнению В.Л. Грицинской (2003) наиболее напряженно адаптационный процесс к систематическому обучению в школе протекает у детей с микро- и макросоматотипом, а также у первоклассников, у которых на начальном этапе обучения выявляются высокие значения «индекса астении» (выше 1,25), адаптационного показателя (выше 1,9), выявляется снижение массы тела и/или появление дисгармонии соотношения длины и массы тела. В.В. Суворова с соавт. (2003) выявила взаимосвязь дисгармоничного ФР со снижением функциональных возможностей дыхательной и сердечно-сосудистой систем у школьников. Е.Д. Басманова с соавт. (2003) указывают, что чутким показателем благоприятного течения адаптации у первоклассников служила положительная динамика ФР у детей. Астенизация школьников, увеличение числа проявлений дисфункций вегетативной нервной системы, рост заболеваемости свидетельствует, что адаптационные механизмы детей работают в напряженном режиме [35,73,113,144,149,163].
Метод оценки функционального состояния ЦНС по параметрам зрительно-моторной реакции
Венозную кровь из локтевой вены забирали в пробирки с гепарином, затем выделение лимфоцитов производили центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина по методу A.Boyum (1968) в модификации, описанной Дж.Б. Натвигом с соавт. (1980). Концентрацию лимфоцитов подсчитывали в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определялась чистота выхода лимфоцитов, которая составляла не менее 97% [85]. В дальнейшем 1 млн. выделенных клеток замораживали в микропробирках и использовали для определения НАД и НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов биолюминисцентным методом. Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ проводится по принятым методикам [120, 121]. Для этого суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, после однократного замораживания-размораживания дополнительно разрушали путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреито-ла. Затем производили непосредственное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносили 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в табл.1. Необходимо отметить, что в инкубационную смесь для определения активности НАДФИЦДГ и НАДИЦДГ дополнительно добавляли АДФ в концентрациях 2,15 и 1,3 мМ соответственно. В среду инкубации для определения уровней Обр.НАДГДГ и Обр.НАДФГДГ дополнительно вносили NH4C1 в концентрации 5,0 мМ, а для определения ГР - ЭДТА в концентрации 0,5 мМ. После инкубации исследуемых проб при 37С в течение 30 минут (для ферментативных ре 37 акций с восстановлением НАД(Ф)+) или 5 минут (для реакций с окислением НАД(Ф)Н) к 200 мкл инкубационной смеси добавляли 50 мкл флавинмононук-леотида (ФМН) в концентрации 1,5хЮ"5М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разведены в 0,1 М К+,Ыа+-фосфатном буфере с рН 7,0). рН 7,0, 7,4 и 7,8 - на К+, Ка+-фосфатном буфере. После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра "БЛМ-8803" производили измерение све-чения.Ферментативная система НАД(Ф)Н: ФМНоксидоредуктаза-люцифераза изготовлена из очищенных методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации люциферазы из Photobacterium leiognathi и оксидоредуктазы из Vibrio fischeri в Институте биофизики СО РАН г. Красноярска [29, 143]. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, нами определялись показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение производили в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносили буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получаются относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности необходимо построить график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАД(Ф)Н (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10"9 - 10 4 М вносили в кювету биолюминометра, содержащие биолюминесцентные реактивы в концентрациях указанных выше, после чего производилось измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы, калибровочные графики строились для каждого рН буфера [25]. На рисунке 1 представлен пример подобной зависимости. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывали по формуле: А= АГСІхУхЮ6 Т где А[С] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента"; V - объем пробы в миллилитрах; Т - время инкубации.
Активность окислительно-восстановительных ферментов цикла Кребса, локализующихся в митохондриях, определяет состояние энергетики клетки. Сукцинат дегидрогеназа (СДГ) катализирует дегидрирование янтарной кислоты с образованием фумаровой кислоты. СДГ выявляется во всех видах лейкоцитов и бластных элементах костного мозга, аглицерофосфат дегидрогеназа (аГФДГ) митохондриальная участвует в транспорте водорода из гиалоплазмы в митохондрии, осуществляя челночный механизм, координирующий в клетке процессы дыхания и гликолиза [92]. Для оценки активности СДГ" аГФДГ применяется метод компьютерной морфоденситометрии [43, 60, 67]. Объект исследования характеризуется оптическими и геометрическими признаками.
Состояние здоровья детей в конце учебного года
Венозную кровь из локтевой вены забирали в пробирки с гепарином, затем выделение лимфоцитов производили центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина по методу A.Boyum (1968) в модификации, описанной Дж.Б. Натвигом с соавт. (1980). Концентрацию лимфоцитов подсчитывали в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определялась чистота выхода лимфоцитов, которая составляла не менее 97% [85]. В дальнейшем 1 млн. выделенных клеток замораживали в микропробирках и использовали для определения НАД и НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов биолюминисцентным методом. Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ проводится по принятым методикам [120, 121]. Для этого суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, после однократного замораживания-размораживания дополнительно разрушали путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреито-ла. Затем производили непосредственное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносили 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в табл.1. Необходимо отметить, что в инкубационную смесь для определения активности НАДФИЦДГ и НАДИЦДГ дополнительно добавляли АДФ в концентрациях 2,15 и 1,3 мМ соответственно. В среду инкубации для определения уровней Обр.НАДГДГ и Обр.НАДФГДГ дополнительно вносили NH4C1 в концентрации 5,0 мМ, а для определения ГР - ЭДТА в концентрации 0,5 мМ. После инкубации исследуемых проб при 37С в течение 30 минут (для ферментативных ре 37 акций с восстановлением НАД(Ф)+) или 5 минут (для реакций с окислением
НАД(Ф)Н) к 200 мкл инкубационной смеси добавляли 50 мкл флавинмононук-леотида (ФМН) в концентрации 1,5хЮ"5М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разведены в 0,1 М К+,Ыа+-фосфатном буфере с рН 7,0). рН 7,0, 7,4 и 7,8 - на К+, Ка+-фосфатном буфере. После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра "БЛМ-8803" производили измерение све-чения.Ферментативная система НАД(Ф)Н: ФМНоксидоредуктаза-люцифераза изготовлена из очищенных методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации люциферазы из Photobacterium leiognathi и оксидоредуктазы из Vibrio fischeri в Институте биофизики СО РАН г. Красноярска [29, 143].
Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, нами определялись показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение производили в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносили буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получаются относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности необходимо построить график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАД(Ф)Н (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10"9 - 10 4 М вносили в кювету биолюминометра, содержащие биолюминесцентные реактивы в концентрациях указанных выше, после чего производилось измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы, калибровочные графики строились для каждого рН буфера [25].
На рисунке 1 представлен пример подобной зависимости. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывали по формуле: А= АГСІхУхЮ6 Т где А[С] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента"; V - объем пробы в миллилитрах; Т - время инкубации. Активность окислительно-восстановительных ферментов цикла Кребса, локализующихся в митохондриях, определяет состояние энергетики клетки. Сукцинат дегидрогеназа (СДГ) катализирует дегидрирование янтарной кислоты с образованием фумаровой кислоты. СДГ выявляется во всех видах лейкоцитов и бластных элементах костного мозга, аглицерофосфат дегидрогеназа (аГФДГ) митохондриальная участвует в транспорте водорода из гиалоплазмы в митохондрии, осуществляя челночный механизм, координирующий в клетке процессы дыхания и гликолиза [92]. Для оценки активности СДГ" аГФДГ применяется метод компьютерной морфоденситометрии [43, 60, 67]. Объект исследования характеризуется оптическими и геометрическими признаками.
Активность оксидоредуктаз в лимфоцитах крови у детей, обучающихся в 1-х классах, в зависимости от прогноза течения адаптации к школе в начале учебного года
В начале учебного года у первоклассников с неблагоприятным прогнозом течения адаптации обнаружены достоверно более высокие уровни активности Г6ФДГ, ГЗФДГ, МДГ, НАДФМДГ, НАДФГДГ, НАДИЦЦГ, НАДФИЦДГ и ГР, чем у первоклассников с благоприятным прогнозом течения адаптации к школе (табл. 4).
Фермент СДГ считается одним из наиболее информативных и стабильных показателей энергообеспеченности клетки [6, 14, 38, 43, 93, 109]. По площади и периметру гранул диформазана, по оптической плотности можно судить об активности фермента. Так как СДГ прочно связана с внутренней мембраной митохондрий [58], то усредненное расстояние между гранулами характеризует состояние митохондриального компартмента клетки. Достоверных различий в активности СДГ у первоклассников с неблагоприятным прогнозом течения адаптации к школе в начале учебного года, по сравнению с детьми, имеющими благоприятный прогноз течения адаптации к школе, не выявлено.
аГФДГ участвует в транспорте водорода из гиалоплазмы в митохондрии, осуществляя челночный механизм, координирующий в клетке процессы дыхания и гликолиза [14]. В лимфоцитах крови детей, обучающихся в 1-х классах, с неблагоприятным прогнозом течения адаптации в начале учебного года обнаружена тенденция к достоверному снижению (0,1 Р 0,05) такого геометрического показателя как усредненное расстояние между гранулами по оси Y (1,55±0,23 и 1,13±0,12 мкм. соответственно).
Метаболизм ИКК является сложной взаиморегулируемой системой [2, 18, 62]. Для анализа особенностей метаболических процессов в иммунекомпетентных клетках детей, обучающихся в 1-х и 5-х классах, мы использовали методы корреляционного и нейросетевого анализа. Исследована корреляционная взаимосвязь между параметрами активности ферментов лимфоцитов у первоклассников с благоприятным и неблагоприятным прогнозом течения адаптации к школе. Обнаружено, что исследуемые показатели метаболизма лимфоцитов у детей этих двух групп достаточно тесно взаимосвязаны.
Схема общих и специфических (свойственных только детям с неблагоприятным прогнозом) корреляционных взаимосвязей уровней активности ФАД -, НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у первоклассников в зависимости от прогноза течения адаптации представлена на рис. 11.
Можно предположить, что общие взаимосвязи между уровнями активности ферментов отражают регуляцию внутриклеточного метаболизма, которая осталась устойчивой к изменениям активности ферментов и, следовательно, субстратных потоков, тогда как специфические - характеризуют особенности нарушения внутриклеточной регуляции метаболизма при неблагоприятном прогнозе течения адаптации у первоклассников.
У детей, обучающихся в 1-х классах, с благоприятным и неблагоприятным прогнозом течения адаптации к школе выявлены общие корреляционные связи. У первоклассников с благоприятным и неблагоприятным прогнозом течения адаптации к школе уровень ЛДГ положительно коррелирует с активностью НАДФГДГ (г=0,48, Р 0,05 и г=0,92, Р 0,001, соответственно) и отрицательно взаимосвязан с активностью НАДГДГ (г= -0,53, Р 0,05 и г= -0,72, Р 0,001, соответственно). Обозначены положительные взаимосвязи, пунктиром - отрицательные. У первоклассников с благоприятным и неблагоприятным прогнозом течения адаптации выявлены положительные взаимосвязи между активностью малик-фермента и ГЗФДГ (г=0,48, Р 0,05 и г=0,90,Р 0,001 соответственно), НАДИЦЦГ (г=0,83, Р 0,001 и г=0,41, Р 0,05 соответственно). У первоклассников с благоприятным и неблагоприятным прогнозом течения адаптации выявлена корреляционная связь между активностью НАДФИЦЦГ и НАДГДГ (г=0,81, Р 0,001 и г=0,52, Р 0,01 соответственно). Данные корреляционные связи отражают взаимосвязь между уровнями активности шунтирующих и вспомогательных дегидрогеназных реакций и интенсивностью субстратного потока по циклу Кребса.В обеих исследуемых группах первоклассников внутриклеточная активность анаэробной реакции ЛДГ высоко коррелирует с НАДН-зависимой МДГ (г=0,99, Р 0,001 и г=0,99 Р 0,001 соответственно), с Обр.НАДГДГ (г=0,73, Р 0,001 и г=0,86, Р 0,001 соответственно), с Обр.НАДФГДГ (г=0,74, Р 0,001 и г=0,95, Р 0,001 соответственно). В обеих исследуемых группах первоклассников уровень Обр.НАДФГДГ взаимосвязан с Обр.НАДГДГ (г=0,92, Р 0,001 и г=0,83, Р 0,001, соответственно).
По мнению ряда авторов (Булыгин Г.В. 1992; Захарова Л.Б. 1999; Benitez-Bribiesca L. et al., 2000), увеличение количества и тесноты связей между энзимами свидетельствует о том, что клетка находится в неблагоприятных условиях, при этом усиление соподчиненности различных ферментов позволяет ей наиболее экономно использовать внутриклеточные метаболиты, субстраты и кофакторы.
