Содержание к диссертации
Введение
I. Список сокращений
Использование статинов - новая стратегия лечения аутоиммунных заболеваний (обзор данных литературы) 16
III. 1. Общие свойства статинов 21
Ш.2. Применение статинов в кардиологии 23
Ш.3. Холестериннезависимые эффекты статинов 24
III.4. Влияние статинов на иммунную систему 29
III 4.1. Экспрессия МНС класса II 29
Ш.4.2. Презентация антигена 30
111.4.3. Функции Thl и Т1г2-лимфоцитов 31
111.4.4. Экспрессия молекул адгезии 34
III. 4.5. Подвижность и миграция лейкоцитов 35
III. 4.6. Синтез провоспалительных цитокинов 3 7
Ш.5. Применение статинов у животных с экспериментальными аутоиммунными заболеваниями 39
Ш.6. Использование статинов при аутоиммунных заболеваниях у человека 46
Ш.7. Заключение 48
Iv. Материалы и методы 49
V. Результаты собственных исследований 65
V. 1. Связь активности ра и псориаза, уровня цитокинов профиля тн1 , тн2, тн 17 лимфоцитов сыворотки пк с содержанием холестерина про и анти-атерогенных субфракций липопротеинов
содержания цитокинов и липидов периферической крови при РА з
V.L2. Взаимосвязь выраженности поражения кожи, содержания различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток., цитокинов и
липидов периферической крови при псориазе 77
V.2. Эффективность и безопасность использования симвастатина у больных ра на фоне приема болезнь-модифицирующих препаратов 85 CLASS V.3. Изучение действия статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК ПК 100 CLASS
V.3.L Влияние приема симвастатина больными РА на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК
ПК ex vivo 100
КЗ.2. Действие статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК ПК больных PA in vitro,
роль изопреноидов 105
V.4. Оценка влияния симвастатина на содержание цитокинов профиля ТНІ, ТН2, ТНІ7-лимфоцитов, провоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных ра 110
V.5. Изучение действия статинов на продукцию цитокинов профиля ТНІ, ТН2, ТНІ 7-лимфоцитов, провоспалительных цитокинов EX vrvo И IN VITRO 121
V.5.1. Изменение синтеза цитокинов ex vivo МНК ПК больных РА, принимающих симвастатин 121
V.5.2. Влияние статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую продукцию цитокинов МНК ПК in vitro, роль
изопреноидов 130
V.6. Сравнительный анализ действия статинов и биологических препаратов для лечения ра на процесс фосфорилирования митоген активированных протеинкиназ (марк) Р38 и ERK1/2 in vitro в моноцитах больных РА 137
V.7. Изучение эффективности и безопасности использования ингибитора рз 8 марк второго поколения vx-702 у больных ра 148
V.8. Влияние терапии симвастатином на маркеры атеросклероза у больных ра 167
V.9. Выявление предикторов клинического ответа на симвастатин при ра 181
V. 10. Влияние статинов и биологических препаратов для лечения ра на активацию вэб-специфичных т-лимфоцитов у здоровых людей и больных ра 202
V. 11. Иммунофармакодинамика статинов и их клиническая эффективность у больных псориазом 212
V.12. Изменения липидного спектра крови у больных псориазом до и после лечения симвастатином 223
V.13. Изучение фармакоэкономических показателей применения симвастатина при псориазе 228.
VI. Обсуждение результатов собственных исследований 233
VII. Заключение 257
VIII. Выводы 262
IX. Практические рекомендации 265
X. Список литературы
- Влияние статинов на иммунную систему
- Подвижность и миграция лейкоцитов
- Связь активности ра и псориаза, уровня цитокинов профиля тн1 , тн2, тн 17 лимфоцитов сыворотки пк с содержанием холестерина про и анти-атерогенных субфракций липопротеинов
- Изменение синтеза цитокинов ex vivo МНК ПК больных РА, принимающих симвастатин
Введение к работе
Актуальность темы
Актуальность темы исследования обусловлена распространенностью таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит (РА) и псориаз – 1-4% населения (Abdel-Nasser A.M. et al., 1997), несовершенством методов их лечения, которые у значительной части больных не приводят к улучшению качества жизни, снижению риска ранней нетрудоспособности и смертности. Так, показано, что пятилетняя выживаемость больных РА сопоставима с выживаемостью пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца и лимфогранулематозом (Pincus T. et al., 1994).
В последние годы стало известно, что основной причиной высокой смертности больных аутоиммунными заболеваниями является раннее формирование и ускоренное прогрессирование атеросклеротического поражения сосудов, обусловливающего развитие инфаркта миокарда, инсульта, застойной сердечной недостаточности и внезапной смерти (Boehncke W.H. et al., 2008; Gabriel S.E., 2008; Salmon J.E. et al., 2008). РА и псориаз являются независимыми предикторами сердечно-сосудистых заболеваний (Gelfand J.M. et al., 2006; van Halm V.P. et al., 2008). Очевидно, что поиск методов профилактики и лечения кардиоваскулярных осложнений является не менее актуальной проблемой, чем разработка новых эффективных методов фармакотерапии самих болезней. Тем более, существующие в настоящее время методы системной терапии РА и псориаза не способны в достаточной мере снижать риск развития сердечно-сосудистых заболеваний или повышают его.
Известно, что при хроническом воспалении изменения в иммунной системе сопряжены с изменениями липидного обмена в крови, печени, жировой и других тканях. Обсуждаются два основных механизма интеграции метаболизма липидов и иммунного ответа, один из которых связан с синтезом холестерина (Shimizu T., 2009), другой – с активностью суперсемейства ядерных Х-рецепторов (Varga T. et al., 2008). Предполагается, что эта взаимосвязь лежит в основе общности патогенеза аутоиммунных заболеваний и атеросклероза и является основанием для поиска препаратов, обладающих многоцелевым действием – противовоспалительным, антиатерогенным и иммуномодулирующим.
Этим требованиям в большей мере отвечают ингибиторы 3-гидрокси-3-метил коэнзим А (ГМГКоА) редуктазы (статины) благодаря открытию у них новых, холестериннезависимых иммуномодулирующих и противовоспалительных свойств. Так, установлено, что статины снижают экспрессию MHC класса II, процессинг и презентацию антигена, модулируют активность Th1 и Th2-лимфоцитов, влияют на синтез про- и противовоспалительных цитокинов и др. (Greenwood J. et al., 2006). Реализацию перечисленных эффектов связывают со способностью статинов предотвращать образование промежуточных продуктов биосинтеза холестерина – изопреноидов. Эти метаболиты участвуют в посттрансляционной прениляции ряда белков, в том числе – мономерных ГТФаз (Ras, Rho и др.), выполняющих роль «молекулярных переключателей» дифференцировки, пролиферации, апоптоза и пр. различных клеток. Изменение функции клеток осуществляется путем активации пренилированными ГТФазами некоторых внутриклеточных сигнальных путей, среди которых важная роль принадлежит семейству протеинкиназ (Perez-Sala D., 2007), в частности, митоген-активированным протеинкиназам (МАРК) (Lim L. et al., 1996). МАРК передают сигнал факторам транскрипции, активация которых приводит к изменению экспрессии генов белков, участвующих в реализации воспаления и иммуномодуляции (Karin M., 2004).
Открытие противоспалительных и иммуномодулирующих свойств статинов послужило обоснованием их применения у животных с экспериментальными аутоиммунными заболеваниями (коллаген-индуцированный артрит, ретинит и др.) (Gegg M.E. et al., 2005; Leung B.P. et al., 2003; Yamagata T. et al., 2007), при которых показана профилактическая и терапевтическая эффективность статинов. Это побудило исследователей к изучению возможностей применения статинов при аутоиммунных заболеваниях у человека. В настоящее время работы, посвященные оценке эффективности и безопасности применения статинов при РА единичны (Kanda H. et al., 2002), а при псориазе – отсутствуют.
Анализ данных литературы по изучению иммунофармакодинамики статинов при лечении экспериментальных аутоиммунных заболеваний позволяет предполагать, что ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы могут влиять на следующие ключевые звенья патогенеза РА и псориаза (Greenwood J. et al., 2006):
Мононуклеарную инфильтрацию и пролиферацию в очаге воспаления (кожа, синовиальная оболочка)
Баланс активности Th1, Th2, Th17-лимфоцитов, продукцию про- и антивоспалительных цитокинов
Активацию внутриклеточных сигнальных молекул и др.
Несмотря на то, что РА и псориаз являются независимыми факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, данные о состоянии липидного обмена при этих заболеваниях противоречивы (Boers M. et al., 2003; Dessein P.H. et al., 2002; Mallbris L. et al., 2006; Seishima M. et al., 1994), а исследования, посвященные влиянию статинов на маркеры атеросклероза, единичны (McCarey D.W. et al., 2004).
Вышеизложенное позволяет предполагать, что назначение статинов при РА и псориазе может не только снизить активность воспаления, но и уменьшить риск развития атеросклероза путем реализации противовоспалительного, иммуномодулирующего и антиатерогенного действия. Это и определило цель и задачи исследования.
Цель исследования
Охарактеризовать липидный состав сыворотки крови и связь уровня различных субклассов сывороточных липопротеинов с активностью хронического воспаления у больных ревматоидным артритом и псориазом, обосновать патогенетическую терапию этих заболеваний ингибиторами 3-гидрокси-3 метилглютарил коэнзим А редуктазы, изучить их иммуномодулирующее, противовоспалительное и антиатерогенное действие.
Задачи исследования
-
Изучить особенности липидного обмена при РА и псориазе, связь активности РА, псориаза, синтеза провоспалительных цитокинов и цитокинов профиля Th1, Th2, Th17-лимфоцитов in vivo и ex vivo с уровнем холестерина в про- и анти-атерогенных субфракциях липопротеинов.
-
Оценить эффективность и безопасность применения симвастатина у больных РА на фоне приема стандартных болезнь-модифицирующих препаратов.
-
Охарактеризовать влияние симвастатина на содержание провоспалительных цитокинов и цитокинов профиля Th1, Th2, Th17-лимфоцитов в сыворотке крови больных РА.
-
Оценить влияние статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию МНК ПК и продукцию иммунорегуляторных и провоспалительных цитокинов ex vivo и in vitro, оценить роль снижения синтеза изопреноидов в иммуномодулирующем действии статинов in vitro.
-
Изучить влияние статинов и биологических препаратов для лечения РА на активацию митоген-активированных протеинкиназ (MAPK) p38 и ERK1/2 в моноцитах больных РА in vitro.
-
Оценить эффективность и безопасность использования специфического обратимого ингибитора p38 MAPK второго поколения VX-702 у больных РА.
-
Выявить влияние терапии симвастатином на липидные и иммунологические маркеры атеросклероза при РА.
-
Охарактеризовать признаки, отличающие подгруппы больных РА, ответивших и не ответивших на симвастатин, и разработать методы прогнозирования его эффективности.
-
Изучить действие статинов и биологических препаратов для лечения РА на содержание ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов у здоровых людей и больных РА.
-
Оценить влияние статинов на содержание субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, моноцитов ПК, уровень сывороточных цитокинов профиля Th1, Th2, Th17-лимфоцитов , выраженность поражения кожи и качество жизни у больных псориазом.
-
Охарактеризовать изменения параметров липидного обмена у больных псориазом до и после лечения симвастатином, оценить его фармакоэкономические показатели.
Научная новизна
Впервые показано, что в сыворотке периферической крови больных РА и псориазом выявляются проатерогенные изменения соотношения содержания холестерина различных субфракций липопротеинов, которые у больных РА прямо связаны с активностью воспаления и уровнем циркулирующих провоспалительных цитокинов.
Впервые установлено, что дополнительное к стандартному лечению DMARD назначение симвастатина больным активным РА снижает активность болезни. Впервые изучена иммунофармакодинамика статинов при РА, которая характеризуется снижением спонтанной, антиген-специфической пролиферации МНК ПК, антиген-специфической продукции IL-8, IFN-. Впервые выявлены механизмы антипролиферативного действия статинов у больных РА и механизмы ингибирования продукции цитокинов, обусловленные снижением содержания промежуточных продуктов синтеза холестерина.
Впервые установлено модулирующее действие статинов на продукцию цитокинов профиля Th2, Th17-лимфоцитов, провоспалительных цитокинов у больных РА in vivo и ex vivo, характеризующееся снижением уровня сывороточного IL-17, IL-6 у респондеров, повышением анти-CD3-стимулированного синтеза IL-10 и TNF-. Впервые выявлены субтипы РА, отличающиеся содержанием общего холестерина ЛП, холестерина ЛППП, IL-10 в сыворотке крови и ответом на терапию симвастатином. На основании этих данных впервые разработаны методы прогноза эффективности лечения статинами больных РА, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью.
Впервые выявлено, что в моноцитах ПК больных РА мевастатин, так же, как инфликсимаб, TNF-RI и IL-1Ra уменьшает активацию сигнальных молекул – МАРК р38, ERK1/2, причем это действие мевастатина частично обусловлено снижением содержания изопреноидов.
Впервые показано, что лечение симвастатином больных РА оказывает антиатерогенное действие путем коррекции дислипидемии, уменьшения содержания иммунологических маркеров атеросклероза - СРБ и IL-6 в крови.
Впервые выявлено, что у больных РА снижено содержание ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов, а мевастатин, так же, как инфликсимаб, TNF-RI и IL-1Ra не влияют на антиген-специфическую активацию ВЭБ-специфичных CD4+-лимфоцитов.
Впервые установлена эффективность монотерапии псориаза симвастатином, заключающаяся в уменьшении выраженности и площади поражения кожи. Прием симвастатина больными псориазом сопровождается увеличением системной активности Th2-лимфоцитов, липидкорригирующим действием, связанным с повышением содержания холестерина ЛПВП3. Применение симвастатина безопасно, имеет фармакоэкономические преимущества перед ацитретином.
Научно-практическая значимость
У больных РА и псориазом установлены проатерогенные изменения липидного спектра, крови, которые у пациентов с РА были ассоциированы с выраженностью системного воспаления. Эти данные свидетельствуют о патогенетической взаимосвязи нарушений липидного обмена и иммунной системы при аутоиммунных заболеваниях. Вследствие этого, в клинической практике у больных аутоиммунными заболеваниями необходимо оценивать липидный состав крови с целью выявления пациентов с высоким риском развития атеросклероза и ранней коррекции дислипидемии.
При РА и псориазе показано умеренное противовоспалительное действие симвастатина, сопряженное с иммуномодулирующими эффектами, снижением липидных и иммунологических маркеров атеросклероза. Результаты исследования обосновывают принципиально новую стратегию лечения аутоиммунных заболеваниях, основанную на использовании статинов как эффективных и безопасных препаратов с плейотропным действием.
Установлены и описаны субтипы РА, ответившие и не ответившие на лечение симвастатином. Охарактеризована прогностическая значимость трех лабораторных показателей, оценивающих состояние иммунной системы, липидного профиля крови и позволяющих в клинической практике с высокой точностью предсказывать ответ на лечение симвастатином.
Выявленные в работе механизмы иммуномодулирующего и противовоспалительного действия статинов определяют направление дальнейшего поиска мишеней для разработки новых лекарственных препаратов, уменьшающих воспаление и нормализующих липидный обмен при аутоиммунных заболеваниях. К числу таких потенциальных мишеней можно отнести ядерные гормональные рецепторы PPAR- и PPAR-, которые принимают участие в контроле за липидным обменом и иммунным ответом (Varga T. et al., 2008).
Теоретическое значение
Получены новые фундаментальные знания о взаимосвязи изменений в иммунной системе с нарушениями липидного профиля крови, свойственной хроническому воспалению аутоиммунной природы. Характер установленных связей при различных нозологических формах аутоиммунных заболеваний (РА, псориазе) имеет свои особенности и обусловлен механизмами, связанными с образованием не только холестерина, но и промежуточных продуктов его синтеза, обладающих провоспалительными и иммуномодулирующими свойствами.
Основные положения, выносимые на защиту
-
РА и псориаз характеризуются проатерогенными изменениями содержания холестерина различных субфракций липопротеинов сыворотки крови. Ряд показателей липидного профиля у пациентов с РА связан с активностью болезни, уровнем провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, а у больных псориазом – с содержанием HLA-DR+-моноцитов, CD3+,CD4+ и CD16+-лимфоцитов.
-
Применение симвастатина у больных активным РА умеренно эффективно и безопасно. Подгруппы больных, ответивших и не ответивших на лечение симвастатином, различаются по исходному содержанию общего холестерина, холестерина проатерогенной субфракции ЛППП и IL-10 сыворотки крови.
-
У больных РА и псориазом использование статинов приводит к многоцелевым эффектам – иммуномодулирующему, противовоспалительному и липидкорригирующему. Механизмы иммуномодулирующего и противовоспалительного действия частично обусловлены снижением уровня изопреноидов, а также уменьшением активности митоген-активированных протеинкиназ моноцитов.
-
Монотерапия симвастатином у больных с псориазом эффективна, безопасна и экономически выгодна, обладает липидкорригирующим действием, снижает активность Th2-лимфоцитов.
Апробация работы
Материалы работы были доложены и обсуждены на XV Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, Россия, 2007 г), 3-ей Международной Конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, Россия, 2007 г), Конгрессе Европейской Противоревматической Лиги (European League Against Rheumatism, EULAR) в 2007 г, (Барселона, Испания) и 2008 г, (Париж, Франция), Объединенном иммунологическом форуме 2008 (Санкт-Петербург, Россия, 2008 г), конференции «Дни иммунологии в Сибири», (Томск, Россия, 2008 г), V Конференции молодых ученых с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, Россия, 2008 г), Конгрессе EULAR в 2009 г (Копенгаген, Дания).
По результатам исследований получены положительные решения о выдаче патентов:
-
«Способ лечения псориаза» по заявке 2007-103-667/14(003950), 15.04.2009. Приоритет от 30.01.2007.
-
«Способ прогноза эффективности лечения ревматоидного артрита симвастатином». по заявке 2008-115-076/14(016778), 01.04.2009. Приоритет от 16.04.2008.
Публикации
Материалы работы изложены в 44 публикациях, в том числе в 16 статьях в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования результатов докторских диссертаций (14 статей в отечественных, 2 - в зарубежных журналах).
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 13 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и библиографического указателя. Материал изложен на 302 страницах машинописного текста, включающего 35 таблиц и 88 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 316 источников, из них 305 иностранных.
Работа выполнена в лаборатории клинической иммунофармакологии НИИКИ СО РАМН (руководитель – профессор Ширинский В.С.).
Автор благодарит руководителя лаборатории иммунопатологии НИИКИ СО РАМН профессора Кожевникова В.С., сотрудников лаборатории иммунопатологии НИИКИ СО РАМН, старшего лаборанта кафедры дерматовенерологии НГМУ Ягодину Е.В., ведущего научного сотрудника Института катализа СО РАН имени им. Г.К. Борескова, д.б.н. Ф.В. Тузикова, руководителя отделения ревматологии МУЗ ДКП №1 к.м.н. Чижова Н.Н., профессора Dinarello C.A., University of Colorado School of Medicine, Денвер, Колорадо, США, профессора Finlay A., University of Wales College of Medicine, Кардифф, Великобритания, за помощь в проведении исследования.
Влияние статинов на иммунную систему
Применение аторвастатина при экспериментальном аутоиммунном энцефалите приводит к снижению активности воспалительного процесса и уменьшению пролиферации Т-лимфоцитов. Эти изменения сопровождаются повышением синтеза цитокинов профиля Th2 (IL-4, IL-5 и IL10) и фосфори-лированием STAT6 (signal transducer and activator of transcription 6). STAT6 опосредует передачу внутриклеточного сигнала через gpl30 комплекс семейства IL-6 и играет важную роль в передаче сигнала от IL-6 и его семейства. STAT6 является молекулой, опосредующей IL-4-зависимую диферренциров-ку Тп2-лимфоцитов. В то же время при использовании аторвастатина было зарегистрировано снижение фосфорилирования STAT4, необходимого для IL-12-зависимой дифференцировки Thl-лимфоцитов. Выявлялось подавление синтеза IL-2, IL-12, IFN-y [311]. Этой же группой авторов было показано, что адоптивный перенос ТЬ2-лимфоцитов, полученных от пролеченных аторвастатином мышей, предотвращал развитие ЭАЭ у мышей-реципиентов [311]. Stanislaus et al исследовали изменения профиля цитокинов, синтезируемых стимулированными спленоцитами мышей с ЭАЭ, пролеченных лова-статином, по сравнению с контролем. В опытной группе наблюдалось снижение синтеза IFN-y и выраженное повышение продукции IL-10, снижение синтеза IL-6 и оксида азота. Дальнейшие исследования показали, что увеличение синтеза IL-10 при использовании статинов является одним из основных механизмов действия статинов при ТЫ-зависимых заболеваниях. Так, Nath et al выявили, что при ЭАЭ ловастатин повышает экспрессию GATA3 и уменьшает экспрессию NF-кВи T-bet [197]. GATA3 и T-bet являются факторами транскрипции, определяющими дифференцировку Th2 и ТЫ-лимфоцитов, соответственно [107, 193]. Эта же группа исследователей изучала влияние ловастатина на экспрессию генов, связанных с иммунной системой при ЭАЭ, используя микрочиповую технологию. Было показано разнонаправленное влияние ловастатина на экспрессию 158 генов, причем препарат подавлял экспрессию 140 генов и усиливал экспрессию всего лишь 18 генов. Ловастатин подавлял экспрессию генов лейкоцитарных маркеров и рецепторов, цитокинов/рецепторов, хемокинов/рецепторов, молекул адгезии, компонентов комплемента, факторов транскрипции и молекул, участвующих в передаче внутриклеточного сигнала. Важно отметить, что к числу генов, чья экспрессия повышается при использовании ловастатина, относятся IL-4, IL-10 и TGF-p [209]. Кроме повышения активности Тп2-лимфоцитов, некоторыми авторами было выявлено уменьшение синтеза цитокинов профиля ТЫ [15]. Помимо ЭАЭ, еще одной экспериментальной моделью ТЫ-зависимого заболевания, при которой удалось зарегистрировать сдвиг баланса Thl/Th2 в сторону Th2, ассоциированный с клиническим улучшением, был экспериментальный аутоиммунный миокардит (ЭАМ) [161]. Было показано, что использование аторвастатина при ЭАМ уменьшает выраженность воспалительного процесса и улучшает функцию миокарда, снижает содержание циркулирующих IFN-y и IL-2 и повышает концентрацию IL-4 и IL-10 в сыворотке.
Тем не менее, в ряде исследований не было установлено влияния ста-тинов на цитокины профиля Th2. Так, при экспериментальном аутоиммунном увейте (ЭАУ) ловастатин приводил к клиническому улучшению, ассоциированному с подавлением продукции IFN-y, не влияя на цитокины, синтезируемые Т1і2-лимфоцитами [88]. Аторвастатин лишь незначительно уменьшал уровень воспаления при ЭАУ, не оказывая влияния на ТЫ/Тп2-баланс [272]. Подобным образом симвастатин в выраженной степени подавляет коллаген-специфичный ТЫ-зависимый клеточный и гуморальный иммунный ответ у мышей с коллаген-индуцированным артритом [152]. В другом исследовании попытка использовать аторвастатин и розувастатин при коллаген-индуцированном артрите не увенчалась успехом [211]. Терапия ЭАМ флюва-статином приводит к уменьшению синтеза цитокинов профиля Thl и Th2-лимфоцитов [26].
В отличие от данных большинства экспериментальных работ, при изучении влияния статинов на ТЫ/Тп2-баланс в культуре МНК ПК, полученных от больных рассеянным склерозом, было показано, что симвастатин, ловаста-тин и мевастатин не влияют на синтез цитокинов Thl и Тп2-лимфоцитами [198]. Vollmer et al изучали клинико-иммунологическую эффективность сим-вастатина при рассеянном склерозе. Терапия симвастатином была ассоциирована со значительным уменьшением числа насыщенных гадолинием очагов в центральной нервной системе. Авторам не удалось зарегистрировать изменений цитокинового профиля у пациентов с клиническим эффектом [292].
Предполагается, что Тп2-стимулирующий эффект статинов может быть опосредован прямым воздействием на Т-лимфоциты [103] или антиген-презентирующие клетки [15, 311]. Arora et al изучали влияние статинов на способность дендритных клеток (ДК) изменять Тп1/Тп2-баланс. Было показано, что обработка ДК симвастатином приводила к дифференцировке субпопуляции ДК, характеризующейся высокой экспрессией В220. ДК этой субпопуляции приводили к повышению экспрессии GATA-3 и снижению экспрессии T-bet в CD4+ Т-лимфоцитах. Изменения экспрессии генов сопровождалось усилением продукции цитокинов профиля Th2 (IL-4, IL-5 и IL-13) и уменьшением цитокинов профиля Thl (IFN-y) Т-лимфоцитами. Th2-стимулирующий эффект симвастатина зависел от белка Yml [21]. Yml является членом семейства протеинов млекопитающих, обладающим гомологией с хитиназами низших организмов [116]. Известно, что хитиназы способствуют активации Тп2-лимфоцитов при аллергических заболеваниях [316].
Хотя точные механизмы влияния статинов на Thl/Th2 34 дифференцировку неизвестны, было показано, что в этот эффект статинов зависит от прениляции белков. Так, мевалонат препятствует вызванной аторва-статином активации Тп2-лимфоцитов [311]. В недавно проведенном исследовании было выявлено, что ингибирующее действие аторвастатина на ТЫ-лимфоциты опосредовано подавлением геранилгеранилирования RhoA и фарнезилирования Ras [66]. Роль подавления активности ГТФаз в терапевтическом действии статинов подтверждается эффективностью ингибиторов пренилтрансферазы при ЭАЭ [295].
Подвижность и миграция лейкоцитов
Для оценки влияния мевастатина и биологических препаратов для лечения РА на активацию ВЭБ-специфичных Т-хелперов у трех здоровых доноров и четырех больных РА забиралось по 20 мл венозной крови. МНК ПК выделялись как описано выше и культивировались (1х106/мл) в полной среде, дополненной 10 ЕД/мл рекомбинантного IL-2 в течение 18 часов, в присутствии 10 цМ мевастатина, 5 мкг/мл инфликсимаба, 5 мкг/мл r-met-Hu-sTNF-RI и 10 мкг/мл IL-lRa. Для антиген-специфической стимуляции в культуры вносился экстракт ВЭБ-инфицированных клеток (Advanced Biotechnologies, США) в концентрации 10 мкг/мл. Через 1 час инкубирования в культуры добавлялся брефелдин A (Calbiochem, США) в конечной концентрации 5 мкг/мл.
После 18 часов культивирования МНК ПК отмывались в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР), содержащем 0,1% NaN3 и окрашивались в течение 15 мин конъюгированными с FITC антителами к CD4 (Медбиоспектр, Россия). Далее клетки фиксировались 1% параформальдеги-дом. Пермеабилизация проводилась 0,2% раствором Твина-20. После пер-меабилизации клетки дважды отмывали и инкубировали с РЕ-конъюгированными антителами к IFN-y или РЕ-конъюгированными IgG2a (изотипический контроль)(ВБ Bioscience, США) в течение 20 минут. После двукратной отмывки клетки ресуспендировали в 1% параформальдегиде и анализировали на проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences, США). В каждой пробе анализировалось как минимум 500 000 событий. Лимфоцитарный гейт устанавливался в соответствии с характеристиками прямого и бокового светорассеяния. Квадранты на скатерограммах флюоресценции устанавливались по образцам, окрашенным антителами изотипиче-ского контроля. Концентрация ВЭБ-специфичных Т-хелперов оценивалась как содержание CD4+, 1Р Т-у+-лимфоцитов на 500 000 CD4+-лимфоцитов.
Иммунофармакодинамика статиное и их влияние на выраженность воспаления кожи и качество жизни у больных псориазом. После предварительного скринингового осмотра и обследования 52 больных псориазом в открытое сравнительное исследование эффективности и безопасности симвастатина при псориазе было включено 27 пациентов. Главными критериями включения являлись диагноз псориаза, поставленный более чем за 3 месяца до включения в исследование, поражение более 10% кожи. За один месяц до включения и в течение всего исследования не разрешалось использовать препараты для системной терапии псориаза (ретинои-ды, метотрексат и циклоспорин А, биологические препараты) и фототерапию. Допускалось применение местных аппликаций глюкокортикоидов низкой активности. Пациенты получали симвастатин в дозе 40 мг в день в течение двух месяцев. Обследование проводилось перед началом лечения и далее один раз в четыре недели.
На каждом визите осуществлялась оценка безопасности, включавшая клиническое обследование и определение активности трансаминаз в сыворотках ПК.
Группа непараллельного контроля была сформирована из 12 пациентов, принимавших участие в открытом исследовании эффективности активированных аутологичных Т-лимфоцитов на фоне стандартного лечения псориаза.
Перед началом исследования был проведен предварительный расчет количества пациентов в группе симвастатина, который бы позволил с мощностью 80% выявить 30%) различие выраженности изменения PASI между опытной и контрольной группами при их соотношении 1:1. Предполагаемый размер эффекта при приеме симвастатина был определен нами на основании результатов проведенного ранее пилотного испытания. Было подсчитано, что для обеспечения необходимой мощности исследования в опытную группу следует включить минимум 12 больных [53].
Опытная и контрольная группы сравнивались по относительному улучшению PASI, DLQI и частоте 50%, 75% и 90% уменьшения PASI в динамике при лечении. Первичной конечной точкой исследования было улучшение PASI в процентах. На каждом визите у больных забиралось по 5 мл венозной крови для оценки безопасности и определения содержания циркулирующих цитокинов.
Идентификацию популяций лимфоцитов и моноцитов осуществляли с использованием моноклональных антител как описано выше. Содержание циркулирующих IL-17, IL-10 и IFN-y оценивалось как описано ранее. Изменения липидного спектра крови у больных псориазом до и после лечения сим в астатин ом.
В открытое исследование «до-после» было включено восемь пациентов с псориазом. Главными критериями включения являлись диагноз псориаза, поставленный более чем за 3 месяца до включения в исследование, поражение более 10% кожи. За один месяц до включения и в течение всего исследования не разрешалось использовать препараты для системной терапии псориаза (ретиноиды, метотрексат и циклоспорин А, биологические препараты) и фототерапию. Разрешалось использовать местные аппликации глюкокор-тикоидов низкой активности. Пациенты получали симвастатин в дозе 40 мг в день в течение двух месяцев. Оценка показателей липидного обмена заключалась в определении содержания холестерина ЛПВП2, ЛПВПз, ЛПНПьз, ЛППП, ЛПОНПз-5 и ЛПОНГІ1.2.
Связь активности ра и псориаза, уровня цитокинов профиля тн1 , тн2, тн 17 лимфоцитов сыворотки пк с содержанием холестерина про и анти-атерогенных субфракций липопротеинов
Известно, что у больных РА воспалительный инфильтрат в синовиальной оболочке состоит из малых лимфоцитов, макрофагов и плазматических клеток [138]. Среди субпопуляций Т-лимфоцитов в синовиальной оболочке преобладают клетки с поверхностными маркерами CD4+, CD45RO 1+, CD29bi+, CDlla/CD18(LFA-l)hi+, CD49d/CD29(VLA-4)hi+, CD44hi+ и CD7,0W+, соответствующим фенотипу Т-лимфоцитов памяти [138]. Снижение пролиферации этих клеток является одним из механизмов развития клинического эффекта при использовании болезнь-модифицирующих противоревматических препаратов [55, 106]. В экспериментальной модели РА - коллаген II (СИ)-индуцированном артрите у мышей - продемонстрировано ингибирую-щее влияние симвастатина на СП-индуцированную активацию лимфоцитов [152]. Данные о действии статинов на антигенспецифическую и антигеннеспецифическую пролиферацию лимфоцитов у больных РА отсутствуют.
В настоящем разделе работы изучалось влияние приема симвастатина на aHTH-CD3, СП-индуцированную и спонтанную пролиферацию лимфоцитов периферической крови больных активным РА. Выбор этих экспериментальных моделей не случаен. Считается, что спонтанная пролиферация МНК ПК больных активным РА свидетельствует о преактивации этих клеток в условиях in vivo [2]. AHTH-CD3-индуцированная пролиферация неспецифична и не требует процессинга и презентации антигена. В третьем случае СП относится к числу потенциальных аутоантигенов, и можно предполагать, что вызванный им пролиферативный ответ может регистрироваться у части пациентов с РА, поскольку существуют другие кандидатные аутоантигены [138].
В исследование было включено 18 пациентов с активным РА (средний DAS28 - 6,7 95% доверительный интервал (ДИ) 6,3-7,1) и средней продолжи 101 тельностью болезни 9,6 лет (95% ДИ 7,1-12,1).
Положительный пролиферативный ответ (определяемый как ИОЗ) на антитела к CD3 и СП был выявлен у 18 (100%) и 3 (16%) пациентов соответственно.
На рис. 14 представлены значения спонтанной и анти-СОЗ-индуцированной пролиферации МНК ПК и ИС в динамике при лечении. Прием симвастатина приводил к достоверному снижению спонтанного включения ЗН тимидина МНК ПК. Абсолютные значения анти-СОЗ-индуцированной бласттрансформации МНК ПК и ИС не изменялись (рис. 14).
Далее изучалось влияние приема симвастатина на антиген-стимулированную пролиферацию МНК ПК. На рис. 15 показана динамика СП-индуцированной, спонтанной пролиферации и ИС на 7 день культивирования. В конце курса терапии симвастатином определялось достоверное снижение ИС МНК ПК, активированных СП (рис. 15). Изменений абсолютных показателей СП-индуцированной инкорпорации ЗН-тимидина выявлено не было (рис. 15).
Предполагается, что иммуномодулирующие свойства статинов могут быть обусловлены снижением уровня промежуточных продуктов синтеза холестерина - фарнезила пирофосфата (FPP) и геранила пирофосфата (GGPP), осуществляющих пренилирование ряда белков, в частности малых ГТФаз, которые участвуют в функционировании клеток иммунной системы [100]. Другим возможным механизмом подавления пролиферации при использовании статинов может быть их прямое действие, заключающееся в уменьшении синтеза холестерина и липопротеинов низкой плотности, обладающих стимулирующим действием на клетки иммунной системы, опосредованным активацией МАРК ERK1/2 [263].
Для изучения механизмов влияния статинов на пролиферацию МНК ПК больных РА проводилось исследование, оценивающее влияние меваста-тина в культурах in vitro на антигензависимую, антигеннезависимую и спон 102 тайную пролиферацию больных активным РА при добавлении в культуры промежуточных продуктов синтеза холестерина.
Действие статинов на антигенспецифическую и антигеннес-пецифическую пролиферацию МНК ПК больных PA in vitro, роль изопре-ноидов
Эксперименты проводилось на МНК ПК трех больных активным РА, участвовавших в исследовании, изучавшем влияние приема симвастатина на пролиферацию МНК ПК ex vivo. У этих больных был зарегистрирован положительный индекс стимуляции ( 3) МНК ПК коллагеном II типа.
В культуры in vitro добавляли мевастатин в различных концентрациях. Для стимуляции культур использовали анти-СОЗ и СП. С целью оценки влияния изопреноидов на действие мевастатина в культуры вносились мева-лоновая кислота, геранил-геранил пирофосфат или фарнезил пирофосфат.
Результаты эксперимента представлены на рис. 16. Из рисунка видно, что мевастатин в концентрациях 0,1, 1 и 10 цМ не влиял анти-СБЗ-индуцированную пролиферацию МНК ПК. На рис. 17 показано действие мевастатина на СП-индуцированную пролиферацию МНК ПК больных РА.
Как следует из рисунка, мевастатин в концентрациях 0,1 и 1 иМ не влиял на антиген-специфическую пролиферацию МНК ПК. При увеличении концентрации препарата до 10 цМ было зарегистрировано статистически значимое подавление пролиферации, вызванной СП. L-мевалонат предотвращал это действие препарата, не восстанавливая бласттрансформацию до значений, достигнутых в контроле (рис. 17).
Таким образом, установлено, что прием симвастатина больными с активным РА к концу лечения снижает спонтанную, обусловленную преакти-вацией in vivo, и специфическую СП-индуцированную пролиферацию МНК ПК, что ассоциируется с уменьшением активности болезни. Эти иммунофар-макодинамические эффекты статинов обусловлены снижением синтеза изопреноидов, поскольку L-мевалонат отменяет антипролиферативное действие мевастатина in vitro.
Необходимо отметить, что лимфоциты периферической крови у больных РА в целом обладают сниженной реактивностью в ответ на большинство митогенов и антигенов различного происхождения [255]. Исключением является повышенный пролиферативный ответ на СП, выявляемый у подгруппы больных РА, характеризующейся большей активностью заболевания и более быстрым прогрессированием повреждения суставов [128].
При этом влияния статинов на неспецифическую (aHTH-CD3-индуцированную) пролиферацию в динамике после лечения не зарегистрировано.
Результаты этого раздела работы свидетельствуют о том, что статины влияют на одно из ключевых звеньев патогенеза РА - пролиферацию моно-нуклеаров, что вносит существенный вклад в реализацию клинического эффекта.
Изменение синтеза цитокинов ex vivo МНК ПК больных РА, принимающих симвастатин
Далее проводилось изучение корреляции содержания холестерина различных субфракций липопротеинов сыворотки крови до начала лечения и выраженности снижения активности болезни после терапии симвастатином. На рис. 71 показаны результаты корреляционного анализа содержания общего холестерина ЛП и холестерина ЛПГШ и динамики DAS28 после завершения курса лечения. Как видно из рисунка, выявлялась достоверная положительная корреляция базового уровня холестерина J1111Ш и улучшения DAS28. Связи уменьшения активности болезни с содержанием общего холестерина (рис. 71) ЛП, других субфракций липопротеинов (данные не представлены) не показано.
На основании этих результатов для изучения операционных характеристик теста прогнозирования клинического ответа на симвастатин, основанного на определении содержания общего холестерина ЛП и холестерина J1111111, были построены ROC-кривые (рис. 72). Площадь под кривой для общего холестерина ЛП составила 0,8444 (95% доверительный интервал 0.6269-1.062, р = 0,03882), для холестерина ЛППП - 0,9111 (95% доверительный интервал 0,7536-1,069, р = 0,01367). В соответствии с классификацией Swets [268], определение содержания холестерина ЛППП является тестом, с высокой точностью предсказывающим развитие EULAR-ответа на терапию симвастатином. Выявление общего холестерина ЛП обладает умеренной информативностью для прогноза успешного ответа на лечение.
Следующим этапом оценки операционных характеристик изучаемых параметров было определение чувствительности, специфичности и отношения правдоподобия (табл. 27, 28). Точкой разделения содержания общего холестерина ЛП, соответствующей максимальным показателями чувствительности и специфичности, была 169,4 мг/дл. Этой точке разделения соответствуют чувствительность 80%, специфичность 88,89% и отношение правдоподобия 7,2 (табл. 27).
Оптимальной точкой разделения концентрации холестерина J1111 ill можно считать 10,1 мг/дл (чувствительность 100%, специфичность 66,67%, отношение правдоподобия 3) (табл. 28).
Таким образом, в настоящем разделе работы продемонстрирована более высокая базовая концентрация сывороточного IL-10, снижение содержания общего холестерина ЛП и уменьшение уровня холестерина J1111111 у больных РА, ответивших на терапию симвастатином. Снижение активности болезни коррелировало с повышенным базовым уровнем IL-10 и уменьшением содержания циркулирующего IFN-y, холестерина ЛППП. Операционные характеристики изучаемых параметров свидетельствуют об умеренной информативности содержания сывороточного IL-10 и общего холестерина ЛП предсказывать развитие EULAR-ответа на терапию симвастатином. В то же время, определение уровня холестерина ЛППП является тестом, обладающим высокой прогностической точностью.
Следует подчеркнуть, что в выбранном компромиссе между чувствительностью и специфичностью теста, при использовании низкотоксичных и недорогих препаратов, предпочтение следует отдать высокочувствительным тестам, возможно даже в ущерб специфичности. В таком случае клиницист получает возможность выявлять максимально большее количество пациен 199 тов, у которых терапия будет эффективна.
Итак, операционные характеристики тестов определения содержания в сыворотке ПК общего холестерина ЛП, IL-10, холестерина ЛППП, позволяют отнести их к прогностически значимым критериям, поскольку их чувствительность составляет 80%, 88,9% и 100%, соответственно. Следовательно, у врача, принимающего решение о целесообразности назначения симвастатина больным РА, существует три возможности предсказать клинический эффект. Решение может быть принято с учетом различий в чувствительности и специфичности и/или стоимости метода.
Важно также отметить, что среди более чем 40 клинических и лабораторных признаков, характеризующих респондеров и нереспондеров, только 3 показателя (содержание общего холестерина ЛП, холестерина ЛППП и IL-10) позволяют различать эти две подгруппы больных. Примечательно, что первые два показателя оценивают липидный состав крови, а третий - функциональную активность ряда клеток иммунной системы. Это является еще одним свидетельством тесной взаимосвязи нарушений липидного обмена, выраженности воспаления, изменений в иммунной системе при РА и позволяет предполагать, что клинически однородные группы больных РА разнородны патогенетически. Эти группы можно определить, как субтипы болезни (Таблица 29).
Как видно из таблицы, клинико-иммунологические субтипы РА различались ответом на терапию симвастатином, уровнем базового содержания холестерина некоторых липопротеинов и IL-10, динамикой уровня циркулирующих цитокинов. Важнейшим требованием к любому противовоспалительному или бо-лезнь-модифицирующему препарату, используемому для лечения РА, является безопасность. Известно, что РА ассоциирован с 2-5 кратным повышением риска развития неходжскинских лимфом [27]. В некоторых исследованиях было показано, что терапия ингибиторами TNF-a и метотрексатом может приводить к еще большему повышению вероятности развития лимфом [302].Одним из возможных механизмов увеличения риска развития лимфомы при использовании ингибиторов TNF-a и метотрексата является подавление специфического иммунного ответа к вирусу Эпштейн-Барра (ВЭБ) и реактивация латентной ВЭБ-инфекции [77].
Учитывая способность статинов уменьшать антигенспецифическую стимуляцию лимфоцитов, можно предположить, что статины снижают ВЭБ-специфичный иммунный ответ. Теоретически такое свойство статинов может делать небезопасным их длительное применение у больных РА.
Исходя из этого нами было проведено сравнительное исследование влияния мевастатина и биологических препаратов на активацию ВЭБ-специфичных Т-хелперов in vitro, результаты которого будут изложены в следующей главе.
![Исследование клинической эффективности и механизмов действия имунофана при хронических обструктивных заболеваниях легких [Электронный ресурс]](/i/i/4458/187831.png "Исследование клинической эффективности и механизмов действия имунофана при хронических обструктивных заболеваниях легких [Электронный ресурс] Бондаренко Наталья Леонидовна")
