Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления об участии иммунной системы в регуляции регенерации кожи (обзор литературы) 10
1.1. Клеточные основы регенерации кожи 10
1.2. Основные механизмы регуляции регенерации кожи 15
1.3. Участие иммунокомпетентных клеток в репаративной регенерации кожи 23
1.4. Цитокиновая регуляция регенерации кожи 29
1.5. Воздействие иммуномодуляторов на репаративные процессы в коже... 34
1.6. Заключение 36
ГЛАВА 2. Методические вопросы исследования 38
2.1. Общая характеристика экспериментального исследования 38
2.2. Моделирование репаративных процессов в коже 39
2.3. Методы оценки иммунной системы 40
2.4. Методы оценки репаративных процессов в коже 45
2.5. Методы введения иммуномодуляторов 48
2.6. Методы культивирования фибробластов 49
2.7. Статистический анализ 50
ГЛАВА 3. Морфо-функциональная характеристика иммунной системы при регенерации кожной раны 51
3.1. Динамика острофазовых показателей при регенерации кожи 51
3.2. Характеристика центральных и периферических органов иммунитета 53
3.3. Морфо-функциональная характеристика фагоцитов крови 58
3.4. Характеристика иммунокомпетентных клеток в зоне кожного регенерата
3.5. Заключение 62
ГЛАВА 4. Влияние рибомунила на регенерацию кожи 70
4.1. Влияние рибомунила на показатели крови и иммунного статуса 70
4.2. Влияние рибомунила на заживление кожной раны 75
4.3. Влияние рибомунила на фибробласты 81
4.4. Заключение 81
Общее заключение 83
Выводы 89
Практические рекомендации 90
Список литературы
- Участие иммунокомпетентных клеток в репаративной регенерации кожи
- Воздействие иммуномодуляторов на репаративные процессы в коже...
- Методы введения иммуномодуляторов
- Характеристика иммунокомпетентных клеток в зоне кожного регенерата
Участие иммунокомпетентных клеток в репаративной регенерации кожи
Регенерация кожи как совокупность процессов, обеспечивающих восстановление поврежденных структур ткани и поддержание клеточного гомео-стаза, находится под генетическим контролем и регулируется сложным комплексом факторов. Они разными путями прямо или опосредовано вмешиваются в процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Последний имеет отношение преимущественно к физиологической регуляции пролиферации не только лимфоидных клеток, но и кератиноцитов [11, 63, 129], что приобретает особое значение при старении [59]. Точкой приложения этих регуляторных стимулов (индуцирующих или ингибирующих) является морфологический субстрат регенерации - клетки эпидермиса, в том числе - и относящиеся к иммунокомпетентным.
В настоящее время имеются данные о сложной системе регуляции регенераторных процессов, которые действуют как на уровне целостного организма, так и на уровне ткани и клетки, которым посвящен ряд серьезных публикаций [31, 33, 111, 205, 207, 233, 235, 240]. Изучение механизмов регенерации кожи чаще всего основано на двух источниках: экспериментальные данные по заживлению кожной раны и клинико-лабораторные исследования различных патологических состояний кожи в клинике (псориаз, лимфома и т.д.). В данном обзоре с учетом цели исследования анализируются преимущественно экспериментальные и клинические данные, полученные на модели кожной раны.
Заживление кожной раны представляет собой комплекс процессов, включающих образование кровяного сгустка, воспаление, новообразование грануляционной ткани, формирование рубца и ремоделирование эпидермиса. Регуля-торные механизмы этих процессов включают разнообразные эндогенные и экзогенный факторы, действие которых на клетку реализуется различными путями - часто через сигнальные [189, 235].
Одним из важных регуляторов регенерации является нейро-эндокринная система, влияние которой на регенерирующую кожу многообразно и разнона-правлено, что нашло отражение во множестве публикаций. Большинство из них посвящено изучению вегетативной нервной системы. В частности, известны факты ускорения заживления кожной раны в десимпатизированной ткани. Определенная роль в этом принадлежит и нейротрансмиттерами. Так, ацетил-холин является аутокринным регулятором эпидермальных кератиноцитов [103].
Гормоны модулирую пролиферативную активность неоднозначно, в зависимости от вида гормона, его концентрации и времени действия. Наиболее выраженное влияние на оказывают глюкокортикоиды [51, 68 ].
Таким образом, кожа является мишенью для нейро-эндокринных влияний, что возможно благодаря наличию в дерме и эпидермису холинергических, адренергических, опиоидных рецепторов, а также рецепаторов практически ко всем гормонам. В то же время клетками кожи продуцируется ряд гормонов, нейропептидов и нейротрансмиттеров. Это дает основание говорить о существовании нейроэндокринной системы кожи [205].
Важнейшими «специализированными регуляторами регенерации кожи являются ростовые факторы (факторы роста).
Факторы роста (ФР) - полипептиды с молекулярной массой 5 000 -50 000, объединенные в группу трофических регуляторных субстанций. Они обладают широким спектром биологической активности. Их действие на клетки-мишени реализуется чаще всего через специфические рецепторы и проявляется воздействием на митогенез, хемотаксис, дифференцировку клеток. В регенерации кожи участвуют следующие ростовые факторы.
Семейство эпидермального ростового фактора - включает собственно эпидермальный фактор роста (ЭФР), гепарин-связанный ЭФР, амфирегулин, эпирегулин, эпиген, неурегулин, а также целое семейство специфических рецепторов. Эти факторы впервые были обнаружены в раневой жидкости [78, 133,241].
ЭФР (молекулярная масса 6.4 кД) действует как мощный митоген на различные клетки эндодермального, эктодермального и мезодермального происхождения, включая эпидермис, фибробласты, тиреоидные клетки и др. Основным местом синтеза являются слюнные железы. Обнаруживается также и в крови, ликворе, секретах желудочно-кишечного тракта. Интересно отметить, что концентрация данного фактора в раневой жидкости выше, чем в сыворотке крови [97, 193]. Является важным фактором заживления ран. Это связано с его влиянием на пролиферацию кератиноцитов. Представитель данного класса ФР -эпирегулин также является аутокринным регулятором пролиферации кератиноцитов в культуре [133, 189].
В последние годы в качестве объективного показателя нарушения про-лиферативных процессов в коже рассматривается рецептор к эпидермальному фактору роста [35].
Трансформирующие факторы роста (TGF, ТРФ) - группа многофункциональных молекул представленная как минимум тремя изоформами. Они продуцируются разными типами клеток в ответ на повреждение и участвуют в регуляции пролиферации различных тканей [130, 225, 237]. В частности, активация продукции TGF-J3 является важным фактором усиления репаративного потенциала кожи и стимулом для реэпителизации кожной раны [132, 192]. Они являются стимуляторами экспрессии внеклеточных матричных протеинов и ин 17 тегринов. Сразу после нанесения кожной раны они выделяются из тромбоцитов, вызывают хемотаксис нейтрофилов, макрофагов и фибробластов [99, 165, 192, 196]. Эти клеточные события приводят к ускорению формирования грануляционной ткани.
Воздействие иммуномодуляторов на репаративные процессы в коже...
Регенерацию кожи контролировали на основе комплексной, клинико-морфологической оценки заживления кожной раны.
Морфологическое исследование включало изучение гистологической картины кожного «регенерата». Для этого в разные сроки иссекали кожный лоскут с раневым дефектом, фиксировали, его в 10 % нейтральном формалине, проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином-эозином и пикрофуксином по ван-Гизону.
Для оценки соотношения кислых и нейтральных ГАГ в межуточном.веществе соединительной ткани выполняли окраску по Хейлу и ставили ТТТИК-реакцию по стандартным методикам.
Оценку моноцитарно-макрофагальной тканевой реакции проводили по гистохимической окраске на неспецифическую эстеразу с ингибицией тартра-том натрия, используя коммерческий набор красителей (НПФ «Абрис+», Россия).
Для объективизации количественных различий локальной и системной реакций иммунной системы при введении препаратов использовали компьютерную морфометрию. Она включала определение в коже объемной доли клеток на единицу площади грануляционной ткани и абсолютного числа лимфоцитов на единицу поверхности, определение среднего диаметра лимфоидных фолликулов и их структурных зон в брыжеечных лимфатических узлах и селезенке. Для реализации этих задач использован аппаратный видеокомпьютерный комплекс SIAMS-610 (регистрационное свидетельство № 940176-25.04.94). В его состав входят микроскоп Биолам-Р-15, видеокамера Hi-Sharp-135 и персональный компьютер IBM РС\АТ, а также программное обеспечение системы, что обеспечивает процесс ввода в компьютер массива информации изображений, получаемых при изучении стандартных гистологических препаратов, обработку вводимых изображений, их анализ и составление отчета (рисунок 4).
Для уточнения характера клеточной реакции при введении животным ри-бомунила применяли электронно-микроскопическое исследование. Для этого из центрального и периферического отделов кожной раны иссекали фрагменты, размер которых не превышал 1мм. Их фиксацию осуществляли в 2,5% растворе глутарового альдегида. Затем проводилась импрегнация материала 0,1% раствором черырехокиси осмия и обезвоживание в спиртах восходящей концентрации. После этого кусочки ткани заливали в эпоксидную смолу аралдит. Аралдитовые блоки резали на ультрамикротоме ЛКБ. Полученные срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Приготовленные таким образом препараты исследовали с помощью электронного микроскопа «Джеол»-200С при ускоряющем напряжении 80 киловольт и рабочем увеличении 7300.
Морфологические исследования выполнены совместно с сотрудниками отдела общей патологии ЦНИЛ УГМА (ст. научный сотрудник, канд.мед.наук И.Е.Валамина). Me fcd Ljbrary Sports lame Help
С целью иммуномодуляции репаративного процесса в коже животным с индуцированной регенерацией кожи (кожная рана) вводили водный раствор рибомунила (Франция), содержащий рибосомную фракцию Klebsiella pneumonia, Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae. В зависимости от способа и дозы введения препарата животных подразделяли на 4 группы: 1 группа — контроль (внутрибрюшинное введение прокаина), 2 группа - внутрибрюшинное введение препарата в дозе 0,001 мг, 3 группа - внутрикожное введение препарата (обкалывание области раны) в дозе 0,001 мг, 4 группа — внутрикожное введение препарата (обкалывание области раны) в дозе 0,0005 мг. Внутрикожно препарат вводили на глубину около 1 мм. Препарат разводили в 0,5 мл прокаина, контрольные крысы получали аналогичный объем прокаина. Рибомунил вводили течение 3 дней, начиная со дня операции. Выбор дозы препарата обусловлен существующими рекомендациями по его клиническому применению.
В предварительном исследовании нами было показано, что основные лабораторные показатели крови крыс (общий белок, лейкоциты, лейкоцитарная формула, гемоглобин) существенно не отличались в группах животных, получавших внутрибрюшинное или внутрикожное введение прокаина. Поэтому в качестве контрольной группы использованы животные, которым препарат вводили внутрикожно.
Для оценки влияния рибомунила на иммунную систему в одном из экспериментов исследование проводили на иммунизированных животных. Для этого крысам за 4 дня до забоя вводили внутрибрюшинно 1мл 10% взвеси эритроцитов барана.
Методы введения иммуномодуляторов
Реакция периферической крови в определенной степени отражает функцию костного мозга. Учитывая изменение числа миелокариоцитов на первые сутки после операции (таблица 4) можно предположить, что самые ранние сдвиги лейкоцитарной формулы носят перераспределительный характер, а в дальнейшем пролиферативная активность гемопоэтической ткани несколько повышается до исходного (предоперационного) уровня. Клеточность тимуса подвержена меньшим изменениям, хотя в первые сутки после моделирования раны она имеет тенденцию к снижению почти на 40% (р 0.05) , а на пятые сутки-к повышению.
Более выраженные изменения обнаружены при оценке синтетичесикх процессов в центральных органах иммунитета на основании оценки синтеза ДНК (таблица 5), измеренного по включению 3Н-тимидина. Таблица 5. Включение 3Н-тимидина в кариоциты костного мозга и лимфоидных органов (Бк/106 клеток)
В частности, в тимусе на пятые сутки после нанесения кожной раны включение Н-тимидина в ДНК тимоцитов увеличилось на 65%, а на 7 сутки — на 91% (р 0.05). В костном мозге в этот срок, данный показатель возрастает на 40% (р 0.05).
В важнейшем периферическом органе иммунной системы — селезенке, изменения активности синтетических процессов были менее выраженными, хотя и здесь отмечалась тенденция к повышению включения Н-тимидина в спле-ноциты на 28% (р 0.05) через неделю после моделирования хирургической раны (рисунок 5). Это сопровождалось и повышением способности спленоцитов к специфическому иммунному реагированию, что было выявлено в реакции иммунного розеткообразования. Количество АОК (ЕА-РОК), являющееся интегральным показателем состояния специфического иммунного ответа, на пятые сутки эксперимента возрастало на 31% (р 0.05). В этот период гуморальный иммунитет существенно не изменялся, во всяком случает титры специ-фиеских антител 54
Включение Н-тимидина в ДНК кариоцитов гемагглютининов (результаты в таблице представлены в виде отрицательного логарифма) оставались на прежнем уровне и тенденцию к их повышению отмечали только к моменту завершения полной эпителизации раны (таблица 6).
Для оценки гуморального иммунитета в клинике традиционно используют определение уровня сывороточных иммуноглобулинов, однако выполнение такого исследования у крыс часто проблематично, что обусловлено принципиальными особенностями проведения иммунохимических реакций. Поэтому для ориентировочной оценки уровня иммунных белков в сыворотке лабораторных животных мы определили концентрацию гамма-глобулинов. Она имела тенденцию к повышению на 10 - 14 сутки на 34% (р 0.05), что с некоторым опаз-данием отражает, вероятно, умеренную активацию гуморального звена иммунной системы (таблица 6), а возможно - и диспротеинемию, типичную для воспалительного процесса.
Все указанные изменения со стороны селезенки носили функциональный характер и не сопровождались структурными перестройками. Отсутствие морфологических изменений в селезенке, активации лимфопоэза в ней было доказано морфометрически (таблица 7).В частности, диаметр лимфоидных фолликулов и радиус маргинальной зоны оставались без существенных изменений в течение индуцированной регенерации кожи, в частности - через 7 суток после моделирования хирургической раны.
Аналогичные результаты были получены и при изучении брыжеечных лимфоузлов. Так, на третьи сутки после операции в лимфатических узлах имеются вторичные фолликулы с мелкими светлыми центрами. На пятые сутки лимфоциты заполняют все синусы. Подобная морфологическая картина сохраняется на десятые сутки, а на двадцатые - не отличается от дооперационной картины. При этом морфометрическое исследование не выявило существенных структурных изменний в лимфатических узлах в течение всего периода регенерации кожной раны: диаметр фолликулов и их светлых центров оставались без заметных сдвигов (таблица 8).
Наиболее эффекторными клетками, активно участвующими и в воспалительных, и в репаративных процессах являются нейтрофилы. Среди существующих разнообразных подходов к их оценке нами были выбраны тесты, характеризующие состояние как кислородзависимых внутриклеточных микроби-цидных систем (миелопероксидаза, НСТ-тест), так и кислороднезависимых (ЛКТ). В динамике регенерации кожной раны активность МП характеризуется снижением в раннем послеоперационном периоде на 46% (р 0.05) и подъемом на 46% от дооперационного уровня к 10 суткам (р 0.05) с последующей нормализацией (таблица 9).
Интерпретация этих сдвигов неоднозначна. Депрессию показателя на 3 сутки следует связать не с угнетением ферментативной активностью, а скорее — с дегрануляцией первичных гранул, приведшей к высвобождению фермента во внеклеточную среду, что характерно для острого воспаления. Пик активности на 10 сутки отражает, вероятно, усиление продукции нейтро-филокинов, чему некоторые авторы приписывают важную роль в репаративном процессе [10, 43, 44].
Характеристика иммунокомпетентных клеток в зоне кожного регенерата
Актуальность поиска новых путей оптимизации регенерации кожи определяет потребность в изучении механизмов иммунорегуляции восстановительных процессов в этой ткани. Наиболее удачной моделью для этих целей является кожная рана. Она позволяет в условиях эксперимента оценить течение репарации, соотношение системных и локальных клеточных реакций и их модификацию различными лечебными факторами.
В эксперименте на 124 крысах в динамике регенерации кожи была выявлена трехфазная реакция морфо-функциональных показателей, характеризующих состояние иммунной системы (рисунок 23). Первая фаза (1-3 сутки) характеризует острую воспалительную реакцию. Для нее характерна нейтрофиль-ная реакция крови и повышение уровня острофазовых белков и соответствующая морфологическая картина острого воспаления в области кожной раны. Бесспорно, что указанные изменения являются отражением активации иммуно-компетентных клеток, продуцирующих интерлейкины (прежде всего - ИЛ-1, ИЛ-2 и другие).
Вторая фаза, с пиком лабораторных сдвигов к 7 - 10 суткам, отражает активный репаративный процесс. Он сопровождается активацией Т-клеточного и моноцитарно-макрофагальных звеньев иммунной системы, как на уровне организма, так и локальных механизмов - в зоне репарации.
Полная эпителизация дефекта и формирование рубца свидетельствуют о восстановлении морфологической целостности ткани и характеризуются нормализацией иммунологических показателей.
В нашем исследовании отсутствовала возможность определения уровня продукции цитокинов клетками иммунной системы. Однако бесспорно, что эти процессы активно участвовали в течение регенерации. Причем можно предположить, что спектр продуцируемых цитокинов менялся. Многочисленными исследованиями показано, в патогенезе воспалительной
Обозначения: нф - нейтрофилы, лф - лимфоциты, СРБ - С-реактивный белок, фн - фибриноген, ДНК тим - включение 3Н-тимидина в тимоциты, реакции участвует комплекс провоспалительных ИЛ, индуцируемых повышенной продукцией ИЛ-1 [233]. Вполне вероятным представляется также и то, что активация моноцитарно-макрофагальной и Т-клеточной систем, выявленная в нашем исследовании в ряде тестов во второй фазе заживления кожной раны, сопровождается и усилением продукции данными клетками цитокинов, стимулирующих репаративный процесс - КСФ, ИЛ-6 и другие [235]. В то же время, в этот период снижается продукция хемоатрактантов (ИЛ-8), которые стимулируют воспалительную реакцию, но ингибируют интенсивность репаративного процесса [41, 102].
Следовательно, сопоставление лабораторных иммунологических показателей и морфологической картины формирования кожного регенерата указывает на участие иммунной системы в механизмах репарации, характер, которого меняется в разные фазы восстановительного процесса. Дополнительным подтверждением этого является изменение характера корреляционных связей между гематологическими и иммунологическими параметрами, а также между состоянием лимфоцитов и активностью репарации. Установленные закономерности изменения лабораторных иммунологических показателей, соответствующих разным фазам индуцированной регенерации кожи, представляют собой иммунологический мониторинг восстановительных процессов в коже (рисунок 24), что может быть использовано в дальнейших исследованиях, а также в клинической практике.
На основании проведенного исследования можно полагать, что хотя нами и не обнаружены специфические лабораторные маркеры регенерации (среди исследованных), установлено, что для нее характерна смена нейтрофильно-го лейкоцитоза моноцитарно-лимфоцитарным, нормализация уровня острофазовых реактантов и повышение уровня сывороточного альбумина.
Таким образом, в проведенном исследовании выявлены иммунологические параметры, соответствующие определенным стадиям регенерации кожной раны и коррелирующие с изменениями лимфоидных органов, позволяющие документировать их активность, что, и составляет сущность иммунологического мониторинга восстановительных процессов в коже.
Другой задачей исследования было изучение влияния парентерального введения рибомунила на показатели иммунологической реактивности и течение репаративных процессов в коже.
Внутрибрюшинное введение рибомунила приводило к заметной иммуно-стимуляции (рисунок 24). Это проявлялось активацией синтетических и про-лиферативных процессов в лимфоидных органах - в селезенке и лимфатитче-ских узлах, преимущественно - В-зависимых зонах.
Внутрикожные инъекции препарата такими эффектами не сопровождались, то есть при этом отсутствовала системная реакция организма: выражен 84 ный лимфоцитоз, усиление синтеза ДНК в спленоцитах, повышение титра специфических гемагглютининов.
Обозначения: К - контроль, ВБ - внутрибрюшинное введение препарат, ВК -внутрикожные инъекции. Лф - лимфоциты, ЗН - включение ЗН-тимидина в тимоциты.
Вместе с тем, количество лимфоцитов в зоне регенерата существенно увеличивалось, что указывает на активирующее влияние рибомунила в отношении SALT. Это определяет возможность использования данного способа введения рибомунила у пациентов с гиперреактивностью иммунной системы при необходимости только локальной стимуляции иммунной системы кожи.
