Введение к работе
Актуальность темы. Согласно современным представлениям иммунная система состоит из элементов врожденного и приобретенного иммунитета. Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors - TLRs) играют ключевую роль в системе врожденного иммунитета, распознавая экзогенные и эндогенные сигналы опасности [R. Medzhitov, 1997; F. Romagne, 2007]. Не так давно началась интенсивная работа по созданию нового класса иммунобиологических препаратов - модификаторов (активаторов - агонистов; ингибиторов - антагонистов) функций TLRs и их сигнальных путей [R.S. Kornbluth, G.W. Stone, 2006; AJ.H. Gearing, 2007]. Полагают, что такие модификаторы станут эффективным средством иммунопрофилактики и иммунотерапии не только инфекционных болезней, но и аллергических, аутоиммунных, онкологических заболеваний [G. Trinchieri, A. Sher, 2007]. Модификаторы TLRs рассматривают как возможное средство защиты от пандемий и последствий биотеррористических актов.
В качестве модификаторов исследуют природные лиганды (патоген-ассоциированные молекулярные структуры (ПАМС) микроорганизмов) и их синтетические аналоги [G. Trinchieri, A. Sher, 2007; R.S. Kornbluth, G.W. Stone, 2006].
Обширная литература посвящена исследованию роли представителей большой группы многофункциональных белков теплового шока (БТШ), которые взаимодействуют с TLRs. В эту группу входят различающиеся по молекулярной массе и структуре члены семейств: БТШ90, БТШ70, низкомолекулярные БТШ (15-35 Ша) и высокомолекулярные БТШ (М>110 Ша) [К.Д. Никитин, А.Ю. арышников, 2007]. Иммунотропная активность выявлена у БТШ70, gp96 семейство БТШ90), БТШ110 и БТШ170 [П.Г. Свешников и др., 2007].
Показано, что БТШ70 и gp96 являются элементами иммунологических обытий и патогенеза инфекций, аутоиммунных и онкологических процессов [Q. и, 2002; D.R. Ciocca, S.K. Calderwood, 2005; Z.-Y. Zhang et al., 2009].
Молекулы БТШ70 и gp96 являются лигандами для рецепторов клеток рожденного иммунитета. Они активируют макрофаги и дендритные клетки (ДК), апускают экспрессию антигенпредставляющих и костимуляторных молекул [НД
Zheng, J. Dai et al., 2001; Y. Wang, C.G. Kelly et al., 2002; M-F. Tsan, B. Gao, 2004, 2009; A. Asea, 2005, 2007]; являются индукторами второго сигнала, который относится к необходимому компоненту формирования адаптивного иммунного ответа [A. Bolhassani, S. Rafati, 2008].
Белок теплового шока используют при конструировании ДНК-вакцин, пептидных вакцин в качестве адъюванта для эффективного представления связанного с ним антигена Т-лимфоцитам [Р.К. Srivastava et al., 1994; D. Arnold et al., 1995; A-M.T. Ciupitu et al., 1998; G. Multhoff, 2006; M. Peng et al., 2006; D. Toomey et al., 2008]. В частности, активно разрабатывается профилактическая вакцина против рака шейки матки на основе онкобелка Е7 и БТШ70 [В.И. Киселев и др., 2005]. Однако проведенные клинические испытания с индивидуальными аутологичными противоопухолевыми вакцинами следует признать не столь успешными [D.R. Ciocca, S.K. Calderwood, 2005].
В настоящее время значительно меньше уделено внимания антиинфекционной и противоопухолевой активности БТШ, как такового, без конъюгации его с пептидом [В. Javid, Р.А. MacAry, P.J. Lehner, 2007; M-F. Tsan, В. Gao, 2004, 2009].
Данное исследование проведено с рекомбинантным белком теплового шока-70 Mycobacterium tuberculosis'. Препарат содержал примесь липополисахарида (ЛПС) Escherichia coli, что обусловлено методом его получения, поэтому белок теплового шока, использовавшийся в нашей работе, описывали аббревиатурой рБТШ+ЛПС.
Цель работы. Исследовать способность рБТШ+ЛПС создавать у животных защиту против патогенов разных таксономических групп и оказывать влияние на развитие экспериментальных опухолей.
Задачи исследования.
1. Оценить резистентность мышей к Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae и вирусу гриппа птиц (H5N2) при различных схемах введения рБТШ+ЛПС.
1 Выражаем благодарность за предоставление препарата проф. В.И. Киселеву и проф. П.Г. Свешникову
Исследовать противоопухолевую (против меланомы В16 и карциномы яичника) активность рБТШ+ЛПС в экспериментах на мышах.
Установить роль ЛПС, входящего в состав рекомбинантного БТШ, при формировании у "Животных невосприимчивости к инфекциям.
Изучить действие рБТШ+ЛПС на функциональную активность ДК, функциональные свойства и фенотип мононуклеарных клеток, а также продукцию цитокинов.
Экспериментально определить возможность образования аутоантител к органонеспецифическим антигенам у мышей при введении рБТШ+ЛПС.
Научная новизна. Впервые показано, что рБТШ+ЛПС при однократном введении создает у мышей быструю (через 48-72 ч) защиту против микроорганизмов разных таксономических групп - бактерий разных семейств (S. typhimurium, S. pneumoniae) и вируса гриппа птиц (H5N2). При трехкратном введении рБТШ+ЛПС в дозе 10 мкг/мышь формируется защита в течение всего срока наблюдения (21 день) от S. typhimurium.
Впервые выявлено, что наряду с антиинфекционной активностью рБТШ+ЛПС обладает способностью тормозить рост некоторых экспериментальных опухолей при пятикратной аппликации (меланома В16).
Впервые установлено, что примесь ЛПС в составе рекомбинантного белка теплового шока усиливает антиинфекционную активность БТШ70.
Изучено взаимодействие рБТШ+ЛПС с TLR2 и TLR4 человека, экспрессированными на перевиваемых клеточных линиях. При этом показана активация внутриклеточного ядерного фактора NF-кВ, который контролирует синтез цитокинов.
Показано, что в ответ на введение рБТШ+ЛПС у интактных мышей повышался уровень IL-6 и IFN-y в сыворотке, а у зараженных S. typhimurium животных уменьшался уровень IL-6 и TNF-a, но увеличивался синтез IFN-y.
Выявлено, что в системе in vitro рБТШ+ЛПС стимулировал созревание ДК мышей и усиливал цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов
(МНЛ) периферической крови человека в отношении клеток эритробластного лейкоза. Под влиянием рБТШ+ЛПС возрастала экспрессия молекул CD25 и CD56 на МНЛ.
Впервые в эксперименте на мышах показано, что введение рБТШ+ЛПС не сопровождалось выработкой аутоантител к органонеспецифическим антигенам (ДНК, коллаген, эластин).
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований открывают перспективу использования рекомбинантного БТШ+ЛПС в качестве модификатора функции TLRs, с помощью которого можно создавать защиту против широкого круга патогенов.
Основные положения, выносимые на защиту
В эксперименте на мышах показано, что рБТШ+ЛПС М. tuberculosis создает защиту против бактерий (. typhimurium, S. pneumoniae), вируса гриппа птиц (H5N2), а также вызывает торможение роста опухоли меланомы В16.
Белок теплового шока, содержащий в своем составе примесь ЛПС, формирует более выраженную защиту от бактериальной инфекции по сравнению с белком, где ЛПС был инактивирован полимиксином В. Самостоятельно ЛПС Е. coli при однократном введении не защищал мышей от 5". typhimurium в дозе, количественно сопоставимой с таковой в исследуемом препарате.
Рекомбинантный БТШ+ЛПС взаимодействует с TLR2 и TLR4 человека, активирует внутриклеточный ядерный фактор NF-кВ, который регулирует синтез цитокинов.
Цитотоксический эффект МНЛ in vitro в отношении опухолевых клеток К-562 определяется способностью рБТШ+ЛПС стимулировать активность натуральных киллеров, что подтверждается экспрессией молекулы CD56 на мембране МНЛ.
пробация работы. Материалы диссертации доложены на V Всемирном Конгрессе о иммунопатологии и аллергологии (апрель 2007, Москва), на II Международном онгрессе «Иммунитет и болезни» (27-29 июня 2007, Москва), на Российском едицинском форуме (октябрь 2007, Москва), на конкурсе «Умник» (ноябрь 2007, ущино), на Объединенном иммунологическом форуме (29 июня - 5 июля 2008, анкт-Петербург), на II научно-практической конференции в рамках Третьего естиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки РосБиоТех-2008» (5-7 ноября 2008, Москва), на конференции, посвященной 100-етию со дня присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии (13-14 ноября 008, Москва). Апробация работы состоялась на конференции отдела иммунологии Ш вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, 23 июня 2009 г.
убликацин. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 8 — в риалах, рекомендованных ВАК РФ.
труктура и объем диссертации. Материалы работы изложены на 4^0 страницах омпьютерного текста и состоят из введения, обзора литературы, 5 глав бственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, иблиография включает 177 источников (15 отечественных и 162 зарубежных), иссертация иллюстрирована 23 таблицами и 6 рисунками.
спользованные препараты:
рекомбинантный белок теплового шока с молекулярной массой 70 Ша. Белок
плового шока содержал примесь ЛПС в концентрациях 0,185 мкг/мл (I серия) и ,266 мкг/мл (II серия), поэтому препарат описывали аббревиатурой рБТШ+ЛПС;
коммерческий антиген СА125, маркер рака яичников (ХЕМА, Россия);
конъюгат БТШ с антигеном СА125: БТШ-СА125 (Всероссийский научный центр олекулярной диагностики и лечения);
- коммерческий ЛПС Е. coli К-235 (SIGMA , Germany);
- коммерческий полимиксин В (polymyxin В sulfate, РМВ) (Fluka BioChemika,
Denmark);
-моноклональные антитела против дифференцировочных антигенов CD4, CD 16, CD25, CD56, CD40, CD80, CD83, CD86 и F4/80 («Caltag Laboratories», США). Лабораторные животные
Опыты проводили на белых беспородных мышах массой 12-14 и 14-16 г, самцы (п=1200); мышах линии СВА массой 18-20 г, самцы (п=200), полученных из питомника ГУ НЦ Биомедицинских технологий РАМН «Андреевка»; мышах C57BI/6 весом 20-22 г, самцы (п=40) из питомника «Столбовая» Московской области. Штаммы микроорганизмов
В работе использовали штаммы 5. typhimurium 415 f., S. pneumoniae m.3 N.3, полученные из коллекций культур НИИ им. И.И. Мечникова и вирус птичьего гриппа H5N2 (штамм любезно предоставлен Ю.А. Смирновым2). Метод культивирования и получения микробной взвеси для заражения мышей
Культивирование штаммов S. typhimurium и S. pneumoniae проводили соответственно в 0,2% сахарном бульоне и сывороточном бульоне, после чего пересевали S. typhimurium на питательный агар, а pneumoniae — на сывороточный агар. Выросшую микробную культуру смывали 0,9% раствором хлорида натрия и определяли концентрацию по оптическому стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-85 П). Полученную микробную взвесь доводили до концентрации 1x10 микробных клеток/мл и делали последовательные 10-кратные разведения в 0,9% растворе хлорида натрия.
Метод оценки протективнои активности рБТШ+ЛПС на экспериментальной модели бактериальной инфекции
Рекомбинантный БТШ+ЛПС вводили внутрибрюшинно однократно в широком диапазоне доз (от 1 до 400 мкг/мышь) или трехкратно (10 мкг/мышь) ежедневно. Через 24 часа после последнего введения препарата мышей заражали внутрибрюшинно летальными дозами S. typhimurium (106 микробных клеток) и S.
2 НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН
pneumoniae (10 микробных клеток) в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Для контроля заражающей дозы использовали интактных животных, которым вводили культуры S. typhimurium в дозах 106-10s-104 микробных клеток или S. pneumoniae в дозах 10-10-10 микробных клеток и определяли величину LD5o по формуле Кербера в модификации Ашмарина [И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев, 1962]. Наблюдение за животными проводили в течение 21 дня.
Метод оценки протективного действия рБТШ+ЛПС на экспериментальной модели ирусной инфекции
Для воспроизведения модельной вирусной инфекции на животных использовали ирус гриппа птиц H5N2 (A/Mallard/Pansil/1024/84 - H5N2), выделенный от уток и датированный к мышам.
Рекомбинантный БТШ+ЛПС вводили внутрибрюшинно однократно в дозах 100 кг/мышь или 400 мкг/мышь. После чего животным инокулировали интраназально ирус гриппа птиц H5N2 в дозе 10 LD50 в объеме 100 мкл (LD50 Для вируса гриппа пределяли в предварительном опыте титрованием на мышах). Для контроля спользовали интактных животных, которых заражали аналогичной дозой вируса . иппа птиц H5N2. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней. етод оценки роли примеси ЛПС в рекомбинантном белке теплового шока-70 при оздании резистентности на модели инфекции, вызванной S. typhimurium
Мышам вводили внутрибрюшинно однократно или трехкратно ежедневно с нтервалом 24 часа: (1) рБТШ+ЛПС; (2) белок, обработанный полимиксином В РМВ) для связывания ЛПС по принятой методике [Н. Tsuzuki et al., 2001]; (3) репарат, в котором белок теплового шока был денатурирован кипячением в ечение 30 минут [Y. Bulut et al., 2005]; (4) ЛПС Е. coli 235 и (5) РМВ. Через 24 ч осле последней иммунизации мышей заражали внутрибрюшинно летальной дозой . typhimurium 10б микробных клеток в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, онтролем служили интактные животные, которых заражали S. typhimurium в дозах 06-105-104 микробных клеток. Наблюдение за животными проводили в течение 21 ня.
Определение противоопухолевой активности рБТШ+ЛПС
Противоопухолевую активность БТШ изучали на мышах-самцах линии C57BI/6 и СВА массой 18-20 г. В качестве моделей использовали клетки опухолей меланомы В16 и карциномы яичников СА01, полученные из банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина. Иммунизацию животных проводили по двум схемам: (1) рБТШ+ЛПС вводили внутрибрюшинно однократно в дозах 100 мкг/мышь или 400 мкг/мышь; трехкратно или четырехкратно в дозе 100 мкг/мышь с интервалом 2 недели; конъюгат БТШ-СА125 трехкратно с интервалом 2 недели; через 24 часа или 2 недели после последнего введения препарата опухолевые клетки СА01 имплантировали подкожно в 0,2 мл суспензии в дозе 500.000-1.000.000/мышь; (2) мышам подкожно вводили клетки перевиваемого штамма меланомы В16, а затем проводили пятикратную аппликацию препаратом рБТШ+ЛПС в дозах 20 мкг/мышь или 100 мкг/мышь. Противоопухолевый эффект оценивали по объему опухоли и торможению роста опухоли (ТРО). Измерение объема опухоли проводили в двух взаимно перпендикулярных положениях. Объем выражали в условных единицах и определяли по формуле V=a2b, где а - меньший, b - больший линейные размеры опухоли, выраженные в миллиметрах. Торможение роста опухоли рассчитывали по
формуле: ТРО = Vep. опыт - Vcp. контроль / Vcp. к„„троЛь* 100%
Определение цитотоксической активности МНЛ под влиянием рБТШ+ЛПС
Цитотоксическую активность МНЛ определяли на чувствительной к натуральным киллерам линии К-562 (эритробластный лейкоз человека). Опухолевые клетки (104 клеток/мл) инкубировали с МНЛ и рБТШ+ЛПС в концентрациях 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл и 10 мкг/мл (в соотношениях клетки-мишени/эффекторы 1:5, 1:2 и 1:1) в плоскодонных 96-луночных микропланшетах («Costar») 18 ч. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ («Sigma») и по оптической плотности, измеряемой на мультискане MS («Labsystem»), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).
Метод оценки взаимодействия рБТШ+ЛГТС с TLR2 и TLR4
Для определения специфичного связывания TLRs с исследуемым препаратом в аботе использовали линии клеток эмбриональной почки человека 293, стабильно кспрессирующие hTLR4/MD2-CD14 и hTLR2/CD14 [Д.В. -Щебляков, Д.Ю. огунов, 2008]. Контролем служили клетки 293-null, не зкспрессирующие TLRs. летки культивировали в среде DMEM (Hyclone, США) с добавлением 10% етальной бычьей сыворотки, глютамина, пенициллина и стрептомицина. Через 24 аса после добавления к клеткам исследуемого препарата удаляли всю среду и риливали буфер с субстратом для р-галактозидазы (1 мМ MgCb; 0,25 М трис-НС1, Н 7,4; 0,02% NP40; 2 г/л о-нитрофенил-(3-Д-галактопиранозид). Уровень ктивности Р-галактозидазы определяли спектрофотометр ически (414 нм) по онверсии о-нитрофенил-р-Д-галактопиранозида. О способности рБТШ+ЛПС вязываться с TLR2 и TLR4 судили по цветной реакции на галактозидазу (ген алактозидазы находится под контролем транскрипционного фактора NF-kB). етод определения количественного содержания ЛПС в рекомбинантном белке еплового шока-70
Содержание эндотоксина в препарате определяли в гель тромб ЛАЛ (Limulus mebocyte lysate)- тесте PYROGENT компании CAMBREX Bioscience (США), остановка теста выполнялась в соответствии с ОФС 42-0002-00 для оличественного определения содержания бактериальных эндотоксинов в спытуемом препарате. Метод получения ДК и МНЛ in vitro
Дендритные клетки получали из костного мозга мышей линии СВА по андартной методике [СМ. Ситдикова и др., 2009] с добавлением гранулоцитарно-акрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 L-4). В качестве индуктора созревания ДК использовали белок теплового шока-70
TNF-ot в качестве контроля. Мононуклеарные лейкоциты периферической крови
овека выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-ографина по методу A. Boyum [A. Boyum, 1968].
Метод оценки действия рБТШ+ЛПС на экспрессию поверхностных маркеров дендритных клеток
Рекомбинантный БТШ+ЛПС в дозах 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл и 10 мкг/мл добавляли к незрелым ДК и через трое суток оценивали экспрессию поверхностных молекул (CD40, CD80, CD83, CD86 и F4/80) в культуре клеток in vitro. В качестве контроля использовали незрелые и зрелые ДК (последние получали путем добавления к незрелым ДК TNF-a в дозе 100 нг/мл). Метод определения цитокинов у интактных и зараженных мышей
Уровень цитокинов определяли в сыворотках мышей: (1) иммунизированных рБТШ+ЛПС, (2) рБТШ+ЛПС и зараженных S. typhimurium, (3) зараженных S. typhimurium и (4) интактных животных, методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем фирмы «Bender MedSystems » (Австрия) в диапазоне детектируемых концентраций от 1 до 13 пкг/мл. Метод проточной цитометрии CFASC-анализ)
Исследование проводили для определения экспрессии поверхностных маркеров мононуклеаров и ДК при помощи моноклональных антител («Caltag Laboratories», США) на проточном цитофлуориметре FascCalibur (Becton Dickinson, США). Результаты рассчитывали с помощью программы WinMdi 2.8. Метод определения аутоантител к органонеспецифическим антигенам
Для определения аутоантител в сыворотке мышей использовали твердофазный ИФА к ДНК (нативная, денатурированная) по методу, разработанному Н.Е. Ястребовой [Н.Е. Ястребова, Н.П. Ванеева, 1989], а также к коллагену (Serva, Германия) и эластину (INC Biomedical Inc, США). Сенсибилизирующая доза антигенов составляла 2,5-5 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере (рН=9,6). Сыворотки иммунизированных мышей анализировали в разведении 1:100. Отрицательным контролем служил пул сывороток от неиммунизированных мышей. Оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре «Эфос» (Россия) при длине волны 492 нм. Исследование проводилось в лаборатории иммунодиагностики НИИ им. И.И. Мечникова (зав. лаб. Н.Е. Ястребова).
Методы статистической обработки результатов
Статистическую обработку результатов проводили с помощью параметрической и непараметрической базовой статистики с использованием критерия Стьюдента, применяя стандартный пакет статистических программ Windows 2003 (StatSoft 6.0), Exel и WinMdi. Данные представлены как М±т. Различия рассматривались как значимые при р<0,05. Выживаемость мышей в течение заданного срока рассчитывали по методу Гланца [С.А. Гланц, 1999]. Согласно современной теории статистики «к анализу выживаемости неприменимы обычные способы оценки различий, такие, как сравнение долей и средних величин». В основе анализа выживаемости лежит учет выбывания животных при сравнении опытной и контрольной групп [С.А. Гланц, 1999, табл. 11.6]. Выживаемость рассчитывали по формуле: z=Ul/Sul, где z - критерий значимости, определяемый по таблице [С.А. Гланц, 1999, табл. 4.1], Ul - это сумма разности наблюдаемого и ожидаемого числа умерших, a Sul - стандартная ошибка.
![Адреналинзависимая регуляция экспрессии белков теплового шока 70 кДа в лимфоидных клетках [Электронный ресурс]](/i/i/4357/199767.png "Адреналинзависимая регуляция экспрессии белков теплового шока 70 кДа в лимфоидных клетках [Электронный ресурс] Мурашко Дмитрий Александрович")
