Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Каскад цитокинов при иммунном ответе 11
Глава 2. Роль различных клеток иммунной системы при вирусной 14
инфекции
Глава 3. Клеточные и молекулярные механизмы взаимодействия 17
вируса гриппа с клетками иммунной системы
-
Цитокины при гриппозной инфекции 20
-
Препараты, применяемые для профилактики и терапии 23 гриппа
-
Вакцины, применяемые для профилактики гриппа 23
-
Препараты, применяемые для профилактики и лечения 25 гриппа
Глава 4. Влияние полипренолов на организм. Фоспренил 28
4.1. Физико-химические свойства полипренолов 28
4.2. Образование в клетке полипренолов и их биологическая 31
роль
4.3. Распознавание полиизопренольных гликолипидов в орга- 34
низме
-
Описание противовирусного препарата фоспренил 37
-
Иммунобиологические свойства полипренил фосфата на- 37
трия (фоспренила) и подобных ему соединений
ЗАКЛЮЧЕНИЕ К ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 41
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВНИЯ 42
Глава 5. Материалы и методы 42
\) Животные 42
-
Клеточные линии 42
-
Вирусы 42
-
Фоспренил 43
-
Получение клеток 43
-
Поддержание L-929 44
-
Получение сыворотки крови 44
-
Цитотоксическая активность клеток 44
-
Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) 45
-
Получение КонА бластов 46
-
Определение ИЛ-2 46
-
Функциональная оценка экспрессии рецепторов к ИЛ-2... 47
-
Определение продукции ИЛ-1 47
14) Определение цитокинов (ИЛ-4, 5,6,10,12,) в супернатан- 47
max и в сыворотке крови мышей методом ИФА
-
Реакция агглютинации лимфобластов в капиллярах с ан- 48 тителами к CD25
-
Определение ФНОа 49
-
Определение ИФНу. 49
18) Статистическая обработка результатов 50
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 52
Глава 6. Изменение в присутствии фоспренила активации сплено- 52
цитов КонА
-
Влияние фоспренила на активацию спленоцитов КонА.... 52
-
Влияние фоспренила на взаимодействие рецепторов с 54
КонА
4
Глава 7. Влияние фоспренила на продукцию цитокинов клетками 56
селезенки под действием КонА
7.1. Ответ КонА бластов на супернатанты, полученные в при- 56
сутствии КонА и фоспренила
7.2. Изменение продукции цитокинов под действием разных 57
доз фоспренила in vitro
Глава 8. Влияние фоспренила на рецепторы для цитоки- 59
нов
8.1. Влияние фоспренила на взаимодействие ИЛ-1 с рецепто- 59
-
Влияние фоспренила на систему ИЛ-2 60
-
Влияние фоспренила на взаимодействие ИЛ-2 с рецепто- 61
8.4. Ответ на ИЛ-2 культур КонА бластов, полученных с до- 64
бавлением и без добавления фоспренила
Глава 9. Влияние фоспренила на образование цитокинов ex vivo и 66
in vivo
-
Влияние фоспренила на способность клеток спонтанно и 66 под действием КонА вырабатывать фактор с активностью ИЛ-1 (ex vivo)
-
Продукция цитокинов под действием фоспренила in vivo.. 67
9.3. Влияние фоспренила на продукцию ФНОос 68
Глава 10. Влияние фоспренила на активность естественных кил- 70
леров(ЕК)
10.1. Определение активности ЕК клеток после инкубации 70
клеток селезенки с фоспренилом (in vitro)
-
Определение активности ЕК у мышей после введения 71 фоспренила
-
Влияние индометацина на активность ЕК 73
5 Глава 11. Влияние фоспренила на течение гриппозной инфекции у 75
мышей
11.1. Изучение защитного эффекта фоспренила при экспери- 75
ментальной гриппозной инфекции у мышей
11.2. Определение активности ЕК клеток при заражении мы- 78
шей вирусом гриппа
11.3 Влияние фоспренила на продукцию ИЛ-1 у мышей ин- 80
фицированных вирусом гриппа
11.3.1. Спонтанная продукция ИЛ-1-подобного фактора 80
спленоцитами мышей
11.3.2. Влияние фоспренила на продукцию ИЛ-1-подобного 82
фактора в присутствии КонА спленоцитами мышей,
инфицированных гриппом
11.4. Влияния фоспренила на продукцию ИЛ-2 у мышей 84
* инфицированных гриппом
11.4.1. Спонтанная продукция ИЛ-2 спленоцитами мышей, 85
инфицированными вирусом гриппа с фоспренилом и без
него
11.4.2. Влияние фоспренила на индуцированную КонА продук- 85
цию цитокинов спленоцитами мышей, зараженных ви
русом гриппа
11.5. Определение продукции ФНОсс в сыворотке крови мы- 86
шей, инфицированных вирусом гриппа с фоспренилом
и без него
11.6. Влияние фоспренила на спонтанную продукцию ИФНу 88
t спленоцитами мышей, зараженных вирусом гриппа...
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 90
ВЫВОДЫ 101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 102
список СОКРАЩЕНРЇЙ
аММ - а -метилманно пиранозид t
АПК - антиген презентирующая клетка
АКТГ - адренокортико тропный гормон
ВИРТ - вирус инфекционного ринотрахеита
ВКЭ - вирус клещевого энцефалита
ВС - вирус Сендай
ДТП - дегидрогептапренол
ЕК - естественные киллеры
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ИЛ 1-18 - интерлейкины
ИФН (а,Р,у) - интерфероны
ИЦ - индекс цитотоксичности
» КМ - клетки мишени
КЭ - клетки эффекторы
КонА - конканавалин А
ЛОХ - липооксигеназа
СК - среда культивирования
СХУ- синдром хронической усталости
СЦ - среда центрифугирования
ПАВ - поверхностно активные вещества
ПГЕ2 - простагландин Е2
РБТЛ - реакция бласттрансформация лимфоцитов
РНК - рибонуклеиновая кислота
. ТКР - Т клеточный рецептор
ФГА - фитогемаглютинин
ФНО - фактор некроза опухоли
ЦОГ - циклооксигеназа
ЦТЛ - цитотоксический лимфоцит
ЭР - эндоплазматический ретикулум t
ЭК — эффекторная клетка
ЕРР - этилпирофосфат НА - гемагглютинин NA - нейраминидаза
Введение к работе
Фоспренил - новейший противовирусный препарат, применяемый в настоящее время, в ветеринарии при лечении таких заболеваний как: чума плотоядных, инфекционный гепатит собак, ринотрахеит, инфекционный перитонит кошек др. Экспериментально доказано, что он эффективен при вирусных заболеваниях человека - а именно при гепатитах, гриппе, клещевом энцефалите, ВИЧ-инфекции и др. (23,24,124) Основным действующим началом фоспренила - является полипренилфосфат натрия. Полипренолы и их производные синтезируются в клетке и играют важную роль в процессе гликозилирования белков, а так же они являются интегральными компонентами для биологических мембран и влияют на многие свойства последних (9,127).
На основании результатов, полученных при проведении доклинических исследований препарата, можно заключить, что фоспренил обладает прямой противовирусной активностью против целого ряда ДНК- и РНК-содержащих вирусов (32,125,131). Одним из таких вирусов является вирус гриппа (124). Грипп, до сих пор, является наиболее массовым инфекционным заболеванием, неподдающимся ни эффективной профилактике, ни этиалотропной терапии, главным образом из-за высокой изменчивости антигенной структуры вируса и недостаточной эффективности применяемых средств лечения (14). Несмотря на постоянный поиск лекарственных средств в практике современной медицины и ветеринарии используется сравнительно небольшой набор препаратов, обладающих широким спектром антивирусного действия (14,35). Это связано с целым рядом обстоятельств, наиболее существенные из которых: токсичность, аллергенность или другими побочными эффектами для организма животных и человека. В связи с этим наибольший интерес вызывает поиск и внедрение в практику иммуномодуляторов естественного происхождения, соответствующих требованиям, перечисленных выше.
В настоящее время исследования механизмов действия фоспренила далеки от завершения. Получены первые результаты, позволяющие говорить о том, что механизмы антивирусного действия препарата имеют двоякую природу. Предполагается, что он влияет на сборку или на взаимодействие вирусной частицы с рецепторами клетки мишени, в результате чего инфекция либо не развивается, либо формируются дефектные частицы. Другой механизм противовирусного действия фоспренила может быть связан с его способностью повышать естественную резистентность организма. Установлено, что фоспренил активирует макрофаги, вызывает выработку ИФН у, ФНОа (32,125,131). Однако этот механизм мало изучен и поэтому
Цель работы: изучение влияния фоспренила на некоторые показатели иммунитета в норме и при гриппозной инфекции у экспериментальных животных.
Для выполнения заданной цели были поставлены следующие задачи
Изучить влияние фоспренила на пролиферативную активность клеток лимфоидной системы мышей.
Определить влияние фоспренила на продукцию цитокинов in vivo и in vitro и оценить экспрессию рецепторов к ним.
Исследовать воздействие фоспренила на активность естественных кил-лерных клеток селезенки (ЕКК) мышей in vivo и in vitro.
Сравнить изменения в иммунной системе, вызванные фоспренилом, в условиях нормы у интактных животных и при экспериментальной гриппозной инфекции у мышей.
Научная новизна исследования.
Впервые установлено, что фоспренил не оказывает митогенного действия на лимфоциты селезенки мышей, но подавляет их пролиферацию,
10 вызванную КонА, а также снижает экспрессию рецепторного комплекса к
ИЛ-2.
Впервые получены данные о том, что введение фоспренила экспериментальным животным кратковременно повышает активность ЕКК селезенок мышей, а затем снижает ее ниже исходного уровня через сутки после введения препарата, при этом снижение активности ЕК связано с повышением активности циклооксигеназы.
Впервые показано, что добавление фоспренила в культуру клеток селезенки снижает продукцию ИЛ-2 и ИЛ-10, вызываемую КонА, тогда как введение фоспренила экспериментальным животным стимулирует продукцию ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-12 и ФНОос, но не вызывает продукции ИЛ-2 и ИЛ-10.
Разработана экспериментальная схема профилактики гриппа с помощью фоспренила. Впервые показано, что фоспренил оказывает выраженный протективный эффект при интраназальном заражении вирусом гриппа А (штамм Aichi/2/68) экспериментальных животных.
Полученные данные могут быть использованы в разработке нового профилактического противогриппозного средства, обладающего прямым противовирусным и иммуномодулирующим действием.
