Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Биологические свойства интерферонов 7
1.2. Система интерферона и ее роль в поддержании гомеостаза 22
1.3. Оценка функционального состояния системы интерферона, интерфероновый статус 27
1.4. Интерфероновый статус в норме и при разных формах патологии 30
1.5. Существующие методы анализа активности интерферона и интерферонового статуса 33
2. Материалы и методы 37
2.1. Материалы 37
2.2. Методы 38
3. Результаты собственных исследований и их обсуждение43
3.1. Поиск оптимальных методов исследования системы интерферона 43
3.2. Изучение активности перспективных индукторов интерферонообразования 57
3.3. Исследование интерферонового статуса больных с разными формами патологии 61
4. Заключение 86
5. Выводы 98
Приложение 99
Список литературы 101
- Биологические свойства интерферонов
- Существующие методы анализа активности интерферона и интерферонового статуса
- Поиск оптимальных методов исследования системы интерферона
- Исследование интерферонового статуса больных с разными формами патологии
Введение к работе
Интенсивное развитие биологии объясняет повышенный интерес к процессам, протекающим в организме. Научные открытия последних лет сформировали новое направление в иммунологии — исследование системы интерферона. Открытые в качестве природных противовирусных факторов, в настоящее время интерфероны рассматриваются как одни из ключевых регуляторов не только защитных, но и многих физиологических процессов протекающих в организме.
Внедрение в медицинскую практику интерферонов, индукторов их образования, иммуномодуляторов обусловило интерес исследователей к оценке влияния этих веществ на регуляторные и защитные системы организма. Оценка эффективности, изучение механизмов действия новых лекарственных средств не может быть полным без определения состояния системы интерферона. Поиск и изучение НОВЫХ индукторов интерферонообразования, иммуномодуляторов обязательно предусматривает определение их влияния на процессы продукции интерферона как на лабораторных моделях, так и на уровне организма.
Существующие методы количественного определения активности интерферона и оценки интерферонового статуса весьма трудоемки, продолжительны и не всегда позволяют получать точные и воспроизводимые результаты. Кроме того, они отличаются большой себестоимостью и высокими требованиями к профессионализму исполнителя.
Поэтому представляется актуальным дальнейшее развитие и оптимизация методов определения активности интерферона, что крайне необходимо для правильной оценки состояния системы интерферона и обнаружения интерферониндуцирующего действия различных соединений химической и биологической природы.
Углубленные исследования интерферонового статуса при разных формах патологии помогут глубже понять механизмы развития заболевания, определить тактику лечения и прогнозировать его исход.
Цель работы
Усовершенствование методов изучения состояния системы интерферона для дальнейшего исследования интерферонового статуса при различных заболеваниях и проведения скрининговых исследований по обнаружению новых индукторов интерферона.
Задачи работы
-
Определить оптимальные условия и компоненты биологической тест-системы для исследования антивирусной активности интерферонов.
-
Автоматизировать учет результатов определения активности интерферона.
-
Оптимизировать условия изучения интерферонового статуса.
-
Исследовать интерфероновый статус при ряде инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний.
5.Изучить действие некоторых индукторов образования интерферона в условиях in vitro и in vivo.
Научная новизна
Разработан оригинальный высокочувствительный вариант методики определения противовирусной активности интерферона (ИФН) с автоматическим учетом результатов. Для его осуществления, после окраски/фиксации клеточного монослоя, впервые предложено использовать экстрагирование связавшегося красителя 2%-ным раствором додецилсульфата Na на 5% глицерине с последующим измерением оптической плотности материала. Величина экстинкции оказалась прямо пропорциональна количеству клеток монослоя, защищенных ИФН. Впервые предложено использовать калибровочную кривую зависимости оптической плотности экстрактов окрашенного клеточного монослоя от активности стандартного препарата ИФН. Определен характер зависимости величины оптической плотности клеточных экстрактов от уровня антивирусной активности ИФН.
Для оценки ИФН статуса впервые применили новый режим инактивации NDV и кислотолабильных ИФНов либо экспозицией в течение 1 часа при 37С и рН 2.0 либо термической инактивацией в течение 1 часа при 56С. Разработанный способ инактивации существенно сокращает сроки проведение исследований ИФН статуса.
Для изучения ИФН-индуцирующей активности химических соединений впервые предложено использовать клетки перевиваемой линии Namalva, что позволило стандартизовать условия проведения исследований.
Впервые обнаружены некоторые общие закономерности динамики показателей ИФН статуса при различных формах патологии и разных схемах лечения. Показана взаимосвязь изменений показателей
ИФН статуса с динамикой других клинико-лабораторных параметров; выявлена возможность выбора тактики лечения больных и прогнозирования исходов некоторых заболеваний на основании оценки состояния системы ИФН.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработанный нами способ аппаратного учета результатов определения противовирусной активности препаратов интерферона повышает чувствительность и воспроизводимость методики.
-
Перевиваемая лимфобластоидная культура клеток Namalva является чувствительной стандартной моделью для изучения процессов образования интерферона в условиях in vitro. Обнаружено, что динамика и уровни продукции интерферона зависят от природы и доз индуктора.
-
Сформулированы критерии оценки интерферонового статуса больных, основанные на выявлении разных типов интерферона в сыворотке крови и анализе интенсивности образования a/fi- и у-интерферонов клетками периферической крови. Установлено, что характер изменений основных показателей интерферонового статуса связан с природой и клиническими формами заболеваний, а также с особенностями медикаментозного лечения.
Практическая значимость работы
Модифицированный метод количественного определения противовирусной активности ИФН, отличается не только высокой точностью и чувствительностью, но и возможностью автоматизировать учет результатов, а также позволяет увеличить объемы исследований, снижает трудозатраты на проведение анализа, дает воспроизводимые стандартные результаты. Метод может быть использован при производстве ИФН для контроля активности и качества выпускаемых препаратов, а также при скрининговых исследованиях индукторов образования интерферона различной химической природы. Метод апробирован и внедрен в работу лаборатории противовирусных препаратов и индукторов ИФН НИИ гриппа РАМН (С-Петербург).
Разработанный нами способ оценки ИФН статуса позволяет получать достаточно полную характеристику состояния системы ИФН. Информативность метода и сокращенные сроки получения результатов делают возможным использовать его в клинической практике. Обнаруженные нами закономерности изменений показателей ИФН
статуса и их связи с клинико-лабораторными параметрами оказались полезны для оценки состояния больных инфекционными, аутоиммунными и онкологическими заболеваниями в плане уточнения диагноза, выбора методов иммуномодулирующих воздействий, прогнозирования исходов заболевания. На способ определения активности ИФН и исследования ИФН статуса получен приоритет (заявка № 98105888 от 30.03.1999 г.).
Апробация работы
Основные положения диссертационного исследования были доложены на:
1.4-м национальном конгрессе "Человек и Лекарство". Москва. 1997.
2.ХХХШ-М международном конгрессе физиологических наук. С-Петербург. і 997.
3.8-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям. Лозанна. Швейцария. 1997.
4.9-м Азиатском конгрессе по неврологии. Сеул. Корея. 1996.
5.3-м национальном конгрессе "Человек и Лекарство". Москва. 1996. Разработанные методы апробированы и внедрены в работу:
1 .Лаборатории противовирусных препаратов и индукторов интерферона НИИ гриппа РАМН, С-Петербург.
2.Лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им. Отта РАМН, С-Петербург.
Публикации
По теме диссертационного исследования опубликована 21 печатная работа.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения и перечня цитированной литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 24 рисунками. Библиографический указатель включает 316 источников, из которых 84 отечественных и 232 иностранных авторов.
Биологические свойства интерферонов
Интерфероны (ИФН) впервые были выявлены как факторы, определяющие вирусную интерференцию [185], т.е. невосприимчивость биологической системы к повторному заражению. В рекомендациях ВОЗ в отношении ИФН принято следующее определение: "ИФН — это вещество белковой природы, обладающее противовирусной активностью, по крайней мере в гомологичных клетках, которая опосредована клеточными метаболическими процессами, включающими синтез РНК и белка" [287]. То есть, ИФНы являются группой белков различного происхождения, объединенных общим свойством — наличием противовирусной активности. Однако исследования последних лет показали, что кроме подавления репликации вирусов, ИФНы обладают и другими важными биологическими свойствами, такими как регуляция различных клеточных функций и активация защитных механизмов макроорганизма против инфекций [18; 180; 287].
По современным понятиям ИФНы представлены двумя основными классами (ИФН-І и ИФН-П), которые имеют некоторые общие биологические свойства, но различаются по молекулярной структуре. В таблице 1.1.1. приведены основные характеристики ИФН человека.
ИФНы 1-го класса имеют общее эволюционное происхождение, физико-химические свойства, сходную молекулярную структуру и могут действовать через одни и те же клеточные рецепторы. К ИФН-І относят ИФН-а, ИФН-[3, ИФН-ю и ИФН-т. Рассматриваемый сейчас как самостоятельный тип, ИФН-со ранее был описан как один из подтипов ИФН-а [116; 135]. ИФН-т, пока выявленный только у овец и крупного рогатого скота, структурно близок к остальным ИФН данного класса, но имеет ряд функциональных отличий (участвует в процессах имплантации оплодотворенной яйцеклетки, имеет менее выраженные противовирусные свойства и др.) [250; 287].
ИФНы 1-го класса кодируются генами одного семейства, локализованными в 9 хромосоме. Они обладают высокой степенью молекулярной гомологии: аминокислотная последовательность ИФН-а на 60% совпадает таковой у ИФН-ю и на 30% у ИФН-р\
Отличительной чертой генов ИФН-І является отсутствие интронов, а молекул ИФН-І — устойчивость в широком диапазоне температур (до 56С), рН (2.0-10.0) и к денатурирующим агентам (додецилсульфат Na и др.) [18; 74]. Основными природными индукторами ИФН-І является вирусная инфекция и двуспиральные РНК (дсРНК), которые образуются как промежуточные продукты в процессе репликации многих вирусов [137]. Продуцентами ИФН-І являются лейкоциты периферической крови (ИФН-а) и фибробласты (ИФН-р), хотя по последним данным, способностью продуцировать ИФН данного класса обладают практически все типы клеток [18; 128; 144; 240; 290].
К ИФНам П-го класса относится только ИФН-у. ИФН-у не имеет эволюционного родства и структурной гомологии с ИФН-І. Единственный ген ИФН-у локализован в 12 хромосоме и имеет три интрона и четыре экзона. Молекулы ИФН-у более лабильны, чем молекулы ИФН-І. Синтез ИФН-у стимулируют митогены. Основными продуцентами ИФН-у являются Т-лимфоциты и естественные киллеры [118; 124; 215; 284; 287; 309].
Все типы ИФН обладают антивирусной, противоопухолевой и иммуномодули-рующей активностью, что обусловлено как прямым действием ИФН на клетки-мишени, так и результатом их регуляторного воздействия на различные системы организма [164]. При этом, степень и характер проявления отдельных видов активности ИФН зависит как от типа ИФН, так и от клеток-мишеней, концентрации ИФН и прочих условий [18; 50; 74; 287]. Общей и характерной чертой любых типов ИФН является их противовирусная активность, проявляющаяся как in vivo, так и in vitro [18; 287].
Поскольку все ИФНы-1 обладают сходными биологическими и биохимическими свойствами, то в дальнейшем, при описании системы ИФН мы будем рассматривать этот класс ИФН как единую группу ИФН-а/р, не акцентируя внимания на отдельных типах (ИФН-а, ИФН-р и т.д.).
Особенности биологической активности ИФН делают их универсальными факторами неспецифической и специфической резистентности организма, что позволяет рассматривать их с позиций вирусологии, иммунологии и эндокринологии [18; 292].
Большинство клеток организма могут продуцировать ИФН-а/р. Уровень спонтанной продукции ИФН-а/р как в культуре клеток, так и in vivo, редко достигает значимых величин [18; 128; 267]. Общая фоновая концентрация ИФН всех типов в сыворотке крови здорового человека обычно составляет 0-4 МЕ/мл [18]. Присутствие ИФН в кровотоке обуславливает не только противовирусную защиту, но и в регуляцию других физиологических функций организма [18].
Основными индукторами ИФН-а/р являются природные и синтетические двуспи-ральные РНК (дсРНК) [18; 74; 137; 287]. Наибольшей эффективностью из синтетических полинуклеотидов отличается гомополимер polyl/polyC [18; 287].
Большинство вирусов животных также индуцируют синтез ИФН-а/р [18; 74]. В качестве промежуточных продуктов репликации РНК-содержащих и некоторых ДНК-содержащих вирусов образуются дсРНК, которые стимулируют образование ИФН-а/р [122; 235]. Считают, что для стимуляции выработки ИФН достаточно даже одной молекулы дсРНК [268].
Кроме вирусов и полинуклеотидов, индукторами ИФН-а/р могут служить и некоторые цитокины. Например интерлейкин-1 (IL-1) и фактор некроза опухоли (TNF-a) вызывают синтез ИФН-Р в культуре диплоидных фибробластов, а IL-2 стимулирует продукцию ИФН-a/p в культуре клеток костного мозга. В роли индуктора ИФН-а/р может выступать и ИФН-у [153; 179; 214; 244].
Наиболее полно изучены молекулярные механизмы индукции синтеза ИФН-а/р вирусами и дсРНК. Транскрипция генов ИФН-a/p начинается сразу после начала индукции и прекращается с достижением пика, несмотря на присутствие индуктора. Причины остановки процесса транскрипции пока не вьыснены. Возможно, это не связано с регуляторным действием самого ИФН по механизму отрицательной обратной связи, так как в некоторых опытах, присутствие высоких доз ИФН-a/p не снижало интенсивности образования ИФН при индукции polyl/polyC [129]. По-видимому подавление синтеза ИФН осуществляется через образование или активацию факторов, снижающих интенсивность продукции ИФН. В литературе описан репрессор продукции ИФН-а/В, действующий на уровне трансляции [11; 74; 263; 264; 266; 285]. Данный репрессор может не только тормозить образование ИФН после достижения пика, но и вызывать временную гипореактивность на повторное внесение индуктора. Экспрессия генов ИФН-сс/р и гена репрессора происходит параллельно. Образовавшийся репрессор связывает или инактивирует мРНК ИФН, вызывая в клетках состояние рефрактерности к повторной индукции ИФН гомологичным индуктором. Можно предположить, что данный репрессор представляет собой комплекс факторов, одним из которых может быть видоизмененная молекула ИФН-а или ИФН-В. При этом, факторы репрессии могут быть устранены аффинной хроматографией, и тогда нативные молекулы ИФН не вызывают репрессии собственного синтеза [18; 285].
Как правило, ИФН-а и ИФН-В образуются одновременно, поскольку имеют сходные механизмы индукции и вырабатываются одними и теми же клетками. Вместе с тем, возможна и раздельная индукция ИФН-а и ИФН-р. Она может быть вызвана как самостоятельной транскрипцией генов ИФН-а или ИФН-р, так и процессингом мРНК, а также сочетанием этих механизмов. Установлено, что регуляторные участки генов ИФН необходимы для нормальной продукции ИФН, так как после трансфекции клеток рекомбинантными молекулами РНК, содержащими только кодирующую последовательность ИФН-р, не наблюдали антивирусной активности при внесении индуктора [283]. Сравнительными исследованиями обнаружена существенные различия в структуре промоторов генов ИФН-а и ИФН-Р и соответствующих им регуляторов транскрипции [123; 160; 204; 263].
Например, ген ИФН-Р содержит не менее четырех доменов позитивной регуляции (PRD-I - PRD-IV) и два домена репрессии транскрипции (NRD-I, NRD-II) [133; 154; 199; 313]. Каждый из доменов способен связывать один или несколько регуляторных белков, с действием которых связано пре- и пост-индукционное торможение транскрипции гена ИФН-р [194; 287]. Экспрессия генов, кодирующих регуляторные белки, происходит в присутствие дсРНК, вирусов и некоторых цитокинов (TNF-a, IL-1, ИФН-р) [161; 228; 274]. Получены данные и о других белках и нуклеопротеидах, регулирующих деятельность генов ИФН [190]. Кроме того, на образование ИФН-a/p оказывают влияние пептидные гормоны, простагландини, глюкокортикоиды [89; 194].
Таким образом, продукция ИФН-a/p находится под многоуровневым контролем на стадии транскрипции, пост-транскрипционного процессинга и трансляции.
Существующие методы анализа активности интерферона и интерферонового статуса
В рамках данной работы рассматриваются методы определения биологической активности ИФН. Биологические методы основаны на определении активности ИФН в культурах клеток и тканей, что проявляется в виде противовирусного или антипроли-феративного действия ИФН.
Так как все типы ИФН обладают одним уникальным свойством — противовирусной активностью, большинство методов тестирования активности ИФН основано на полуколичественном определении этого фактора. Биологической системой служит культура клеток, чувствительная к действию ИФН и индикаторный вирус с коротким периодом репродукции. После контакта с серийными разведениями материала в клетки тест-культуры вносят индикаторный вирус. Оценку активности ИФН осуществляют на основании степени торможения репродукции вируса. Индикаторный вирус должен вызывать деструкцию или явные морфологические изменения в зараженных клетках. В некоторых случаях, когда используют нецитопатические агенты, интенсивность репродукции может быть определена другими (косвенными) методами.
Общая схема методики определения антивирусной активности включает в себя преинкубацию тест-культуры клеток в присутствии ИФН-содержащих проб, контакт клеток с тест-вирусом и учет результатов (оценку степени подавления репродукции тест-вируса). При этом, описано несколько методических вариантов постановки опыта.
Один из методов [15], предусматривает определение активности ИФН титрованием ИФН-содержащих проб на монослое культуры диплоидных фибробластов человека М-19 в микропланшетах, инкубацией проб в течение 24 часов с последующей заменой ИФН-содержащей культуральной среды на поддерживающую среду с тест-вирусом (вирус везикулярного стоматита либо вирус энцефаломиокардита). Заражающая доза составляла 10-100 ЦПДбо/лунку. Клетки М-19 инкубировали в присутствии тест-вируса 24 часа, после чего учитывали результаты прямой микроскопией микропланшетов с визуальным определением степени деструкции монослоя клеток М-19. Титром активности ИФН считали последнее разведение пробы, защищающее от ЦПД индикаторного вируса не менее 50% клеток в микрокультурах. Следует отметить универсальность описанной методики, так как в доступной литературе, с ее участием не только определяли антивирусную активность ИФН, но и исследовали другие показатели ИФН статуса (определяли сывороточный ИФН, типировали сывороточные ИФН, изучали уровень образования ИФН-ос/р и ИФН-у лейкоцитами крови в условиях in vitro).
Существует способ оценки противовирусной активности ИФН с учетом гемад-сорбции, вызываемой индикаторным вирусом (вирус Сендай) [2], модификация метода Finter, 1964 [138]. Данная методика предусматривала возможность аппаратного учета результатов опыта на основании фотометрического исследования лизатов сорбировавшихся на клетках эритроцитов.
Кроме приведенного, существуют и другие варианты метода. Например, с использованием клеток L-929, Нер2 или А-549 и вируса ЕМС [207], или клеток Л-41 и вируса VSV [29]. Описаны некоторые варианты способа учета степени подавления ЦПД индикаторного вируса [25; 113; 202]. Как и прототипный метод [15] они отличаются субъективностью способа учета результатов и поэтому не обладают высокой воспроизводимостью. Кроме того, эти методы требуют существенных затрат труда и времени при проведении исследований.
Данная группа методов основана на свойстве ИФН непосредственно ингибиро-вать рост и размножение клеток в культуре. Оценка активности ИФН проводится на основе угнетения метаболической активности клеток тест-культуры (ингибирование включения 3Н-тимидина) [50] или по подавлению формирования клеточного монослоя [29].
Данные методы отличаются высокой трудоемкостью, длительным сроком исполнения, низкой достоверностью и чувствительностью, что делает невозможным их использование в качестве основы для разработки поточной методики анализа.
Кроме определения противовирусной и антипролиферативной активности ИФН в эукариотических культурах клеток, описаны и другие методические подходы.
Например, при проведении исследований активности ИФН в промышленных препаратах лейкоцитарного ИФН [53] или в сыворотке и плазме крови [46], основанные на его бактериостатическое и бактерицидное действие в отношении культуры St. aureus. При этом подразумевалось, что подавление роста и лизис клеток микроорганизмов происходят непосредственно под действием ИФН. Однако последующие исследования показали, что ИФНы не обладают антибактериальной действием, а проявление этой активности обусловлено низкомолекулярной фракцией, которая присутствует в испытуемом материале [32; 33; 35]. По этой причине описанный метод не получил широкого распространения.
Разработан способ тестирования ИФН, сочетающий в себе биологический и им-мунохимический методы [7]. Его сущность заключается в сорбции антител против ИФН (ИФН-а или ИФН-у), которые связывают ИФН, присутствующий в пробах, вносимых в те же лунки. Затем в лунки вносится раствор конъюгата Р(аЬЛ)-фрагментов антител к ИФН с бактериофагом (фаг фх174). Последний связывается с молекулами ИФН благодаря конъюгированию с Р(аЬГ)-фрагментами, в результате чего образуется трех-компонентный "сэндвич" (антитела-ИФН-конъюгат), в котором количество связавшегося фага прямо пропорционально количеству ИФН в определяемом образце. Затем в лунки микропланшета вносится реагент восстанавливающий дисульфидные связи между фагом и Р(аЬА)-фрагментом, и высвобождающий фаг в раствор. Полученные растворы фага переносятся на индикаторные газоны Е. coli с помощью специального аппарата. Через 2,5-3 часа на индикаторных газонах появляются зоны лизиса из различного числа бляшек. Число бляшек соответствует количеству фага и содержанию ИФН в исследуемой пробе. Достоинствами данного метода являются высокая специфичность, быстрота исполнения (1-2 суток) и возможность использования автоматического фотометра для подсчета числа бляшек. Вместе с тем, стоит отметить, что данный метод позволяет определять не активность, а концентрацию ИФН. Потому метод используется сравнительно редко, так как предусматривает необходимость культивирования штамма фага и Е. coli, в то время как, получившие в последнее время широкое распространение тест-системы иммуноферментного и радиоиммунного анализа, обладают теми же достоинствами, но значительно удобнее при проведении лабораторных исследований. Они обладают высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов, темпами проведения анализа. Однако, далеко не всегда удается доказать четкие корреляционные связи между концентрацией и биологической активностью анализируемого фактора, что накладывает определенные ограничения на их использование.
Таким образом, существует несколько методических подходов к определению активности ИФН. Однако, при проведении массовых исследований ИФН статуса и скри-нингового изучения различных индукторов образования ИФН мы столкнулись с необходимостью повысить чувствительность, точность и воспроизводимость методики. Для этого, приняв в качестве прототипного метод Григорян С.С. [15] мы существенно модифицировали его, сохранив его общие принципы.
Поиск оптимальных методов исследования системы интерферона
Определение показателей ИФН статуса все более привлекает врачей, так как позволяет более объективно оценивать состояние больных, прогнозировать направление течения заболевания, подобрать наиболее эффективную схему лечения.
Отправным моментом работы послужила методика определения ИФН статуса, разработанная Григорян С.С. [15]. Наши исследования касались: повышения чувствительности методики; возможности автоматизировать процесс учета результатов; сокращение срока проведения исследований и расширения круга показателей, входящих в комплексную оценку ИФН статуса.
Базовый метод определения активности ИФН описан в разделе "Материалы и методы". В своих исследованиях мы провели поиск наиболее эффективных компонентов биологической тест-системы; подбор оптимальных условий для проведения этапов окраски/фиксации клеточного монослоя и измерения количества связавшегося в клетками красителя; изучения динамики развития цитопатического эффекта тест-вируса; исследование динамики развития антивирусного состояния клеток, индуцированного ИФН.
Основными биологическими компонентами тест-системы для определения активности ИФН биологическим методом являются культура клеток и штамм вируса. При этом, необходимо, чтобы клетки и вирус обладали не только высокой чувствительностью к действию ИФН, но и это их свойство как можно менее зависело от условий культивирования, пассажа, концентрации и т.д.
По данным литературы наиболее часто в качестве индикаторных вирусов использовали вирус везикулярного стоматита (VSV) или вирус мышиного энцефаломиокарди-та (ЕМС). Данные вирусные агенты обладают коротким циклом репродукции и вызывают отчетливые цитопатические изменения, которые проявляются для вируса ЕМС вакуолизацией цитоплазмы, сморщиванием и последующим разрушением клеток; а после заражения VSV — баллонирующей дегенерацией клеток, их отделением от поверхности субстрата и последующей деструкцией. Следует отметить, что учет цитопа-тических изменений под микроскопом может носить субъективный характер и не обладает высокой точностью. Для оценки результатов титрования вируса часто прибегают к фиксации и окраске клеток (т.н. тотальная окраска).
Мы провели сравнительную оценку характера ЦПД вирусов ЕМС и VSV в культуре клеток М-19. Для этого вирус ЕМС и VSV титровали над монослоем клеток М-19 в 96-луночных микропланшетах и инкубировали 24 часа при 37С. Определение степени развития ЦПД производили двумя способами:
— микроскопией монослоя клеток и оценкой числа выживших клеток;
— окрашиванием монослоя кристаллическим фиолетовым и определением коли чества связавшегося красителя (п. 3.1.1.2). Результаты опыта представлены на рис. 3.1.1.1.
Результаты опыта свидетельствуют, что оптическая плотность экстракта окрашенного монослоя соответствует реальному количеству выживших клеток только в случае использования VSV. При заражении вирусом ЕМС часть пораженных клеток оставалась связанной с полистироловой поверхностью, окрашивалась, и поэтому, после экстрагирования красителя величина экстинкции экстракта оказывалась несопоставимой со степенью развития ЦПД. Из этого можно сделать вывод, что для количественного фотометрического учета клеток, сохранившихся после заражения, в качестве индикаторного вируса целесообразно использовать VSV.
Известно, что противовирусное действие ИФН проявляется во многих клеточных культурах. Из них, наиболее чувствительными к ИФН являются диплоидные штаммы клеток фибробластного происхождения (например, клетки FS-4, М и др.). Вместе с тем, существует большое число перевиваемых клеточных линий, характеризующихся достаточно высокой чувствительностью к ИФН. Перевиваемые культуры клеток, в отличии от первичных и диплоидных, способны выдерживать неограниченное число пассажей, сохраняя при этом свои биологические характеристики. Поэтому, при создании биологической тест-системы, обеспечивающей максимальную стандартность условий определения активности ИФН, более перспективным представлялось использование перевиваемых культур клеток.
Для создания тест-системы для определения активности ИФН нами был апробирован ряд клеточных культур: перевиваемые линии Л-41 (клоновый вариант тканевой культуры J-96, полученной из костного мозга больного лимфомой), А-549 (карцинома легкого человека), Нер-2 (рак гортани человека) в сопоставлении с высокочувствительными к ИФН диплоидными фибробластами человека штамма М-19.
Чувствительность к VSV определяли стандартным методом вирусологического титрования: 2-суточный монослой клеток инкубировали в микропланшетах в присутствии серии 2-кратных разведений стандартного препарата VSV. Через 24 часа контакт клеток с вирусом прерывали, клеточный монослой фиксировали и окрашивали 0.1% раствором кристаллического фиолетового на 30% этаноле, после чего визуально определяли последнее разведение VSV, вызывающее 50% деструкцию монослоя клеток. Результаты опытов (каждая экспериментальная точка воспроизводилась в 10-ти повторах) приведены в таблице 3.1.1.1 -а.
Как видно из приведенных результатов, все культуры клеток проявили чувствительность к цитопатическому действию VSV, причем у перевиваемых клеточных линий она не изменялась в процессе пассирования.
Определение чувствительности клеточных линий к противовирусному действию ИФН проводили в опытах титрования стандартных препаратов человеческого ИФН-а и ИФН-у. После контакта с клетками серии 2-кратных разведений ИФН (100-50-25-12,5-6,3-3,1-1,6-0,8 МЕ/мл) в течение 18 часов при 37С, культуральную среду заменяли на ПС, содержащую 100 ЦПД50 VSV на одну лунку. Через 24 часа инкубации при 37С клетки фиксировали и окрашивали. Результаты определения антивирусной активности представлены в таблице 3.1.1.1-6. (каждая опытная точка исследовалась в 10-ти повторах).
Установлено, что 50%-е угнетение интенсивности ЦПД вируса VSV при наименьшей концентрации ИФНов (1.56 МЕ/мл) происходило в клетках М-19. Несколько менее чувствительными к антивирусному действию ИФНов оказались клетки линии Л-41 (3.13 МЕ/мл). Наименьшей чувствительностью к ИФН обладали клетки Нер-2 (6.25 МЕ/мл). Следует отметить, что это качество перевиваемых линий клеток не менялось в процессе пассирования. Клетки Л-41 и Нер-2 образовывали наиболее плотный монослой, интенсивность окрашивания которого существенно превосходила прокрашивае-мость сформированного пласта клеток А-549. Тем самым достигалась более высокая точность определения числа клеток при последующей фотометрии экстрактов клеточного монослоя. Клетки М-19 более прочно соединены друг с другом, поэтому при сильном встряхивании, изменении рН среды или касании микропипеткой дна лунки клеточный монослой отделялся от ростовой поверхности, и результаты опыта не поддавались учету.
Все эти факторы (высокая репродуктивность, чувствительность к ИФН и индикаторному вирусу, большая плотность и устойчивость монослоя) определили наш выбор за клетками Л-41 в качестве тест-культуры для изучения антивирусной активности ИФН.
Таким образом, по результатам проведенных опытов, в качестве биологической системы для определения ИФН была выбрана модель, включающая клетки линии Л-41 и вирус VSV.
В дальнейшей работе нами был создан банк клеток линии Л-41, сохраняющихся в условиях глубокого холода [55; 67]. Штамм VSV, адаптированный к клеткам Л-41 был лиофильно высушен и хранился при температуре -40С.
Для повышения объективности учета результатов цитопатического действия VSV в клетках линии Л-41 мы предложили экстрагировать краситель из микрокультур зараженных клеток и оценивать величину поглощения светового потока с помощью ридера для иммуноферментного анализа АИФ-Ц-01С.
Предварительно с помощью спектрофотометра СФ-56 изучали спектр поглощения раствора кристаллического фиолетового. Пики поглощения (рис. 3.1.1.2-а) наблюдали при длинах волн 204, 249, 304, 590 нм. Во всех дальнейших опытах оптическую плотность растворов кристаллического фиолетового измеряли при 590 нм.
Растворение окрашенного монослоя и экстрагирование красителя проводили тремя способами: добавлением 2% раствора додецилсульфата натрия (ДДС-Na) на 5% глицерине, 30%-м этанолом или дистиллированной водой. Экстрагирование проводили в течение 1 часа при 37С, внося в каждую лунку с микрокультурой клеток Л-41 по 150 мкл реагента. Сравнивали значения оптической плотности полученных растворов с долей сохранившихся в монослое клеток (рис. 3.1.1.2-6.).
Как видно из приведенных результатов, зависимость оптической плотности экстрактов от количества жизнеспособных клеток сохраняла линейный характер только при использовании в качестве растворителя ДДС-Na. В виду неполного растворения клеточного пласта 30%-м этанолом и дистиллированной водой отношение оптической плотности и доли интактных клеток не носило линейной закономерности. Характер кривой, в этом случае, не позволял точно определить количества интактных клеток при их содержании в микрокультуре менее 30-40% от исходного уровня. Потому в дальнейшей работе для экстрагирования красителя из клеток использовали ДДС-Na.
Для выбора оптимальной заражающей дозы индикаторного вируса исследована динамика развития ЦПД VSV в клетках Л-41. С этой целью 10-кратные разведения VSV вносили на монослой клеток Л-41. Контакт вируса с клетками прерывали через каждые 2 часа экспозиции, микрокультуры окрашивали и определяли долю сохранившихся клеток по п. 3.1.1.2.
В результате был получен ряд кривых развития цитопатического действия в клетках Л-41 в зависимости от заражающей дозы VSV (рис. З.1.1.З.).
Установлено, что кривая, описывающая динамику ЦПД VSV сохраняет свой характер вне зависимости от условий опыта, а сроки развития 50%-й деструкции клеточного монослоя определяются заражающей дозой VSV. С уменьшением заражающей дозы VSV в 10 раз, 50%-й цитопатический эффект наступает на 2-4 часа позже. Таким образом, изменяя заражающую дозу индикаторного вируса можно планировать сроки получения результатов опытов определения антивирусной активности ИФН.
Исследование интерферонового статуса больных с разными формами патологии
Основываясь на собственных методических разработках мы исследовали ИФН статус у более чем 3 000 человек с различными формами патологии, в лечении которых использовали препараты ИФН, индукторы ИФН и иммуномодуляторы других групп. Анализу были подвергнуты результаты исследования ИФН статуса больных с верифицированным диагнозом инфекционной (герпетическая инфекция, хламидиоз, вирусные гепатиты и др.), аутоиммунной (реактивный и ревматоидный артриты и др.) и онкологической патологии (лимфомы и др.).
Проблема вирусных гепатитов (ВГ) — одна из наиболее актуальных в современной медицине. Заболевание вызывается рядом гепатотропных вирусов и проявляется как в поражениях печени, так и внепеченочной патологией. В силу особенностей репродукции возбудителей, ВГ трудно поддаются излечению. В лечении ВГ применяются специальная диета, методы общей детоксикации, патогенетическая (поддерживающая) и этиотропная терапия (противовирусные препараты).
С помощью усовершенствованного метода оценки ИФН статуса мы исследовали состояние системы ИФН у больных острой и хронической формой вирусных гепатитов В, С, а также смешанных форм ВГ В и С. Результаты обследования представлены на рис. 3.3.1.1-а.
При разных формах ВГ В и С, состояние системы ИФН достоверно отличается от нормальных показателей ИФН статуса. Отмечено достоверное (р 0.05) повышение уровня сывороточного ИФН и снижение способности лейкоцитов продуцировать ИФН-а/р и ИФН-у. Обнаружены достоверные различия в состоянии системы ИФН при остром и хроническом характере течения ВГ В. Так, при острой форме ВГВ уровень сИФН был заметно выше, чем при хронической форме ВГВ (32.4±3.4 МЕ/мл против 21.6±2.0 МЕ/мл), а образование ИФН лейкоцитами было, напротив, ниже при остром ВГВ. Аналогичная картина отмечена для острой и хронической формы ВГ типа С (оВГС и хВГС соотв.). Не обнаружено достоверных различий в ИФН статусе при микст-форме хВГВ+хВГС от основных показателей системы ИФН при хВГВ и хВГС. В то же время, уровень продукции ИФН при микст-форме оВГВ+оВГС был достоверно ниже, чем при других вариантах течения ВГ.
Таким образом, состояние системы ИФН больных вирусными гепатитами достоверно отличается от ИФН статуса здоровых доноров и зависит от формы течения заболевания (острое или хроническое), но мало зависит от конкретной нозологической формы (тип В или С). При этом, способность лейкоцитов к продукции ИФН-а/р и ИФН-у достоверно ниже, а уровень сИФН достоверно выше при острых формах, чем при хронических. Это свидетельствует о том, что при острой вирусной патологии система ИФН реагирует гораздо более активно, чем при хронических формах инфекции, что проявляется в усиленном образовании различных типов ИФН, повышении уровня сИФН и последующем истощении резервов продукции ИФН лейкоцитами. При смешанной острой инфекции (оВГВ+оВГС) показатели ИФН статуса свидетельствуют о значительно более глубоком подавлении системы ИФН, что является проявлением снижения общей реактивности организма.
В свою очередь реактивность организма зависит от формы заболевания и репли-кативной активности возбудителя. Следовательно, с позиций анализа ИФН статуса, при выборе стратегии лечения вирусных гепатитов, решающее значение имеет не конкретная нозологическая форма (ВГВ или ВГС), а характер течения заболевания и тип реакции системы ИФН.
В рамках этих исследований, мы проводили изучение ИФН статуса в процессе лечения острого вирусного гепатита В (затяжное течение заболевания) препаратами ИФН (интрон-А, реальдирон). Препарат вводили подкожно через день по 3 млн. ME на прием в течение 55 дней. Отмечена положительная динамика показателей ИФН статуса у 15 больных с благоприятным течением заболевания в процессе лечения препаратами
При положительном терапевтическом эффекте препаратов ИФН отмечены выраженные тенденции к нормализации показателей ИФН статуса: через 1 месяц после завершения курса лечения уровень сИФН заметно снижался, а способность лейкоцитов к образованию ИФН-а/р и ИФН-у возрастала. При этом, показатели ИФН статуса адекватно отражали характер течения заболевания.
В процессе лечения изменения показателей ИФН статуса носили сложный характер и зависели от взаимодействия экзогенного ИФН и системы ИФН больного. Следует отметить, что уже через 24 часа после первого введения ИФН способность лейкоцитов образовывать ИФН-а/р и ИФН-у возрастала на 30-60%. Это могло быть связано с тем, что через 24 часа блокирующее действие высоких доз реальдирона или интрона-А на синтез эндогенного ИФН заканчивалось, а следовые количества экзогенного ИФН праймировали ИФН-образование клетками крови. Таким образом, лейкоциты оказывались способны создавать в кровотоке гораздо большие концентрации ИФН. Также показано, что подавление ИФН-образования при остром течении инфекционного процесса компенсируется введением экзогенных препаратов ИФН.
Изучено состояние системы ИФН у 19 больных с диагнозом острый вирусный гепатит С, в процессе лечения ретровиром (азидотимидином) по схеме: 6x200 мг в день в течение 3 недель. Исследование ИФН статуса производили до начала лечения, через 5-7 дней после последнего приема препарата и через 3 месяца после окончания лечения. При сопоставлении клинических показателей и динамики ИФН статуса наблюдаемых подразделили на 2 группы: больные с положительной динамикой течения заболевания (8 человек), и больные, не ответившие на курс лечения (11 человек). ИФН статус больных 1-й группы изначально характеризовался повышенным содержанием сИФН и снижением способности лейкоцитов к образованию ИФН-а/р и ИФН-у. К концу курса лечения и через 3 месяца по его завершении отмечено достоверное улучшение показателей ИФН статуса: снижение титров сИФН и рост потенций к образованию ИФН-а/р, ИФН-у. У больных 2-й группы не наблюдали положительных тенденций в динамике ИФН статуса (рис. 3.3.1.1-в).
Таким образом, исследование ИФН статуса может служить прогностическим критерием при оценке эффективности лечения больных ВГС. При этом, наиболее информативным показателем является усиление интенсивности образования лейкоцитами ИФН-сс/р и ИФН-у.
Уже к концу курса лечения наблюдали достоверную тенденцию к нормализации ИФН статуса по сравнению с исходным уровнем: снижались титры сИФН и возрастала способность к образованию лейкоцитами ИФН-а/р и ИФН-у. Через 1 и 3 месяца после окончания курса лечения амиксином тенденции сохранялась положительная динамика ИФН статуса: уровень сИФН продолжал снижаться, способность клеток к индуцированной продукции ИФН-а/р и ИФН-у возрастала. Положительная динамика ИФН статуса коррелировала с улучшением клинического состояния больных и нормализацией клинико-лабораторных показателей (рис. 3.3.1.1-д.).
Таким образом, при достаточной способности лейкоцитов к образованию ИФН индукторы ИФН (амиксин) могут быть эффективны при лечении больных с острой формой ВГВ.
Нейроборрелиоз (НБ) является хроническим инфекционным заболеванием человека, сопровождающимся поражением нервной системы и прогрессирующей демиели-низацией. В лечении НБ традиционно применяют методы этиотропной терапии (антибиотики) в сочетании с иммунокоррекцией.
Нами был исследован ИФН статус у 67 пациентов с подтвержденным диагнозом НБ. В результате детального неврологического обследования больные были подразделены на 3 группы: 1 группа (20 человек) — больные с преимущественным поражением центральной нервной системы и длительностью заболевания 4-6 месяцев; 2 группа — то же, но с длительностью заболевания более 2 лет (21 человек); 3 группа (26 человек) — больные с преимущественным поражением периферической нервной системы. Больным назначали индуктор ИФН (циклоферон) внутримышечно по 250 мг на 1, 2, 4, 6, 8 дни. Оценку ИФН статуса проводили до курса циклоферона и через 7-10 дней после его окончания. Динамика показателей ИФН статуса приведена на рис. 3.3.1.2.
