Введение к работе
Актуальность работы
Одной из центральных проблем исследований в любой области знаний является выбор оптимальных инструментов исследования. Это особенно актуально в области медицины и охраны здоровья человека, где правильная диагностика играет ключевую роль в выборе стратегии и тактики лечения, а впоследствии определяет его успешность.
Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия и было отмечено в 1993 г. Нобелевской премией. Благодаря этому открытию стало возможным быстрое получение исследуемых участков ДНК, находящихся в сложной смеси нуклеиновых кислот, в чистом виде и в количестве, достаточном для дальнейших манипуляций, результатом чего стало почти немедленное практическое применение метода. Это позволило поднять медицинскую диагностику на принципиально новый уровень. Разработка молекулярно-генетических методов, которые во многом определяют успешность исследований в различных областях биологии и медицины, является сегодня одним из наиболее быстро развивающихся направлений современной фундаментальной и прикладной науки. Особенно бурное развитие метод ПНР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования. Если в недавнем прошлом для расшифровки последовательности ДНК размером в 250 п.н. требовалась неделя, то современные секвенаторы позволяют определять десятки тысяч пар нуклеотидов в день. Это в свою очередь способствует значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК различных биологических объектов.
Информационные базы нуклеотидных последовательностей сегодня широко используются при разработке методов диагностики инфекционных и наследственных заболеваний, различных методов генотипирования, в исследованиях в области биологической безопасности, в частности, при определениях бактериального и вирусного загрязнения объектов и т.д.
Таким образом, сегодня появились предпосылки для осуществления комплексного подхода к оценке состояния здоровья человека с учетом факторов наследственности, текущего состояния организма, а также его взаимодействия с вирусным и микробным окружением. Такой подход позволит оценивать динамическое состояние организма человека, которое является результатом взаимодействия его генотипа, фенотипа и внешней среды и может быть реализован с применением единого инструмента исследования - ПЦР в реальном времени (полимеразная цепная реакция с детекцией кинетики накопления продуктов реакции непосредственно в ходе процесса).
Несомненным преимуществом метода ПЦР в реальном времени является является его быстрота. В среднем для проведения анализа биологического материала методом ПЦР необходимо от 2-х до 4-х часов. Таким образом, с точки зрения информативности, универсальности и технологичности использования в прикладных лабораторных исследованиях, ПЦР в реальном времени может рассматриваться как универсальная основа единой технологической платформы для создания целого спектра различных молекулярно-генетических методов. Разработка такой платформы на основе отечественной приборной и компонентной базы, максимально независимой от импортной продукции, представляет собой важную задачу, решение которой способно внести значительный вклад в развитие фундаментальной и прикладной науки, а также различных аспектов биобезопасности.
Цели и задачи работы
Цели работы:
Разработка на единой технологической основе ПЦР в реальном времени и с использованием приборной и компонентой базы отечественного производства инновационной платформы, позволяющей проводить комплексные молекулярно-генетические исследования, включающие: а) анализ генетической информации; б) оценку профиля экспрессии генов; в) характеристику вирусного и микробиологического окружения.
Создание на основе разработанной технологической платформы тест-систем для решения актуальных фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии.
3. Апробация на клиническом материале комплексного подхода к анализу биоматериала с использованием разработанных методик, тест-систем и алгоритмов анализа результатов ПЦР в реальном времени.
Задачи работы:
Разработка методической базы для проведения ПЦР в реальном времени, основанной на приборах и молекулярно-биологических компонентах отечественного производства.
Разработка алгоритмов анализа результатов ПЦР в реальном времени на базе программно-аппаратных решений отечественного производства.
Разработка метода детекции единичных нуклеотидных замен (single nucleotide polymorphism, SNP) с помощью ПЦР в реальном времени.
Разработка методики типирования локуса HLA DRB1 на уровне групп аллелей на основе технологии ПЦР в реальном времени.
Разработка систем для оценки профиля экспрессии генов иммунной системы человека на основе анализа соотношения мРНК исследуемых и нормировочных генов (housekeeping genes) методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени.
Разработка систем для детекции и количественной оценки латентных инфекций методом ПЦР в реальном времени.
Разработка методов количественной оценки состояния биоценозов различных биотопов человека.
Апробация разработанных методик, тест-систем и алгоритмов анализа результатов ПЦР в реальном времени на клиническом материале.
Научная новизна
Впервые разработан и внедрен вариант метода типирования однонуклеотидных генетических полиморфизмов с помощью определения температуры плавления примыкающих олигонуклеотидных зондов, полностью основанный на отечественных молекулярно-биологических компонентах и оборудовании.
Впервые получены данные о распределении в русской популяции 22-х генетических полиморфизмов, значимых для иммунного статуса человека.
Впервые разработан метод оценки результатов реакции бластной трансформации лейкоцитов (РБТЛ), основанный на ГЩР в реальном времени и не требующий использования радиоактивных меток.
Определены нормировочные гены и алгоритмы нормировки, оптимальные для оценки уровней экспрессии генов цитокинов и других молекул иммунной системы.
Впервые разработаны системы для определения уровней экспрессии 15-ти генов иммунной системы, полностью основанные на отечественных молекулярно-биологических компонентах и оборудовании.
Впервые разработан метод оценки состояния биоценозов различных биотопов человека на основе анализа 16S РНК с помощью мультиплексной ГЩР в реальном времени.
Впервые разработан и апробирован метод комплексной оценки клинического биоматериала на молекулярно-генетическом уровне, позволяющий одновременно получать информацию о бактериологическом фоне и активности генов иммунной системы.
Научно-практическая значимость
Выполненная работа является прикладным исследованием, результаты которого имеют важное значение для развития фундаментальных и прикладных аспектов иммунологии, медицины и молекулярной биологии.
Созданная в ходе работы инновационная платформа позволяет проводить комплексный молекулярно-генетический анализ биоматериала на единой технологической основе, позволяя получать всестороннюю информацию о генетических особенностях исследуемого объекта, активности генов иммунной системы и взаимодействии организма с вирусным и микробным окружением. Данный подход представляется перспективным как с точки зрения реализации фундаментальных научных исследований, так и для практического здравоохранения.
Особое значение имеет ориентация инновационной платформы на отечественную технологическую и приборную базу, что позволяет эффективно решать вопрос импортозамещения в области высокотехнологичной продукции, относящейся к прикладным и фундаментальным молекулярно-генетическим исследованиям.
По результатам диссертационной работы получено 7 патентов и 2 регистрационных удостоверения:
Патент на изобретение №2294532: «Способ стандартизации данных полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции по флуоресценции непосредственно во время реакции (ПЦР «в реальном времени»)». Авторы: Трофимов Д.Ю., Саматов Г.А., Семенов П.А. / 2007 г.
Патент на изобретение №2332669: «Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене интерлейкина 1-а позиция 889(СЛ>>. Авторы: Трофимов Д.Ю., Грудакова Е.Г. / 2008 г.
Патент на изобретение №2332670: «Способ определения генотипа человека по полиморфизму в гене интерлейкина 6 позиция 174(G/C)». Авторы: Трофимов Д.Ю., Грудакова Е.Г. / 2008 г.
Патент на изобретение № 2008105063: «Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности». Авторы: Липова Е.В., Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю., Бородин A.M., Скоркина Ю.А. / 2008 г.
Патент на изобретение №2346986: «Способ определения наличия «горячего старта» в полимеразной цепной реакции». Авторы: Абрамов Д.Д., Трофимов Д.Ю., Ребриков Д.В. / 2009 г.
Патент на изобретение (на регистрации, заявка №2008100303/000331): «Способ оценки степени пролиферации клеток с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции «в реальном времени»». Авторы: Савилова A.M., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов P.M.
Патент на изобретение (на регистрации, заявка №2009101460/001805): «Способ ранней диагностики воспалительных заболеваний (модель ревматоидного артрита на ранней стадии) на основе количественного определения транскриптов генов цитокинов методом ПЦР «в реальном времени»». Авторы: Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю.
Регистрационное удостоверение №ФСР 2007/01250 от 20 ноября 2007 г. на амплификатор детектирующий ДТ-96 по ТУ 9443-002-96301278-2007 производства ООО «Научно-производственного объединения ДНК-Технология».
Регистрационное удостоверение №ФСР 2009/04663 от 01 апреля 2009 г. на набор реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени (Фемофлор) по ТУ 9398-020-46482062-2008 производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология».
Материалы диссертационной работы широко используются в учебном процессе при подготовке врачей и лаборантов медицинских учреждений к работе с приборами и тест-системами в области молекулярной генетики.
Положения, выносимые на защиту
Впервые в отечественной практике создана единая технологическая платформа на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая получать информацию о трёх основных аспектах состояния иммунной системы и здоровья человека в целом: а) о генетических особенностях; б) о профиле экспрессии генов; в) о взаимодействии организма с вирусным и микробным окружением.
Разработанная инновационная платформа полностью основана на отечественной приборной и технологической базе.
В рамках апробации инновационной технологической платформы:
получены данные об основных клинически значимых иммуногенетических параметрах русской популяции;
разработан метод оценки результатов РБТЛ с помощью ПЦР в реальном времени;
выявлены некоторые особенности экспрессии генов иммунной системы при аллергических заболеваниях и ревматоидном артрите;
показана возможность комплексной молекулярно-генетической оценки профиля экспрессии генов иммунной системы и бактериального фона в образцах клинического биоматериала.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и симпозиумах: 13th European Histocompatibility Conference (Crete, Greece, 1999), 14th European histocompatibility Conference (France, Montpellier,
2000), 12th World Congress of Medical Law (Siofok, Hungary, 1999), 5-ом конгрессе РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (Москва, Россия, 2002), XVI European Histocompatibility Conference (Strasbourg, France, 2002), 15th European Immunology Congress EFIS (Rodes, Greece, 2003), 17th European Histocompatibility Conference (Baden-Baden, Germany, 2003), 12th International Congress of Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS (Montreal, Canada, 2004), 3rd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment (Rio de Janeiro, Brazil, 2005), ХШ-ом Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, Россия, 2006), XVI Europe Congress of Immunology (Paris, France, 2006), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, Россия, 2007), 21st EFI Conference (Barcelona, Spain, 2007), VIII-ом Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, Россия, 2007).
Публикации
По теме диссертации опубликованы 53 печатные работы, в том числе: 1 монография; 35 статей в научной печати, из них 23 статьи в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций; 17 публикаций в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.
Объем и структура диссертации
