Введение к работе
Актуальность исследования. Общее и локальное охлаждение в настоящее время является довольно распространенным фактором воздействия окружающей среды на организм человека, что связано с активным освоением природных богатств Крайнего Севера, возникновением природных и техногенных чрезвычайных ситуаций. Локальное охлаждение все шире применяется в медицине при лечении различных заболеваний, а также как средство анестезии при выполнении оперативных вмешательств на кожных покровах и непроникающих травматических повреждениях (Турсунов Б.С, 1996; Мызенская М.Е. и др., 1996, 1997). Это обусловливает постоянный интерес исследователей к проблеме патогенеза Холодовых повреждений организма и поиска лекарственных средств, корригирующих основные звенья патогенеза Холодовых травм.
Острый холодовой стресс индуцирует адренергическую реакцию, составными звеньями которой являются последовательно возникающие катехолами-новая экспансия, усиление липолиза, гиперлипидемия, разобщение окислительного фосфорилирования, активация перекисного окисления липидов, дефицит в клетках АТФ (ХочачкаСП., Сомёро Дж., 1988, Иванов К.П., 1996).
Иммуносупрессия, возникающая при остром холодовом стрессе, характеризуется выраженными изменениями функциональной активности регуля-торных и эффекторных клеток иммунной системы, значительным угнетением фагоцитарной активности клеток периферической крови, макрофагов селезёнки и печени, снижением количества Т- и В-лимфоцитов в периферической крови, нарушением секреции интерферонов и интерлейкинов, разнонаправленным изменением концентрации и синтеза иммуноглобулинов различных классов (Shu К, 1993; Bhatnagar К, 1996; Kizaki К, 1995, 1996).
Одним из узловых звеньев развития иммуносупрессии при охлаждении являются эритроциты (Прокопенко Л.Г. и др., 1995; Афанасьев ВА, 1999). Охлаждение снижает энергетический и антиоксидантный потенциал эритроцитов, изменяет состав фосфолипидного матрикса и нарушает архитектонику эпито-пов их мембраны, индуцирует появление у лёгких эритроцитов свойства инду-
пировать выделение иммуносупрессирующих цитокинов прилипающими к стеклу клетками селезёнки {Прокопенко Л.Г.; 2001; Быстрова НА., 2003). Есть основания ожидать, что коррекция иммунометаболического состояния лёгких эритроцитов путём нормализации энергетического и антиоксидантного статуса этих клеток и модификации гликопептидных структур наружной поверхности их мембраны окажется эффективным способом иммуномодуляции при остром холодовом стрессе. К числу фармакологических средств, обладающих указанными свойствами, относятся препараты витаминов А и Е (антиоксиданты), витамин К (энергизатор), протеолитические и гликолитические ферменты (модификаторы гликопротеидных структур). Можно предположить также, что эффекты, вызываемые этими препаратами, будут в определённой степени обусловлены их взаимодействием на уровне мембраны эритроцитов.
Цель исследования - изучение роли витаминно-ферментных взаимодействий с эритроцитами в регуляции иммунологических функций при остром холодовом стрессе.
Задачи работы.
1. Изучение иммуномодулирующего действия препаратов жирораст
воримых витаминов при общем воздушном и иммерсионном охлаждении.
-
Выяснение роли эритроцитов и их стромы в реализации иммуномодулирующего действия жирорастворимых витаминов.
-
Изучение иммуномодулирующего действия лизоцима при общем охлаждении организма.
-
Изучение влияния лизоцима на иммуномодулирующие эффекты, вызываемые жирорастворимыми витаминами при общем охлаждении.
-
Выяснение роли эритроцитов в реализации влияния лизоцима на им-муномодулирующую активность жирорастворимых витаминов при общем охлаждении.
-
Изучение влияния витаминов А и Е, лизоцима и протеолитических ферментов на иммупосупрессирующее и иммуностимулирующее действие локального охлаждения.
7. Изучение роли цитокинов клеток селезёнки и регионарных лимфатических узлов в реализации иммуносупрессирующего действия локального охлаждения и иммуномодулирующих эффектов, вызываемых жирорастворимыми витаминами, лизоцимом и протеолитическими ферментами.
Научная новизна. Установлена неодинаковая иммуномодулирующая эффективность сочетанного применения препаратов витаминов А, Е и К. При холодовом стрессе выраженное усиление иммунного ответа и повышение функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови вызывает совместное введение ретинола ацетата и токоферола ацетата или ретинола ацетата и филлохинона. Показана возможность усиления иммуномо-дулирующей активности жирорастворимых витаминов с помощью лизоцима. Выявлена роль эритроцитов как звена интеграции витаминно-ферментных взаимодействий, модулирующих иммунологические функции. Установлена роль цитокинов клеток периферических лимфатических узлов в реализации иммуносупрессирующего действия низкой температуры и иммуномодулирую-щего действия жирорастворимых витаминов, лизоцима и протеолитических ферментов. Обнаружен феномен криоферментной иммуностимуляции, индуцируемый сочетанным применением поверхностного локального охлаждения и введением в зону последнего лизоцима.
Практическая значимость. Экспериментально обоснована целесообразность дальнейшего изучения роли взаимодействия жирорастворимых витаминов, протео- и гликолитических ферментов в регуляции иммунологических функций при стрессе и в условиях патологии. Экспериментально обоснована перспективность изучения сочетанного применения жирорастворимых витаминов и лизоцима для коррекции иммунологических функций при различных формах стресса и патологии. Показаны необходимость всестороннего изучения механизма и возможностей практического применения феномена криоферментной иммуностимуляции.
Результаты диссертации включены в монографии «Иммунометаболиче-ские аспекты холодового стресса» (Курск, 1999), «Метаболическая иммуномо-
дуляция» (Курск, 2000). Материалы работы вошли в учебные рабочие программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях ряда кафедр Самарского, Северного, Ивановского, Воронежского, Курского, Российского государственных медицинских университетов и академий.
Способ стимуляции иммунного ответа, созданный в процессе работы, используется на Курской биофабрике фирмы «БИОК».
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Жирорастворимые витамины - модуляторы иммунологических функций при остром холодовом стрессе.
-
Лизоцим - иммуномодулятор и корректор иммуномодулирующей активности жирорастворимых витаминов при остром холодовом стрессе.
-
Эритроциты - звено сопряжения иммуномОдулирующего действия жирорастворимых витаминов и лизоцима при остром холодовом стрессе.
-
Феномен криоферментной иммуностимуляции.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях Курского государственного медицинского университета и Центрально-Черноземного центра РАМН (1997-2004), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001), IV конгрессе Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ) (Москва, 2001), V и IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 2002), совместном заседании кафедр " биологической химии, микробиологии, спортивной медицины и реабилитации, клинической иммунологии, кожных и венерических болезней, патологической физиологии Курского государственного медицинского университета (2004).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 26 печатных работах, в том числе в 2 монографиях. Работы содержат полный объем информации, касающийся темы диссертации.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста, иллюстрирована 47 таблицами и 31 рисунками. Состоит из введения, обзора литератур (2 главы), описания материалов и методов
исследования, изложения собственных результатов (7 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 318 источников, в том числе 199 отечественных и 119 зарубежных. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования Объект исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 120-180 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8-Ю животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полненные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал + 10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток с 8 до
12 ч. с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986). Животных выводили из опыта декапитацией под эфирным наркозом.
Исследованию подвергали плазму, сыворотку крови, эритроциты, поли-нуклеарные лейкоциты периферической крови, ткань селезенки и подколенных лимфатических узлов.
Моделирование состояний, характеризующихся нарушением энергетического гомеостаза и иммуносупрессией. Общее охлаждение вызывали путем содержания крыс в индивидуальных плексигласовых камерах на воздухе при температуре минус 2 + 0,2С в течение 4 часов или в воде при температуре
10 ± 2С в течение 60 минут. Режимы охлаждения выбирали с таким расчетом, чтобы после охлаждения ректальная температура снижалась на 1,5-2 С. Локальное охлаждение моделировали с помощью аппарата «Иней-3», работающего на жидком азоте. Диаметр контакта с поверхностью кожи - 0,5 см", температура в зоне контакта минус 120С. Интенсивную физическую нагрузку модели-
ровали путем непрерывного плавания крыс с грузом 3,5-4% от массы тела в течение 4 часов (Ласкова ИЛ., 1995).
Испольювание фармакологических препаратов. Исследовали влияние на иммунологические и биохимические функции жирорастворимых витаминов и ферментов: ретинола ацетата, масляный раствор (АО «Ай-Си-Эн Октябрь», Россия), токоферола ацетата, масляный раствор (Ай-Си-Эн «Октябрь», Россия), филлохинона, раствор («Serva», Германия), менадиона бисульфит натрия, раствор (Seth Pharmaceuticals PVT. LTD, Индия), лидаза, лиофилизат (ФГУП НПО «Вирион», Россия), папаин, лиофилизат («Мегк», Германия), террилитин, лио-филиш (Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов ФГУП, Россия), лизоцим, лиофилизат (Брынцалов-А ЗАО, Россия).
Способ введения препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в пособии по фармакотерапии М.Д. Машковского «Лекарственные средства» и аннотациях к использованию препаратов. Выбор разовых доз основывался на экспериментальных данных, приведенных в литературе, о влиянии препаратов на состояние мембран клеток, в первую очередь, эритроцитов (таблица I).
Таблица 1
Применение препаратов
Токоферола auciui
Примечание: при одновременном парном введении препаратов использовались дозы, равные половине некотрые применялисьберзсочетанноговведения
Приготовление антигена. Схемы иммунизации. Оценка интенсивности развития иммунного ответа и функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови. В качестве антигенов в опытах использовались эритроциты барана, которые вводили внутрибрюшинно однократно из расчета 2х109 клеток на 1 кг массы тела. Выраженность гуморального иммунного ответа оценивали на пятые сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа антителообразующих клеток (Мальберг К., Зигль Э, 1987) и розеткообразующих клеток (Зауэр X., 1987). Гиперчувствительность замедленного типа у крыс индуцировали внутрибрюшинным введением 109 ЭБ в 0,5 мл 0,15 М раствора натрия хлорида (сенсибилизирующая доза). Через 4 суток в подушечку стопы правой лапки вводили 106 ЭБ в 0,1 мл физраствора (разрешающая доза). Спустя 24 ч. выделяли регионарный (по месту введения ЭБ) и контрлатеральный подколенный лимфоузлы (Федосеева В.Н. и др , 1993) О выраженности ГЗТ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов и по разнице количества в них кариоцитов
Полинуклеары выделяли из крови в растворе трилона Б, разведенного культуральной средой 199 с помощью фиколл-верографина (d=l,077) (Федосеева Т.В. и др., 1993). Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по фагоцитарному индексу и фагоцитарному числу (Медведев А Н., Чаленко В.В., 1991). Кислородзависимую активность нейтрофилов оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия. Параллельно со спонтанным ставили стимулированный тест, при этом в качестве стимулятора использовали зимозан (Хаитов P.M. идр., 1995).
Выделение, фракционирование и обработка эритроцитов и стромы эритроцитов. Донорами крови служили животные опытных и контрольных групп. Кровь получали из яремной вены под эфирным наркозом через 24 ч после последнего воздействия или введения исследуемых препаратов
Эритроциты выделяли двукратным отстаиванием в 10 мл Na-фосфагного буфера, содержащего 3% декстрана Т-500 и последующей очисткой с помощью HBS-целлюлозы в Na-фосфатном буфере и фракционировали в градиенте плот-
ности яичного альбумина (Кобозев Т.В. и др., 1978). Получали 2 фракции эритроцитов: легкую (d < 1,079 г/см1) и тяжелую (d > 1,117 г/см').
Эритроциты опытных крыс экстракорпорально обрабатывали сывороткой аллогенных экспериментальных животных. В качестве контроля использовали сыворотку здоровых животных. Обработку проводили способом, разработанным Л.Г. Прокопенко и Ю.О. Яхонтовым (1976).
Строму эритроцитов получали методом гипоосмотического гемолиза. Менадион включали в строму эритроцитов по методу, разработанному для антибиотиков (Генинг Т.П., 1988) в модификации Ж.Ш. Жумадилова и Р.В. Ма-каренковой (1990). Для некоторых опытов получали иммобилизированные с помощью стромы эритроцитов менадион и лизоцим (Конопля НА., 2001).
Иммуномодулирующие свойства интактных, обработанных сывороткой или препаратами эритроцитов и их фракций, определяли путем трехкратного (с интервалом 24 ч.) внутрибрюшинного введения (по 108 клеток на 1 кг массы) интактным или опытным аллогенным реципиентам. Иммунизацию животных ЭБ проводили в последний день введения эритроцитов. Иммуномодулирующие свойства препаратов, включенных в строму эритроцитов или соиммобилизо-ванных с помощью стромы эритроцитов, устанавливали при внутрибрюшин-ном, пятикратным, с интервалом 24 часа, введении (10s частиц на 1 кг массы тела) интактным или охлажденным животным. Одновременно с последней инъекцией животных иммунизировали ЭБ. Контролем служили крысы, получавшие строму эритроцитов, не содержащую препараты.
Получение и фракционирование спленоцитов клеток периферических лимфатических узлов, получение супернатантов, разделение и очистка белков клеток селезенки и лимфатических узлов. Клетки селезенки и периферических лимфатических узлов фракционировали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (Дерфлинг П., Вихнер 3., 1987). Прилипающие к стеклу клетки дополнительно фракционировали при температурном градиенте (Родионов СВ. и др., 1985). Определение количества клеток и их жизнеспособности проводили с помощью теста поглощения трипанового синего.
Приготовленная таким образом суспензия клеток селезенки содержала 85-90% жизнеспособных клеток.
Прилипающие и неприлипающие клетки селезенки и периферических лимфатических узлов культивировали в среде 199 (5 х 10' клеток на 3 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и стрептомицин), в течение 3-6 ч. в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% углекислого газа) и готовили пул супернатантов спленоцитов или клеток лимфатических узлов, фракций прилипающих или не прилипающих клеток к стеклу, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных. Концентрацию белка в супернатантах определяли с использованием красителя Кумаси G-250 по Bredford (Шишкин С.С., 1982).
Пул супернатантов диализировали против трис-НС!-буфера (рН=8,0), приготовленного на 0,15 М растворе натрия хлорида. После диализа суперна-тант клеток концентрировали с помощью полиэтиленгликоля с молекулярной массой 40 кД и повторно диализовали против трис-НС 1 -буфера.
Очищенный и сконцентрированный супернатант спленоцитов интактных и опытных крыс фракционировали на сефадексе G-150. Для оценки ММ белков фракции, полученных при гель-хроматографии, определяли объем выхода белков с известной ММ - кристаллического бычьего альбумина (мономер, ММ 61 кД и димер - ММ 134 кД), кристаллического овальбумина (ММ 45 кД), ингибитора трипсина (ММ 21,5 кД), РНК-азы (ММ 13,6 кД) (Детерман Г., 1970; Ос-терманЛ.А., 1985).
Получены три фракции спленоцитарных белков: I выходила в количестве 10 + 1% и содержала белки с ММ более 150 кД, II выходила в количестве 20±4% и содержала белки с ММ 50-60 кД, III выходила в количестве 10 + 3% и содержала белки менее 25 кД. Полученные при гель-хроматографии фракции концентрировали с помощью полиэтиленгликоля. Супернатант клеток лимфатических узлов концентрировали и фракционировали на сефадексе G-50. Получены три фракции белков клеток периферических лимфатических узлов: 1 выходила
в количестве 65±10% и содержала белки более 50 кД, II выходила в количестве 25±8% и содержала белки с ММ 20*30 кД, Ш выходила в количестве 10 + 3% и содержала белки 15 кД и менее.
Для определения иммуномодулирующей активности супернатантов или их гель-хроматографических фракций их вводили однократно внутрибрюшин-но аллогенным реципиентам из расчета 2 мг белка на 1 кг массы тела, одновременно с иммунизацией ЭБ.
Определение биохимических показателей. О выраженности цитолити-ческого синдрома при поражении печени судили по активности АЛТ и ACT, проявления холестаза оценивали по активности ЩФ и концентрации ОБ в сыворотке крови (Меньшиков В.В., 1987). Содержание лизоцима в сыворотке определяли по О.В. Бухарину (1975). Содержание витаминов А и Е в крови определяли по l.L. Bienz и S.N. Prival (1995). Выраженность перекисного окисления липидов оценивали по содержанию в сыворотке крови диеновых конъюгатов жирных кислот (Стальная Н.Д., 1977), ацилгидроперекисей (Гаврилов В.Г., Мишкорудная М.И., 1983) и малонового диальдегида (Стальная Н.Д., Гаришви-лиТ.Г, 1997).
Оценка энергетического и антиоксидантного потенциала эритроцитов. Энергообеспечение эритроцитов оценивали по содержанию в них АТФ и 2,3-бифосфоглицерата (Виноградова И.Л., 1980), их антиоксидантный статус -по активности супероксиддисмутазы (Макаренко Е.В., 1988), каталазы (По-дильчак М.А., 1967), глутатионпероксидазы (Гаврилова А.В., Хмара Н.Ф., 1986) и глутатионредуктазы (Макаренко Е.В., 1988).
Статистическая обработка материала. Математический анализ полученных данных проводили с помощью программы «Microsoft Excel-XP» на ЭВМ «Pentium-lV». Первоначально генерировался отчет описательной статистики, содержащий информацию о среднем числе, стандартной ошибке, стандартном отклонении, дисперсии выборки. Затем оценивалась равномерность распределения выборочной совокупности по коэффициенту Колмогорова-Смирнова, достоверность различий - по критериям Вилкоксона-Манна и Уит-
ни. Уровень надежности составил 95%.
